基于整合藥理學平臺探討三七治療冠心病心絞痛的分子機制

李曉輝 成光宇 崔俊峰 劉愛東

(1長春中醫(yī)藥大學，吉林 長春 130117；2長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院；3長春中醫(yī)藥大學附屬第三臨床醫(yī)院)

冠心病心絞痛是指因冠狀動脈供血不足，心肌急劇、短暫缺血缺氧所致的，以胸痛為主要特點的臨床綜合征。心絞痛常因于慢性心功能不全，導致心肌收縮力下降而致。如果患者長期處于心絞痛發(fā)病狀態(tài)，亦會增加心肌負荷，推進病情進展，嚴重時危及生命〔1〕。在中醫(yī)學中沒有冠心病心絞痛的記載，但《靈樞·厥病》曰：“真心痛，手足青至節(jié)，心痛甚，旦發(fā)夕死，夕發(fā)旦死”，“厥心痛，與背相控，善瘛，如從后觸其心……痛如以錐針刺其心……臥若徒居，心痛間，動作痛益甚”。從文字描述來看，“真心痛”“厥心痛”的臨床表現(xiàn)已經(jīng)非常接近現(xiàn)代醫(yī)學的冠心病心絞痛的臨床癥狀了。中醫(yī)藥在治療疾病過程中，以辨證論治為原則，以病因病機為基礎，對病變進行整體治療，多層次、多環(huán)節(jié)、多靶點、多效應的干預病變，療效和安全性都有卓越的表現(xiàn)。所以中醫(yī)藥尤其在治療穩(wěn)定型心絞痛方面具有較大的價值。三七首見于《本草綱目》，“主止血散血定痛，能治一切血病”。三七，又稱山漆、金不換，性溫，味甘、微苦，歸肝、心、胃、大腸經(jīng)。三七為傳統(tǒng)活血化瘀第一圣藥。《本草綱目拾遺》記載：“人參補氣第一，三七補血第一，味同而功亦等，故稱人參三七，為中藥之最珍貴者”?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)三七可抗血小板聚集、溶栓，降低血壓及減慢心率，還可降低心肌耗氧量和氧利用率等〔2〕。在《藥食同源目錄》中將三七歸為保健食品。目前人們保健意識越來越強，隨著心血管疾病發(fā)病率的增加，越來越多的人選擇三七粉作為防治心血管疾病的保健食品食用。有研究指出三七具有抗心肌缺血、抑制心肌收縮力、抗心律失常等作用，還能較好緩解冠心病引起的心絞痛等癥狀〔3〕。本文通過中醫(yī)藥整合藥理研究平臺對三七治療冠心病心絞痛的分子機制進行研究及分析，以揭示其新的研究方向。

1 數(shù)據(jù)來源與分析方法

1.1三七化學成分來源 在中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺v2.0(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/)“中藥材數(shù)據(jù)庫”，數(shù)據(jù)庫依據(jù)2015年版《中國藥典》共收錄402味藥材，輸入“三七”即可生成三七的化學成分數(shù)據(jù)庫。

1.2候選靶標預測 在TCMIP平臺中“整合藥理學分析工具”采取通過化學成分二維結(jié)構(gòu)相似性搜索，即采用MACCS分子指紋特征提取方法和Tanimoto系數(shù)定義的相似度計量方法，針對中藥化學成分和FDA上市藥物進行相似性打分，從而獲取高可信度(相似度>0.8)的中藥候選靶標譜，并通過功能挖掘，為進一步闡釋中藥作用原理奠定基礎。在平臺“中藥(含方劑)靶標預測及功能分析”版塊輸入中藥材“三七”即可獲得候選靶標譜預測信息；基于“DisGeNET”、“HPO”、“Drugbank數(shù)據(jù)庫”、“TTD”等資源的“疾病相關(guān)分子庫”中，以“angina pectoris”為疾病或癥狀進行檢索，提取檢索出來的所有治療靶點。

1.3關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡挖掘與分析 基于中藥候選靶標與目標疾病基因之間相互作用信息，建立中藥靶標和疾病基因網(wǎng)絡圖；網(wǎng)絡通過hub節(jié)點連接，節(jié)點的大小直接反應關(guān)聯(lián)度的強弱；以“節(jié)點連接度(degree)”的2倍中位數(shù)為卡值選取核心節(jié)點；根據(jù)滿足條件的拓撲結(jié)構(gòu)特征值，即滿足“degree”、“緊密度(Closeness)”、“介度(Betweenness)”3個中位卡值的節(jié)點為中藥干預疾病失衡網(wǎng)絡的候選靶標；然后，通過對藥物候選靶標參與的功能、通路進行富集，進一步挖掘中藥緩解疾病關(guān)鍵環(huán)節(jié)的分子機制，構(gòu)建“中藥材-成分-核心靶標-通絡”的多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡圖。

2 結(jié) 果

2.1三七含有的化學成分及靶標預測 三七共收集化學成分93個，藥物靶標共有875個。其中主要的化學成分有三七皂苷R1、三七皂苷R2、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參醇等；靶標涉及生物素代謝過程、三羧酸循環(huán)、心肌細胞動作電位時的膜去極化、磷脂酰膽堿生物合成過程、膽固醇生物合成過程、葡萄糖代謝過程、ATP合成耦合電子輸運、脂質(zhì)代謝過程的調(diào)節(jié)、線粒體電子傳遞等。

2.2三七候選靶標的功能及相關(guān)通路分析 TCMIP通過化學成分二維結(jié)構(gòu)相似搜索，取高可信度>0.8的中藥進行分析。三七可得到255個候選靶標，平臺基于GO和KEGG數(shù)據(jù)庫對這些靶標的功能和通路通過富集分析得到基因功能(表1)和代謝通路(表2)結(jié)果，根據(jù)P值顯示前20個條目。三七的候選靶標具有的功能信息主要有γ氨基丁酸(GABA)-A受體活性、ATP結(jié)合、核受體活性、離子通道活性、血紅素結(jié)合、鐵離子結(jié)合、類固醇激素受體等。有研究發(fā)現(xiàn)三七中含有的人參皂苷Rg1、三七皂苷單體2A-1-1抑制血小板聚集，可能通過抑制血小板受體操縱性鈣通道活性發(fā)揮作用〔4〕。Sawicki等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)游離血紅素的積累對缺血狀態(tài)下的心臟功能是有害的，可加劇心力衰竭的發(fā)生，并指出減少心臟中的游離血紅素可能是防止心力衰竭發(fā)展的新方法。此外，三七總皂苷還可通過降低抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA改善麻醉大鼠意識狀態(tài)〔6〕。

三七富集得到的通路主要有核受體轉(zhuǎn)錄途徑、膽汁酸鹽循環(huán)利用、膠凝作用、內(nèi)源性甾醇、PPARα激活基因表達等。其中PPARα作為核受體超家族的一類配體依賴的核轉(zhuǎn)錄因子，高表達于心臟、肝臟、血管平滑肌細胞及血管內(nèi)皮細胞等，在心血管疾病中發(fā)揮著不可忽視的作用。

表1 三七候選靶標基因具有的功能

表2 三七候選靶標參與的通路信息

不僅抑制心肌肥厚，還影響心血管疾病期間的炎癥、細胞增殖和凋亡〔7〕、血管生成及心肌缺血/再灌注損傷等〔8〕，從而發(fā)揮保護心臟的作用，降低心血管疾病的發(fā)生。誘導PPAR-α可以明顯減弱心肌纖維化相關(guān)基因表達；還能保留心臟功能和心肌能量，從而改善壓力負荷過重的心力衰竭〔9〕。亦有研究表明激活PPAR-α對細胞和系統(tǒng)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)具有積極作用〔10〕，降低游離脂肪酸(FFA)和三酰甘油(TG)積累〔11〕,減少冠心病發(fā)生的誘因。此外，還發(fā)現(xiàn)冠心病患者不能有效排泄膽汁酸會導致冠狀動脈粥樣硬化疾病的發(fā)展，膽汁酸排泄量亦與冠心病長期死亡率增加相關(guān)；并指出排泄膽固醇能力受損可能是冠心病發(fā)展的一個額外的獨立危險因素〔12〕?？梢娙呖赡芡ㄟ^PPARα激活基因表達、膽汁酸鹽循環(huán)利用等途徑干預心血管疾病。

2.3三七治療冠心病心絞痛核心靶標網(wǎng)絡分析 通過TCMIP平臺的網(wǎng)絡分析模塊，構(gòu)建三七潛在靶標與疾病靶標相互作用網(wǎng)絡。根據(jù)條件及degree顯示35個靶點(圖1)，圖中節(jié)點的大小與degree呈正比。疾病與藥物共同靶點有1個為CYP27A1，與血紅素結(jié)合、鐵離子結(jié)合、氧化還原酶活性、甾醇代謝過程等有關(guān)。

2.4三七治療冠心病心絞痛關(guān)鍵靶標互作富集和靶標通路富集分析 基于GO和KEGG數(shù)據(jù)庫針對三七化學成分的靶標和冠心病心絞痛的核心靶標進行基因和通路分析，根據(jù)P值顯示前20個條目。

綠色方框代表三七；深綠色長方形代表冠心病心絞痛；綠色圓圈代表藥物靶標；紅色圓圈代表疾病靶標；紫色圓圈代表共同靶標圖1 三七治療冠心病心絞痛的候選靶標網(wǎng)絡

三七治療冠心病心絞痛關(guān)鍵靶標基因功能(表3)包括磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶活性、蛋白激酶活性、酶結(jié)合、ATP結(jié)合及NADH脫氫酶活性等。其中NAD(P)H氧化酶是血管系統(tǒng)中活性氧(ROS)的主要來源，在缺血性損傷和AS形成中發(fā)揮重要作用〔13〕。三七治療冠心病關(guān)鍵靶標通路(表4)包括多種信號通路，主要有呼吸電子傳輸，PIP3激活AKT信號，PIP5、PP2A和IER3調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號，MAP2K和MAPK激活，由RAS突變體發(fā)送信號，VEGFR2介導的細胞增殖等。其中PI3K/Akt信號通路可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞生成及代謝(能量代謝、脂肪代謝、糖代謝等)〔14〕、炎癥和凋亡〔15〕、自噬〔16〕等多種生物活動，參與冠心病的病理形成過程，是治療的重要靶點。此外，還發(fā)現(xiàn)通過PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)血小板聚集，降低SD大鼠心肌細胞損傷程度〔17〕。由此可知，PI3K/AKT作為已被證實可以參與多種細胞生物過程的信號通路，推測三七活性成分可能通過調(diào)節(jié)此通路發(fā)揮緩解心絞痛的作用。

VEGF作為一種血管生長因子，主要通過血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)2信號通路發(fā)揮促進內(nèi)皮細胞增殖、血管新生的作用，是目前治療冠狀動脈粥樣硬化相關(guān)疾病的新方向。田偉等學者〔18〕發(fā)現(xiàn)人參三七組方的提取物可能通過影響VEGFR-2、Ras、MAPK這三個關(guān)鍵信號蛋白的表達，促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)血管新生的作用；進一步通過動物實驗觀察〔19〕，發(fā)現(xiàn)可通過Ras信號通路來促進急性心肌梗死大鼠的血管新生。Li等〔20〕指出通過調(diào)節(jié)VEGFR2-SRC-ve-鈣黏蛋白復合物的形成，增加細胞表面ve-鈣黏蛋白，抑制血管通透性，降低梗死面積、出血和炎癥等。Wawrzyńska等〔21〕還發(fā)現(xiàn)心血管支架的快速內(nèi)皮化與VEGFR2有關(guān)，這對于預防再狹窄等主要臨床并發(fā)癥至關(guān)重要。此外，腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)及其主要介質(zhì)血管緊張素(Ang)Ⅱ可通過對內(nèi)皮功能、炎癥、纖維蛋白溶解平衡和斑塊穩(wěn)定性的影響直接影響動脈粥樣硬化過程的進展〔22〕；亦可通過阻斷RAS 改善心臟肌膜Na+-K+-ATPase和Na+/Ca2+的交換活動，緩解心肌梗死導致的心力衰竭〔23〕。MAPK-ERK1/2信號通路與大鼠心肌缺血再灌注損傷及心肌細胞凋亡相關(guān)〔24〕。由此可知，三七活性成分可能通過調(diào)節(jié)血管新生、血管內(nèi)皮功能、細胞凋亡及增殖等，發(fā)揮保護心肌的作用，進而起到治療心絞痛的作用。

表3 三七治療冠心病心絞痛靶標基因功能分析

2.5三七治療冠心病心絞痛“中藥材-成分-核心靶標-通路-疾病”多維網(wǎng)絡分析 基于TCMIP平臺構(gòu)建三七治療冠心病心絞痛的療效機制“中藥材-成分-核心靶標-通路”多維網(wǎng)絡。相關(guān)通路主要有雌激素依賴性基因表達、HATs乙酰化組蛋白、PPARα激活基因表達、ABC家族蛋白介導轉(zhuǎn)運、核受體轉(zhuǎn)錄途徑、細胞內(nèi)受體的蛋白修飾、內(nèi)源性甾醇等(圖2)。從候選靶標網(wǎng)絡與“中藥材-成分-核心靶標-通路”網(wǎng)絡圖，推測三七對冠心病心絞痛的干預作用可能與PPARα激活基因表達、ABC家族蛋白介導轉(zhuǎn)運、核受體轉(zhuǎn)錄途徑及雌激素依賴性基因表達等有關(guān)。PPARα激動劑通過上調(diào)ABCA1蛋白的表達，促使膽固醇流出〔25〕，減緩冠心病的進程，起到保護心肌的作用。Meyer等〔26〕指出在絕經(jīng)前婦女中，內(nèi)源性雌激素與冠狀動脈疾病、心肌梗死和發(fā)病率降低有關(guān)，并認為活化G蛋白耦聯(lián)雌激素受體(GPER)可為冠狀動脈疾病患者的一級和二級預防提供治療益處。

表4 三七治療冠心病心絞痛關(guān)鍵靶標通路富集分析

方形為丹參；菱形為成分；圓形為核心靶標；三角形為通路圖2 三七治療冠心病“中藥材-成分-核心靶標-通路”多維網(wǎng)絡關(guān)系

3 討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷(PNS)對于冠狀動脈疾病的作用機制包括調(diào)節(jié)炎癥、脂質(zhì)代謝、血管生成〔27〕；通過提高血小板環(huán)磷酸腺苷的含量及減少血栓素A2的生成發(fā)揮抗血栓作用的〔28〕；通過線粒體途徑減弱心肌細胞凋亡〔29〕；抗氧化應激反應、抑制核因子(NF)-κB/誘導型一氧化氮合酶(iNOS)表達,從而改善內(nèi)皮功能,減輕內(nèi)皮細胞損傷有關(guān)〔30〕；通過自噬途徑減輕心肌缺血再灌注損傷〔31〕；抑制脊髓膠質(zhì)細胞的激活，可緩解急性炎性內(nèi)臟痛〔32〕。此外，三七還能誘使血小板釋放花生四烯酸、Ca2+、血小板凝血因子Ⅲ等止血活性物質(zhì)，達到止血作用〔33〕。三七總多糖具有抗炎、抗氧化、降血脂及調(diào)節(jié)免疫的功能等〔34〕。由此可知三七通過多途徑、多靶點，起到擴張血管、增加心肌血流量及心肌營養(yǎng)狀況，改善心肌功能及心肌微循環(huán)，以干預冠心病、冠心病心絞痛等疾病問題。

本研究借助中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺v2.0，發(fā)現(xiàn)三七對冠心病心絞痛的干預作用可能與PPARα激活基因表達、ABC家族蛋白介導轉(zhuǎn)運、核受體轉(zhuǎn)錄途徑等有關(guān)。但本研究所得的結(jié)果仍有局限性，基于依托TCMIP平臺及數(shù)據(jù)庫，通過數(shù)據(jù)挖掘藥物功能和作用的預測可能存在不足，未來還需要在基礎和臨床實驗中進一步證實；三七本身的活性成分可能有更廣泛的潛在治療作用。故本文為進一步科研及臨床提供思考方向及理論依據(jù)，仍需要不斷完善。