“低溫誘導(dǎo)植物染色體數(shù)目的變化”實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)

徐司棋

【摘要】本文對(duì)人教版生物必修2中的“低溫誘導(dǎo)植物染色體數(shù)目的變化”的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了改進(jìn)。實(shí)驗(yàn)用蠶豆作材料，結(jié)果顯示低溫處理72小時(shí)和用濃度為0.3%秋水仙堿處理72小時(shí)染色體數(shù)目有較好的加倍效果。希望本文的研究能為教育工作者的生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供幫助，為推進(jìn)高中生物實(shí)驗(yàn)教材改革提供動(dòng)力。

【關(guān)鍵詞】高中生物;遺傳與變異;實(shí)驗(yàn)改進(jìn)

一、實(shí)驗(yàn)開(kāi)展的重要性

“染色體變異”包括兩部分的內(nèi)容：染色體結(jié)構(gòu)的變異和染色體數(shù)目的變異。這一節(jié)涉及細(xì)胞分裂、遺傳的基本規(guī)律、植物體細(xì)胞雜交、生物的進(jìn)化等內(nèi)容，與前后知識(shí)的聯(lián)系緊密。因此，在必修2的整個(gè)生物教學(xué)中，染色體變異的內(nèi)容就顯得尤為重要。染色體數(shù)目變異中的染色體組、單倍體、二倍體多倍體等多個(gè)概念相互聯(lián)系，既相似又不同，容易混淆。因此，染色體數(shù)目變異為本節(jié)的教學(xué)重難點(diǎn)。為了突破教學(xué)難點(diǎn)，加深學(xué)生對(duì)知識(shí)的理解，使學(xué)生獲得直觀的知識(shí)，高中生物教材（人教版）特別安排了“低溫誘導(dǎo)植物染色體數(shù)目變化”的實(shí)驗(yàn)輔助教學(xué)。

二、實(shí)驗(yàn)開(kāi)展存在的困難及原因

“低溫誘導(dǎo)植物染色體數(shù)目變化”是高中生物課程中重要實(shí)驗(yàn)之一。在筆者教育實(shí)踐期間，教師普遍反映按教材實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)效果不太理想。造成實(shí)驗(yàn)效果不理想的主要由于實(shí)驗(yàn)存在以下幾點(diǎn)問(wèn)題：

（1）洋蔥收獲后有一個(gè)自然休眠期，洋蔥發(fā)根少。

（2）低溫處理過(guò)久，有的材料有爛根現(xiàn)象。

（3）低溫處理36小時(shí)后的材料，視野中帶有染色體變化的細(xì)胞數(shù)目太少，顯微鏡無(wú)法觀察到。

（4）有的材料著色不好，很多細(xì)胞沒(méi)染上色。

（5）細(xì)胞分散得不好，細(xì)胞堆疊，很難看清細(xì)胞具體的染色體數(shù)目。

（6）壓片時(shí)，一些學(xué)生用力過(guò)度，將細(xì)胞染色體撞成碎片;有的學(xué)生沒(méi)按住蓋玻片，使得玻片滑動(dòng)，影響觀察。

三、改進(jìn)方法的探索

楊潔等研究結(jié)果表明，蠶豆是一種較好的實(shí)驗(yàn)材料。那么在操作中要低溫處理多長(zhǎng)時(shí)間，才可能使植物的染色體數(shù)目發(fā)生變化或者發(fā)生染色體數(shù)目變化的細(xì)胞最多呢？前人曾用洋蔥、大蒜研究秋水仙堿對(duì)植物多倍體誘導(dǎo)的影響，效果顯著。那么秋水仙堿對(duì)蠶豆多倍體誘導(dǎo)的效果是否同樣顯著呢？那么最佳處理濃度多少呢？最佳處理時(shí)間是多久呢？帶著這些思考，結(jié)合教材實(shí)驗(yàn)存在的一些問(wèn)題，筆者通過(guò)下面的實(shí)驗(yàn)，對(duì)誘導(dǎo)蠶豆根尖細(xì)胞染色體數(shù)目變化的最佳處理進(jìn)行研究和探索。

1.材料與方法

（1）實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑

①實(shí)驗(yàn)材料：采用蠶豆（ Vicia faba Linn 2n = 12） 種子作為實(shí)驗(yàn)材料（取于華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室）。

②主要試劑：秋水仙堿（用蒸餾水配制成濃度為0.1%、0.2%和0.3%溶液）、卡諾固定液（無(wú)水酒精：醋酸=3：1）、改良苯酚品紅染液（1ml 苯酚品紅 + 9ml 45%冰醋酸 + 0.1g 山梨醇）、70%的乙醇、0.1mol/LHCl。

（2）實(shí)驗(yàn)方法

①培養(yǎng)根尖 蠶豆種子于28℃左右水浴中浸泡24小時(shí)后，取出在28℃的恒溫箱內(nèi)沙培2-4天，每天澆一次蒸餾水，保持沙土濕潤(rùn)即可。

②預(yù)處理 待蠶豆胚根長(zhǎng)出約 1.5cm 根時(shí)，選擇具有相同長(zhǎng)勢(shì)的種子進(jìn)行預(yù)處理。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組分為低溫處理組和秋水仙堿處理組。低溫處理組將材料置于2-4℃的冰箱中培養(yǎng)（澆水時(shí)要用2-4℃的水），處理時(shí)間分為24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，共3個(gè)處理。秋水仙堿處理組將材料放到28℃的恒溫箱用秋水仙堿處理培養(yǎng)，濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%，處理時(shí)間為24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，共9個(gè)處理。將對(duì)照組的材料用蒸餾水放到28℃的恒溫箱培養(yǎng)。對(duì)于上述每種處理，均使用10粒種子，每天更換一次培養(yǎng)液。

③固定 剪下約1.5cm 長(zhǎng)的根尖，清洗3次，然后置于卡諾氏固定液中2-4℃冷藏24小時(shí)。

④解離 用70%乙醇洗2次，用蒸餾水沖洗2次后，將根尖放置在預(yù)熱的1mol/LHCl中約60℃的恒溫水浴10分鐘。

⑤染色 將從1mol/LHCl溶液取出的根尖用蒸餾水漂洗2-3次后，將材料置于載玻片中央，去除根冠和伸長(zhǎng)區(qū)僅留分生區(qū)部分（1-2mm即可），用刀片將材料切碎，加一滴改良苯酚品紅染液，用鑷子輕微攪拌，使材料分散均勻，染色10min。

⑥壓片 向載玻片上滴一滴新鮮的染色溶液，蓋上蓋玻片，然后用一些吸收紙覆蓋蓋玻片，用左手固定載玻片，然后用右手拇指在吸收紙上垂直地施加壓力或使用鉛筆的橡膠筆尖垂直敲擊蓋玻片，以盡可能分散材料。

⑦顯微觀察 首先在低倍鏡觀察，找到染色分散良好且清晰的中期分裂圖像時(shí)，然后轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察，并拍攝照片進(jìn)行記錄。

⑧數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)處理隨機(jī)抽查10 個(gè)視野，對(duì)視野中的細(xì)胞總數(shù)和染色體加倍的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算細(xì)胞多倍染色體誘導(dǎo)率。細(xì)胞多倍染色體誘導(dǎo)率= 染色體加倍的細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù) ×100%。

2.結(jié)果與分析

（1）低溫不同處理對(duì)蠶豆胚根細(xì)胞染色體數(shù)目的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，低溫處理不同時(shí)間對(duì)蠶豆胚根細(xì)胞染色體數(shù)目的加倍效果的影響有顯著的差異。蠶豆胚根低溫處理72小時(shí)誘導(dǎo)染色體數(shù)目的加倍效果（如圖1-1）最好，處理24小時(shí)的效果（如圖1-3）次之，48小時(shí)的效果（如圖1-2）最差。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與張興蓮等的研究結(jié)果相一致。

（2）秋水仙堿不同處理對(duì)蠶豆胚根細(xì)胞染色體數(shù)目的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，不同濃度秋水仙堿不同處理時(shí)間對(duì)蠶豆胚根細(xì)胞染色體數(shù)目的加倍效果的影響有顯著的差異。就處理濃度而言，總體來(lái)說(shuō)，用濃度為0.1%的秋水仙堿處理的蠶豆胚根染色體數(shù)目的加倍效果（如圖2-1-3）最好，處理濃度為0.3%的效果（如圖2-7-9）次之，0.2%效果（如圖2-4-6）最差。從處理時(shí)間上看，總體來(lái)說(shuō)，蠶豆胚根處理72小時(shí)染色體數(shù)目的加倍效果（如圖2-3、6、9）最好，處理24小時(shí)的效果（如圖2-1、4、7）次之，48小時(shí)的效果（如圖2-2、5、8）最差。綜合來(lái)看，用濃度為0.3%的秋水仙堿處理72小時(shí)效果（如圖2-9）是最好的。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與閆秋潔等的研究結(jié)果有所差異。

3.改進(jìn)建議與討論

筆者通過(guò)上面的實(shí)驗(yàn)，對(duì)誘導(dǎo)蠶豆根尖細(xì)胞染色體數(shù)目加倍的最佳處理進(jìn)行研究和探索，發(fā)現(xiàn)2-4℃低溫處理72小時(shí)誘導(dǎo)染色體數(shù)目的加倍效果最好。而教材中實(shí)驗(yàn)步驟安排是低溫處理36小時(shí)，因此可以試著對(duì)教材實(shí)驗(yàn)改進(jìn)低溫處理時(shí)間延長(zhǎng)至72小時(shí)或更長(zhǎng)，但低溫處理時(shí)間更長(zhǎng)加倍效果是否更好，仍有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

此外，筆者通過(guò)上面的實(shí)驗(yàn)，還發(fā)現(xiàn)秋水仙堿這種化學(xué)誘導(dǎo)劑對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞染色體加倍的誘導(dǎo)效果也是十分顯著的。其中濃度為0.1%的秋水仙堿處理的效果是最好，但濃度為0.3%的秋水仙堿處理72小時(shí)的效果最佳。與低溫處理（除72小時(shí)外）相比，秋水仙素誘導(dǎo)處理的效果更顯著。因此，教材對(duì)誘導(dǎo)植物染色體數(shù)目的變化的實(shí)驗(yàn)可以嘗試改進(jìn)用化學(xué)試劑誘導(dǎo)，如秋水仙堿。秋水仙堿是普遍使用較為理想的化學(xué)誘導(dǎo)劑，但它毒性較大，往往不易在實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程在學(xué)生范圍內(nèi)使用。前人研究表明，磺胺甲喋呤、甲胺磷和氟脲類除草劑對(duì)某些植物具有較高的多倍體誘導(dǎo)效果。教材實(shí)驗(yàn)可以試著改進(jìn)使用這些毒性較低的除草劑，但它們對(duì)洋蔥、大蒜、蠶豆的胚根根尖染色體加倍效果如何還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊潔，姜翠萍，戴群.“低溫誘導(dǎo)植物染色體數(shù)目變化”實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)與思考[J].生物學(xué)教學(xué)，2012，08：69-70.

[2]黃永蓮，胡木林.秋水仙素對(duì)洋蔥根尖細(xì)胞的誘變效應(yīng)[J].亞熱帶植物科學(xué)，2005，01：42-45.

[3]孔祥禎.用大蒜根尖誘發(fā)多倍體[J].植物雜志，1990，02：14.

[4]張興蓮，潘寧.“低溫誘導(dǎo)植物染色體數(shù)目變化”的實(shí)驗(yàn)探究[J].中學(xué)生物教學(xué)，2011，07：45-46.

[5]閆秋潔，楊瓊.秋水仙素對(duì)蠶豆胚根生長(zhǎng)的影響及多倍體誘導(dǎo)效應(yīng)分析[J].廣西植物，2012，32（5）：386-391.

[6]周香君.大蒜多倍體化學(xué)誘導(dǎo)技術(shù)研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008.