響應(yīng)面法優(yōu)化鎖陽(yáng)水提取物提取工藝

王 玉 梅 喬 紅 艷 王 勤* 宋 玉 霞

（1.河西學(xué)院，甘肅 張掖 734000；2.蘭州祥靈醫(yī)藥有限公司，甘肅 蘭州 730100）

鎖陽(yáng)是鎖陽(yáng)科（Cynomoriaceae）植物鎖陽(yáng)Cynomorium songaricum Rupr.的干燥肉質(zhì)莖，俗稱“不老藥”，又名鐵棒槌、銹鐵棒、地毛球、羊鎖不拉、烏蘭高腰（蒙語(yǔ)），生長(zhǎng)于土地缺乏有機(jī)質(zhì)而富含鹽分的干燥多沙地帶，多寄生于蒺藜科Zygophyllaceae 白刺屬Nityaria L.植物根部，為全寄生種子植物［1-2］，是河西走廊的道地藥材之一［3-5］.具有補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血、潤(rùn)腸通便的作用，臨床上主要用于腰膝痿軟、陽(yáng)痿精滑、腸燥便秘等癥［6］.鎖陽(yáng)含有多種化學(xué)成分，如三萜類、甾體類、黃酮類、有機(jī)酸類及鞣質(zhì)等［7-9］.沒食子酸和原兒茶酸屬于有機(jī)酸類，其中沒食子酸具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤的作用；原兒茶酸具有增加冠脈流量、降低心肌耗氧量的作用［10-12］.水煎煮法是中藥傳統(tǒng)的煎煮方法，近年來(lái)已有學(xué)者對(duì)鎖陽(yáng)中某類化學(xué)成分的提取工藝進(jìn)行了研究，對(duì)于鎖陽(yáng)水提取物的研究也多是對(duì)其藥效的評(píng)價(jià)，尚未見對(duì)其提取工藝的研究，故本試驗(yàn)以鎖陽(yáng)水提取物中沒食子酸和原兒茶酸含量為響應(yīng)值，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化鎖陽(yáng)水提取物提取工藝［13-16］，以期為鎖陽(yáng)的資源開發(fā)利用提供參考.

1 儀器與試劑

1.1 材料與試劑

鎖陽(yáng)，采自甘肅張掖臨澤縣，并經(jīng)河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院王勤教授鑒定；對(duì)照品沒食子酸（按含量90.1%計(jì)，批號(hào)110831-200803）、原兒茶酸（按含量97.9%計(jì)，批號(hào)110809-200102）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、磷酸為色譜純；水為怡寶純凈水.

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A 高效液相色譜儀，日本島津公司，配置包括SPD-20AV 檢測(cè)器、SIL-20AC 自動(dòng)進(jìn)樣器、LC-20AD四元梯度泵、COT-20AC柱溫箱及色譜工作站；KQ-500E型超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；電子天平FA2004，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；HK-10B型500g搖擺式粉碎機(jī)，廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；PT-124/85S 電子天平，福州華志科學(xué)儀器有限公司；202-0 型電熱恒溫干燥箱，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市東城新銳儀器廠.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

圖1 對(duì)照品色譜峰

圖2 鎖陽(yáng)樣品色譜峰

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

色譜柱：Hypersil ODS C18柱（250mm×4.6mm，2.5μm），流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B）梯度洗脫，洗脫程序見表1，流速：1.0mL/min，柱溫：35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm，進(jìn)樣量：10μL.沒食子酸、原兒茶酸對(duì)照品和樣品溶液HPLC色譜峰見圖1、圖2.

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸對(duì)照品6.27mg，于5mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，超聲處理10min，作為沒食子酸對(duì)照品貯備溶液；精密稱取原兒茶酸對(duì)照品5.47mg，于5mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，超聲處理10min，作為原兒茶酸對(duì)照品貯備溶液；分別精密量取沒食子酸對(duì)照品貯備溶液3mL和原兒茶酸對(duì)照品貯備溶液1mL，于50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，超聲處理10min，制成每1mL分別含沒食子酸75.24μg，原兒茶酸23.48μg的混合對(duì)照品溶液.4℃貯藏，備用.

2.3 供試品溶液的制備

取鎖陽(yáng)粉末約1.0g，（過(guò)二號(hào)篩），精密稱定，置100mL 錐形瓶中，精密加入水30mL，回流提取2次，每次60min，合并提取液.精密量取上述水提液20mL，水浴濃縮至約5mL，轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，即得.

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液2，6，10，14，18μL進(jìn)樣.按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別以沒食子酸、原兒茶酸色譜峰峰面積（A）對(duì)進(jìn)樣量（X/μg）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.得到?jīng)]食子酸回歸方程：y=2826954.74x-6745.35，R2=0.9999，進(jìn)樣量為2-18μL 時(shí)線性范圍為0.15-1.35 μg；原兒茶酸回歸方程：y=3392985.52x+1790.60，R2=0.9999，進(jìn)樣量為2-18μL 時(shí)線性范圍為0.04-0.42μg.

2.5 單因素試驗(yàn)及結(jié)果

2.5.1 提取時(shí)間對(duì)鎖陽(yáng)水提取物中沒食子酸、原兒茶酸提取效果的影響

固定液料比30∶1（mL/g）、提取次數(shù)2次，考察提取時(shí)間為30min、45min、60min、90min對(duì)鎖陽(yáng)水提取物中沒食子酸、原兒茶酸提取效果的影響，結(jié)果見圖3.試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，沒食子酸，原兒茶酸含量隨著提取時(shí)間的增加而增加，當(dāng)提取時(shí)間為45min時(shí)，含量達(dá)到最大值，繼續(xù)增加提取時(shí)間，含量變化不大，從節(jié)約能源、縮短生產(chǎn)周期等方面綜合考慮，選定提取時(shí)間45min為最優(yōu)提取時(shí)間.

圖3 提取時(shí)間對(duì)鎖陽(yáng)水提物中沒食子酸和原兒茶酸提取效果的影響

2.5.2 提取次數(shù)對(duì)鎖陽(yáng)水提取物中沒食子酸、原兒茶酸提取效果的影響

固定液料比30：1（mL/g）、提取時(shí)間45min，考察提取次數(shù)為1次、2次、3次對(duì)鎖陽(yáng)水提取物中沒食子酸、原兒茶酸提取效果的影響，結(jié)果見圖4.試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，沒食子酸，原兒茶酸含量隨著提取次數(shù)的增加而增加，當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí)，含量達(dá)到最大值，繼續(xù)增加提取次數(shù)，含量變化不大，從節(jié)約能源、縮短生產(chǎn)周期等方面綜合考慮，選定提取次數(shù)2次作為最優(yōu)提取次數(shù).

圖4 提取次數(shù)對(duì)鎖陽(yáng)水提物中沒食子酸和原兒茶酸提取效果的影響

2.5.3 液料比對(duì)鎖陽(yáng)水提取物中沒食子酸、原兒茶酸提取效果的影響

固定提取時(shí)間45min、提取次數(shù)2次，考察液料比為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1對(duì)鎖陽(yáng)水提取物中沒食子酸、原兒茶酸提取效果的影響，結(jié)果見圖5.試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，沒食子酸，原兒茶酸含量在液料比30：1時(shí)達(dá)到最大值，隨著液料比的增加含量開始降低，可能是可溶性物質(zhì)溶出太多，造成雜質(zhì)含量增加.綜合考慮提取液總量與提取效率等方面的因素，選定30∶1作為最優(yōu)液料比.

圖5 液料比對(duì)鎖陽(yáng)水提物中沒食子酸和原兒茶酸提取效果的影響

2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)及結(jié)果

2.6.1 響應(yīng)面分析因素與水平的選取

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取時(shí)間、提取次數(shù)、液料比3個(gè)主要因素，運(yùn)用Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行試驗(yàn)，并利用響應(yīng)面法對(duì)鎖陽(yáng)水提取物提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用Design-Ex?pert10.0.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與回歸分析.試驗(yàn)因素和水平見表2.

2.6.2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

根據(jù)Box-Behnken 的組合設(shè)計(jì)原理，采用Design-Expert10.0.1 軟件設(shè)計(jì)3 因素3 水平共15 個(gè)試驗(yàn)，其中中心點(diǎn)重復(fù)5次試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3.

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

表3 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

2.6.3 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

采用Design-Expert10.0.1 軟件對(duì)表3 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合并對(duì)響應(yīng)面進(jìn)行方差分析.對(duì)沒食子酸，分析結(jié)果見表4，回歸模型P小于0.01，說(shuō)明模型極顯著.回歸方程為沒食子酸含量（P1）=0.98+0.024A+0.089B+0.029C-8.250×10-3AB-0.039AC+0.076BC-0.15A2-0.26B2-0.15C2，相關(guān)系數(shù)R2=0.9100，回歸方程顯著.對(duì)原兒茶酸，分析結(jié)果見表5，回歸模型P小于0.01，說(shuō)明模型極顯著.回歸方程為原兒茶酸含量（P2）=0.18+3.125×10-3A+0.035B+5.750×10-3C+8.250×10-3AB-0.015AC+0.014BC-0.019A2-0.057B2-0.031C2，相關(guān)系數(shù)R2=0.9010，回歸方程顯著.由分析結(jié)果可知，回歸方程可較好地描述各因素與沒食子酸、原兒茶酸含量之間的真實(shí)關(guān)系，可利用該回歸方程確定3個(gè)參數(shù)的最佳水平.

表4 響應(yīng)面方差分析-沒食子酸

表5 響應(yīng)面方差分析-原兒茶酸

2.6.4 響應(yīng)面圖分析

響應(yīng)面曲面可較直觀地反映各因素及兩兩因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響.鎖陽(yáng)水提取物中沒食子酸、原兒茶酸提取響應(yīng)面3D圖譜及等高線見圖6至圖11.由響應(yīng)面圖判斷，響應(yīng)面的開口向下，且隨著各因素的增大，響應(yīng)值也增大，當(dāng)響應(yīng)值增大到最大值后，隨著因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小.等高線圖同一曲線上沒食子酸、原兒茶酸得率相同，圖形中心得率最高.兩因素之間交互作用可以直觀地通過(guò)中心區(qū)域的等值線圓形程度和位置來(lái)判斷，等高線圓形形狀越扁，且越偏離中心位置交互作用越大，對(duì)沒食子酸、原兒茶酸得率的影響越顯著.

圖6 提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)沒食子酸含量影響的響應(yīng)面立體圖和等高線圖

圖6、圖7 分別是提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)鎖陽(yáng)水提取物中沒食子酸、原兒茶酸含量影響的響應(yīng)面圖.保持提取次數(shù)為一定值時(shí)，沒食子酸、原兒茶酸含量隨著提取時(shí)間的增加而升高，達(dá)到峰值以后又逐漸降低；保持提取時(shí)間為一定值時(shí)，隨著提取次數(shù)的增加，沒食子酸、原兒茶酸含量也是先升高后降低.等高線圖呈扁圓形，表明提取時(shí)間和提取次數(shù)兩個(gè)因素間具有較強(qiáng)的交互作用.

圖8、圖9 分別是提取次數(shù)和液料比對(duì)鎖陽(yáng)水提取物中沒食子酸、原兒茶酸含量影響的響應(yīng)面圖.保持提取次數(shù)為一定值時(shí)，沒食子酸、原兒茶酸含量隨著液料比的增加而升高，達(dá)到峰值以后又快速降低；保持液料比為一定值時(shí)，隨著提取次數(shù)的增加，沒食子酸、原兒茶酸含量也是先升高后降低.等高線圖呈扁圓形，表明提取次數(shù)和液料比兩個(gè)因素間具有較強(qiáng)的交互作用.

圖7 提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)原兒茶酸含量影響的響應(yīng)面立體圖和等高線圖

圖8 提取次數(shù)和液料比對(duì)沒食子酸含量影響的響應(yīng)面立體圖和等高線圖

圖9 提取次數(shù)和液料比對(duì)原兒茶酸含量影響的響應(yīng)面立體圖和等高線圖

圖10、圖11 分別是提取時(shí)間和液料比對(duì)鎖陽(yáng)水提取物中沒食子酸、原兒茶酸含量影響的響應(yīng)面圖.隨著提取時(shí)間和料液比的增加，沒食子酸、原兒茶酸含量也是先升高到最大值，隨后又下降，表明提取時(shí)間和液料比對(duì)沒食子酸和原兒茶酸含量的影響也是比較大的.但是等高線圖略呈扁圓形，表明提取時(shí)間和液料比兩個(gè)因素間的交互作用較弱.

圖10 提取時(shí)間和液料比對(duì)沒食子酸含量影響的響應(yīng)面立體圖和等高線圖

圖11 提取時(shí)間和液料比對(duì)原兒茶酸含量影響的響應(yīng)面立體圖和等高線圖

通過(guò)對(duì)回歸方程微分求解，所得的鎖陽(yáng)水提取物中沒食子酸、原兒茶酸提取最優(yōu)工藝參數(shù)為：提取時(shí)間45.86min、液料比31.35mL/g、提取次數(shù)2.19次，此條件下，沒食子酸和原兒茶酸提取量的預(yù)測(cè)值分別為0.992mg/g、0.189mg/g.由表4和表5還可以看出，影響鎖陽(yáng)水提取物中沒食子酸、原兒茶酸含量的各因素按照影響大小排序依次為提取次數(shù)＞液料比＞提取時(shí)間，其中提取次數(shù)的影響最大.

2.7 驗(yàn)證性試驗(yàn)

為了檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果與真實(shí)情況是否相一致，根據(jù)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證性試驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作的可行性，將工藝條件修改為：提取時(shí)間45min、液料比30∶1（mL/g）、提取次數(shù)2次.在此條件下進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，得到?jīng)]食子酸平均含量0.986mg/g，與預(yù)測(cè)得率的相對(duì)誤差為0.61%；原兒茶酸平均含量0.185mg/g，與預(yù)測(cè)得率的相對(duì)誤差為2.70%.證明模型理論預(yù)測(cè)值與實(shí)際值擬合效果良好，優(yōu)化結(jié)果可靠.

3 結(jié)論

響應(yīng)面法是集統(tǒng)計(jì)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和數(shù)學(xué)建模于一身的統(tǒng)計(jì)和優(yōu)化方法，其具有較高的試驗(yàn)精確度、并能明顯減少試驗(yàn)次數(shù)，且建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性較好，能夠反映各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系［13］.響應(yīng)面法雖然廣泛用于中藥提取工藝的優(yōu)化，但關(guān)于鎖陽(yáng)水提取物提取工藝的優(yōu)化鮮見報(bào)道.本研究采用水回流提取法，以鎖陽(yáng)水提取物中沒食子酸和原兒茶酸含量為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化鎖陽(yáng)水提取物提取工藝.單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，提取時(shí)間、提取次數(shù)、液料比對(duì)鎖陽(yáng)水提取物中沒食子酸、原兒茶酸含量的影響作用都比較明顯.在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，建立了3 因素3 水平的Box-Behnken 響應(yīng)面分析方法，對(duì)鎖陽(yáng)水提取物提取工藝進(jìn)行優(yōu)化以及驗(yàn)證.結(jié)果表明，各因素對(duì)鎖陽(yáng)水提取物中沒食子酸、原兒茶酸含量的影響大小順序?yàn)椋禾崛〈螖?shù)＞液料比＞提取時(shí)間.優(yōu)化的提取工藝條件為：液料比30∶1（mL/g）、提取時(shí)間45 min、提取次數(shù)2 次. 沒食子酸含量實(shí)測(cè)值0.986mg/g，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.61%；原兒茶酸含量實(shí)測(cè)值0.185mg/g，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為2.70%.因此，本試驗(yàn)建立的二次多項(xiàng)回歸方程模型能夠較好地預(yù)測(cè)各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，能夠?yàn)殒i陽(yáng)的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ).