不同濃度南葶藶子水提液對心衰大鼠心功能的干預研究

董竹琴　羅穎　楊明　孫志強　林冬銘　竇麗萍　黃抒偉

[摘要] 目的 探討不同濃度南葶藶子水提液在心力衰竭大鼠心室重構(gòu)中的作用。 方法 32只SD大鼠隨機分為4組，為假手術(shù)組（sham group）、模型組（HF group）、南葶藶子-5 g/kg組（HF+DS-A 5 g/kg group）和南葶藶子-10 g/kg組（HF+DS-A 10 g/kg group）。采用腎上腹主動脈縮窄術(shù)制作大鼠心力衰竭模型（假手術(shù)組除外）。4周后超聲心動圖及血流動力學檢測心功能、HE染色和電鏡觀察心室重構(gòu);TUNEL法測定細胞凋亡。 結(jié)果 超聲心動圖發(fā)現(xiàn)：模型組左室后壁舒張末期厚度（LVPWd）明顯增厚，左室射血分數(shù)（LVEF）及短軸縮短率（FS）顯著下降（P<0.05）;與模型組相比，南葶藶子-5 g/kg 組及南葶藶子-10 g/kg組LVPWd均明顯偏低，而LVEF、FS顯著增加（P<0.05）;南葶藶子-5 g/kg 組及南葶藶子-10 g/kg組之間無明顯差異（P>0.05）。血流動力學監(jiān)測顯示：與假手術(shù)組相比，模型組左室舒張末壓力（LVEDP）、左室收縮末壓力（LVESP）指標明顯升高;與模型組比較，南葶藶子-5 g/kg組及南葶藶子-10 g/kg組大鼠的LVEDP和LVESP指標顯著降低（P<0.05）;南葶藶子-10 g/kg組LVEDP與LVESP的值相較南葶藶子-5 g/kg組偏低，但結(jié)果無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。HE染色觀察發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組大鼠心肌纖維排列整齊、致密;模型組大鼠心肌組織病理切片見心肌細胞肥大且排列錯亂，細胞間隙增大;南葶藶子-5 g/kg組和南葶藶子-10 g/kg組心肌細胞肥大不明顯，心肌纖維排列較整齊。電鏡結(jié)果顯示：假手術(shù)組心肌纖維組織排列規(guī)則，線粒體嵴致密有序。模型組心肌纖維紊亂;線粒體腫脹、空泡化。在南葶藶子-5 g/kg組及南葶藶子-10 g/kg組中，心肌細胞輕度腫脹，膜結(jié)構(gòu)較清晰，肌原纖維排列較整齊，線粒體輕度腫脹。TUNEL染色法顯示：模型組大鼠心肌細胞凋亡數(shù)量顯著增加（P<0.05）;與模型組相比，南葶藶子-5 g/kg組及南葶藶子-10 g/kg組大鼠心肌細胞凋亡數(shù)量顯著降低（P<0.05）;南葶藶子-5 g/kg組與南葶藶子-10 g/kg組比較細胞凋亡數(shù)量接近（P>0.05）。 結(jié)論 南葶藶子水提液具有改善心力衰竭大鼠心臟功能、抑制心室重構(gòu)及減少心肌細胞凋亡的作用;不同濃度南葶藶子水提液干預后的效果無明顯差異。

[關(guān)鍵詞] 南葶藶子;濃度;心力衰竭;心功能;細胞凋亡

[中圖分類號] R285.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）11-0038-05

Intervention of different concentrations of aqueous extract from Semen Lepidii on heart function in rats with heart failure

DONG Zhuqin1? ?LUO Ying2? ?YANG Ming1? ?SUN Zhiqiang3? ?LIN Dongming1? ?DOU Liping1? ?HUANG Shuwei1

1.The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University of Chinese Medicine，? Hangzhou? ?310005， China; 2.The Second Affiliated Hospital of Hainan Medical College， Haikou? ?570102， China; 3.The First People's Hospital of Yuhang District in Hangzhou， Hangzhou? ?311100， China

[Abstract] Objective To explore the role of different concentrations of aqueous extract from Semen Lepidii in ventricular remodeling in heart failure rats. Methods 32 SD rats were randomly divided into 4 groups： sham group， model group（HF group）， Lepidii-5 g/kg group（HF+DS-A 5 g/kg group） and Lepidii-10 g/kg group（HF+DS-A 10 g/kg group）. Adrenal aortic constriction was used to make rat heart failure model（except sham operation group）. After four weeks， echocardiography and hemodynamics were used to detect cardiac function， HE staining and electron microscopy were used to observe ventricular remodeling; TUNEL method was used to determine apoptosis. Results Echocardiography revealed that the left ventricular posterior wall diastolic thickness（LVPWd） in the model group was significantly thickened， and the left ventricular ejection fraction（LVEF） and fraction shortening（FS） were significantly decreased（P<0.05）. Compared with the model group， the LVPWd of the Lepidii-5 g/kg group and the Lepidii-10 g/kg group were significantly lower， while the LVEF and FS increased significantly（P<0.05）; there was no significant difference between Lepidii-5 g/kg group and Lepidii-10 g/kg group（P>0.05）. Hemodynamic monitoring showed that compared with the sham group， left ventricular end diastolic pressure（LVEDP） and left ventricular end systolic pressure（LVESP） were significantly increased in the model group; compared with the model group， the LVEDP and LVESP of the rats in the Lepidii-5 g/kg group and the Lepidii-10 g/kg group were significantly reduced（P<0.05）; the values of the LVEDP and LVESP in the Lepidii-10 g/kg group were lower than those in the Lepidii-5 g/kg group， but the differences were not statistically significant（P>0.05）. HE staining revealed that myocardial fibers in the sham group were arranged neatly and densely; the pathological section of myocardial tissue in the model group showed myocardial cells were enlarged and arranged disorderly， and the cell gap increased; the myocardial cell hypertrophy in the Lepidii-5 g/kg group and Lepidii-10 g/kg group was not obvious， and the myocardial fibers were arranged neatly. Electron microscopy results showed that myocardial fibrous tissue was arranged regularly and mitochondrial crests were dense and orderly in the sham group. Myocardial fiber disorder， mitochondria swelling and vacuolation were showed in the model group. In the Lepidii-5 g/kg group and the Lepidii-10 g/kg group， the myocardial cells were slightly swollen， the membrane structure was clear， the myofibrils were arranged neatly， and the mitochondria were slightly swollen. TUNEL staining showed that the number of cardiomyocyte apoptosis in the model group was significantly increased（P<0.05）; compared with the model group， the number of cardiomyocyte apoptosis was significantly reduced in the Lepidii-5 g/kg group and the Lepidii-10 g/kg group（P<0.05）; the number of apoptosis was similar in the Lepidii-5 g/kg group and the Lepidii-10 g/kg group（P>0.05）. Conclusion Aqueous extract from Semen Lepidii has the effects of improving cardiac function， inhibiting ventricular remodeling， and reducing myocardial cell apoptosis in rats with heart failure. The effects of different concentrations of aqueous extract from semen Lepidii have no significant difference.

[Key words] Aqueous extract from Semen Lepidii; Concentration; Heart failure; Heart function; Apoptosis

心力衰竭是指由于各種心臟的結(jié)構(gòu)和（或）功能性的疾病，引起心室的收縮和（或）舒張能力下降，導致一系列肺循環(huán)或體循環(huán)淤血癥狀的一組臨床綜合征，是各類心臟疾病的終末階段。目前慢性心力衰竭的發(fā)病率和死亡率仍呈繼續(xù)增長趨勢。高血壓是最常見的心血管疾病之一，也是心力衰竭的主要原因。長期高血壓引起的壓力負荷增加會對心臟產(chǎn)生持續(xù)性機械刺激，易引起心肌肥厚，常導致心力衰竭惡化[1]，并增加心源性死亡率[2，3]。目前慢性心力衰竭的治療中，藥物治療是基石。研究證實西藥如血管緊張素Ⅱ轉(zhuǎn)換酶抑制劑、β受體阻滯劑和醛固酮受體拮抗劑等能有效改善心肌肥厚，降低心力衰竭的死亡率和再住院率，但部分患者常因藥物副作用或血壓心率等不能耐受而無法應用上述藥物。

南葶藶子為十字花科植物播娘蒿的干燥成熟種子，其水提液[Aqueous Extract from Descurainia sophia（L.）Webb. ex Prantl DS-A]具有止咳平喘、促進排尿、減輕水腫、改善心功能的功效，能使心衰患者獲益。既往研究表明[4]，南葶藶子水提液可抑制心室重構(gòu)，改善心功能，但其具體機制尚不明確。細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種形式，與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展明顯相關(guān)，過度的心肌細胞凋亡可導致心室重構(gòu)、心肌肥厚和心功能不全[5，6]的進展。

因此，本實驗以腹主動脈縮窄所致心力衰竭大鼠為研究對象，明確不同濃度南葶藶子水提液對心室重構(gòu)的作用，并初步探索其可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物

雄性SD大鼠32只，體重（220±10）g，由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心提供，實驗動物生產(chǎn)單位為上海西普爾必凱實驗動物有限公司，許可證號為：SCXK（滬）2013-0016。

1.2 實驗主要藥品與試劑

南葶藶子提取液：南葶藶子購于浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，由浙江中醫(yī)藥大學藥物研究所制備。水提液的制備方法：取南葶藶子200 g，8倍量70℃水浴提取3次，每次1 h，合并濾液濃縮至100 mL備用，每1 mL相當于2 g原生藥。TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒（美國羅氏公司）;抗心肌肌鈣蛋白抗體（購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司）。

1.3 建模及分組

心衰大鼠造模過程[7]如下：術(shù)前12 h禁食，10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔麻醉SD大鼠。采用劍突下腹正中偏左0.5 cm切口切開腹腔，鈍性游離腹主動脈。選用8號注射器的針尖，平行于腹主動脈放置于4號線上并結(jié)扎。輕輕地抽出針尖，使腹主動脈的面積減少至原50%～60%大小，噴青霉素粉，關(guān)腹。除假手術(shù)組僅分離腹主動脈，不進行腹主動脈縮窄外，其余組均采用上述方法造模。常規(guī)喂養(yǎng)4周后，取腹主動脈縮窄術(shù)后大鼠隨機分為模型組、南葶藶子-5 g/kg組、南葶藶子-10 g/kg組。南葶藶子-5 g/kg組、南葶藶子 -10 g/kg組分別予南葶藶子水提液5、10 g/（kg·d）灌胃，假手術(shù)組和模型組接受5 mL/（kg·d）生理鹽水灌胃，持續(xù)灌胃4周。

1.4 檢測方法

1.4.1 超聲心動圖測量? 大鼠經(jīng)異氟烷霧化麻醉后仰臥位固定，取左胸骨旁短軸切面，收集超聲心動圖數(shù)據(jù)。每只大鼠至少測量3個連續(xù)的心臟周期;記錄左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室后壁舒張末期厚度（left ventricular posterior wall at diastole，LVPWd）和左室縮短分數(shù)（fraction shortening，F(xiàn)S）。測量和分析由同一名經(jīng)驗豐富的研究人員進行，并采用盲法。

1.4.2血流動力學檢測 大鼠測重后以20%烏拉坦麻醉（濃度為5 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠。從頸正中側(cè)切開，然后逐層暴露右側(cè)頸總動脈，鈍性分離后結(jié)扎遠心端，血管夾夾住近心端。將微導管與壓力換能器相連接，經(jīng)右側(cè)頸總動脈將微導管插入，微導管另一端連接壓力換能器輸入多媒體生物信號記錄系統(tǒng)（ALC10 MPA2000）。當微型導管進入左心室后，穩(wěn)定5 min后測量心率（heart rate，HR）、左室舒張末壓力（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、左室收縮末壓力（left ventricular end-systolic pressure，LVESP）等血流動力學指標。

1.4.3 心肌組織切片HE染色? 心室標本橫切，固定于10%石蠟甲醛緩沖液中24 h，石蠟包埋。切割成4 μm厚的切片，行HE染色。

1.4.4 透射電子顯微鏡觀察? 取邊緣梗死區(qū)心肌組織新鮮標本，4℃下以2.5%戊二醛固定過夜，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，1%四氧化鋨靜置2 h，用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗3次。在未涂布的銅網(wǎng)面上使用超微粒（Leica.Solms.Germany）標準程序獲得3個超薄切片，并用0.2%檸檬酸鉛/1%乙酸鈾酰進行染色。用JOEL-1400EX透射電子顯微鏡（日本東京）記錄放大20000×倍數(shù)的圖像。

1.4.5 TUNEL實驗檢測心肌細胞凋亡? 取上述石蠟切片，根據(jù)TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）試劑盒的說明書對切片進行染色，采用抗心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）抗體染色心肌細胞，封片、熒光顯微鏡拍照，導入Image J軟件，統(tǒng)計心肌細胞凋亡率。

1.5 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學分析，計量資料采用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）;P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠超聲心動圖檢查

超聲心動圖結(jié)果顯示：模型組左室后壁舒張末期厚度（LVPWd）明顯增厚，左室射血分數(shù)（LVEF）及短軸縮短率（FS）顯著下降（P<0.05）;與模型組相比，南葶藶子-5 g/kg組及南葶藶子-10 g/kg組LVPWd均明顯偏低，而LVEF、FS顯著增加（P<0.05）;南葶藶子-5 g/kg組及南葶藶子-10 g/kg組之間無明顯差異（P>0.05），見表1。超聲心動圖圖像見封三圖2。

2.2 血流動力學評估

血流動力學監(jiān)測顯示：與假手術(shù)組相比，模型組左室舒張末壓力（LVEDP）、左室收縮末壓力（LVESP）指標明顯升高;與模型組比較，南葶藶子-5 g/kg組及南葶藶子-10 g/kg組大鼠的LVEDP、LVESP指標顯著降低（P<0.05）;南葶藶子-10 g/kg組LVEDP與LVESP相較南葶藶子-5 g/kg組偏低，但結(jié)果無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2及封三圖3。

2.3 心肌組織HE染色病理變化

假手術(shù)組SD大鼠心肌組織病理切片HE染色可見心肌纖維排列整齊、致密，染色均勻，心肌細胞無肥大，淋巴細胞浸潤少見。模型組SD大鼠HE染色可見心肌細胞肥大，細胞間隙增大，淋巴細胞浸潤可見，同時心肌纖維排列紊亂。南葶藶子-5 g/kg組和南葶藶子-10 g/kg組心肌細胞肥大不明顯，心肌纖維排列較整齊（封三圖4）。

2.4 心室組織電鏡結(jié)果

假手術(shù)組心肌纖維組織排列規(guī)則，Z線清晰均勻，線粒體嵴致密有序。模型組心肌纖維紊亂，Z線消失，甚至斷裂;線粒體形態(tài)不一，膜結(jié)構(gòu)不清，嵴紊亂、融合甚至消失;可觀察到線粒體腫脹、空泡化。在南葶藶子-5 g/kg組及南葶藶子-10 g/kg組中，心肌損傷明顯減輕，心肌細胞輕度腫脹，膜結(jié)構(gòu)較清晰，肌原纖維排列較整齊，H帶較清晰，仍有少量斷裂的肌絲，線粒體輕度腫脹（封三圖5）。

2.5 TUNEL染色法測定結(jié)果

TUNEL測定顯示左室心肌組織中TUNEL和cTnI雙重染色的代表性照片（標尺：20 μm）。紅色表示cTnI信號;綠色表示TUNEL陽性細胞核。假手術(shù)組心肌細胞凋亡數(shù)少;模型組心肌細胞凋亡數(shù)明顯上升（P<0.05）;與模型組相比，南葶藶子-5 g/kg組及南葶藶子-10 g/kg組TUNEL染色心肌細胞凋亡陽性細胞數(shù)明顯減少，但仍多于假手術(shù)組（P<0.05）。南葶藶子-5 g/kg組與南葶藶子-10 g/kg組心肌細胞凋亡情況相差不大（P>0.05），證明不同濃度南葶藶子水提液均能抑制心衰大鼠中線粒體介導的細胞凋亡（表3及封三圖6）。

3 討論

南葶藶子是十字花科植物的一員，廣泛分布于亞洲、歐洲、北非和北美。其種子在祖國醫(yī)學中常用于止咳平喘、利尿消腫、增強心功能。目前已有研究表明，南葶藶子可通過多種機制保護心臟功能。南葶藶子可通過上調(diào)血漿多巴胺[8]水平，加強利尿，改善腎功能[9]，減輕心臟負荷。南葶藶子通過增加肺源性心臟病所致心衰大鼠的水通道蛋白AQP1的表達，改善甲狀腺激素分泌，消除肺水腫[10]。血管緊張素Ⅱ可以增強醛固酮的釋放，導致水和鹽分的潴留，致使體液量增多，心臟前負荷增加，加重心力衰竭。而?；撬嶙鳛槟陷闼炞拥慕M成成分之一，具有多種藥理和生理功能。它可以抗氧化應激和調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)，對抗兒茶酚胺和血管緊張素Ⅱ[11]，改善心臟代謝[12]。在腎損傷[13，14]的病理機制中，對甲酚硫酸鹽（pCS）和吲哚氧基硫酸鹽（IS）可明顯誘導細胞的炎癥反應，影響心臟結(jié)構(gòu)功能。前者通過NAPKH氧化[15]促進心肌細胞凋亡，后者通過AMPK/UCP-2通路[16，17]加重心肌肥厚。研究表明，經(jīng)南葶藶子治療后，pCS的排泄量增加，說明南葶藶子可通過促進心、腎毒物的排泄，間接恢復腎功能，改善心肌損傷。

本研究以腹主動脈不完全結(jié)扎制造壓力后負荷性心衰大鼠模型，實驗結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，模型組LVPWd及LVEDP明顯升高，表明心肌舒張功能明顯降低，心室重構(gòu)明顯;同時，模型組的LVESP升高，F(xiàn)S及LVEF明顯降低，證明心肌的收縮功能及射血能力均顯著降低。與模型組相比，南葶藶子-5 g/kg組及南葶藶子-10 g/kg組心衰大鼠的LVPWd、LVEDP及LVESP明顯下降，F(xiàn)S、LVEF明顯升高，證明南葶藶子水提液可改善心臟收縮與舒張功能，表明其改善心衰大鼠心室結(jié)構(gòu)和心功能的作用。病理檢查發(fā)現(xiàn)模型組的心肌細胞肥大，心肌纖維排列紊亂甚至斷裂，這些現(xiàn)象在南葶藶子-5 g/kg組及南葶藶子-10 g/kg組明顯減輕，證明南葶藶子水提液抑制了心衰大鼠心室重構(gòu)。TUNEL測定表明南葶藶子水提液可能是通過抑制心肌細胞凋亡來改善心功能不全。在本實驗中，南葶藶子-5 g/kg組和南葶藶子-10 g/kg組取得相似的實驗結(jié)果，提示可能濃度跨度欠大，兩種濃度均在有效濃度范圍內(nèi)。

自發(fā)性高血壓大鼠[18]和原發(fā)性高血壓患者[19]的左心室心肌細胞肥大和凋亡水平明顯升高。心肌細胞的能量代謝與線粒體功能密切相關(guān)。既往實驗表明，芪藶強心膠囊通過激活AMPK/PGC-1α信號通路來調(diào)節(jié)脂肪酸和葡萄糖代謝，降低血清游離脂肪酸及乳酸水平，從而保護心肌細胞和線粒體功能[20]。葶藶生脈方通過下調(diào)Bax/Bcl-2比值，減少Caspase-3蛋白表達，抑制心肌細胞凋亡[21]。本次實驗結(jié)果顯示南葶藶子水提液能減輕心衰大鼠心肌細胞的線粒體損傷，改善心肌細胞凋亡，猜測南葶藶子水提液可能是通過線粒體途徑抑制心肌凋亡。

綜上所述，南葶藶子可顯著預防心力衰竭大鼠心肌肥厚，改善心室重構(gòu)，其機制可能與抑制心肌細胞凋亡有關(guān)。本文數(shù)據(jù)為南葶藶子預防高血壓性心肌肥厚提供了一種新的思路。同時，我們也在后期進行關(guān)于芪藶強心膠囊的臨床研究，以黃芪、葶藶子等藥物為主要成分，為容量過負荷性心衰患者帶來更多的臨床獲益，也積極累積名醫(yī)大家對于心衰患者的治療經(jīng)驗。然而，本研究也有一定的局限性：①本研究提出南葶藶子可以改善心功能，但這味中藥有很多復雜的成分，不能確切指出發(fā)揮療效的藥物成分。②雖然發(fā)現(xiàn)南葶藶子能調(diào)控心肌細胞凋亡，但其確切的分子機制還需要進一步研究。

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（收稿日期：2019-12-26）