人類冠狀病毒概況及其藥物治療研究進展

王子民，王雪雅，荊曉光，遠東濤，宛磊，李智浩，吳大龍，張世魁，王斌，宋松根，武娜，魏茜

1漯河醫(yī)學高等?？茖W校第二附屬醫(yī)院創(chuàng)傷修復工程實驗室，河南漯河 462000；2鄭州大學第一附屬醫(yī)院咽喉科，鄭州 450052；3解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心醫(yī)療保險辦公室，北京 100853；4解放軍總醫(yī)院創(chuàng)新研究部創(chuàng)傷修復與組織再生研究室，北京 100048

人類高致病性冠狀病毒(coronavirus，CoV)通過密切接觸在人與人之間傳播引起呼吸道綜合征，發(fā)病率和病死率較高。2003年暴發(fā)的嚴重急性呼吸道綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS，2002-2004)[1]和2012年出現(xiàn)的中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome，MERS，2012年至今)[2]，在過去20年間對全球公共衛(wèi)生構成了重大威脅。29個國家共報告出現(xiàn)了8096例SARS，其中774例死亡，病死率為9.6%[3]；27個國家(其中12個來自中東)共報告出現(xiàn)了2499例MERS，其中861例死亡，病死率為34.4%[4]。2019年12月，由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2，SARS-CoV-2)感染引起的新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)在中國武漢出現(xiàn)[5-6]，截至2020年3月24日，中國境內(nèi)累計確診病例81 872例，累計死亡3287例；境外累計確診病例341 299例，累計死亡15 583例。SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2均有嚴重致病性，可引起急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，甚至多器官損傷和衰竭，最終導致死亡[7]，目前尚無特效藥物，現(xiàn)有治療策略通常僅限于對癥和支持治療。SARS和MERS暴發(fā)后，冠狀病毒成為病毒學領域的研究熱點。本文對冠狀病毒的結構、流行病學、免疫學及治療進行綜述，希望為此類疾病的預防、控制和治療提供參考。

1 結 構

SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2為高致病性冠狀病毒，已逐漸引起人們的重視；其他冠狀病毒已在人群中傳播了數(shù)百年，可引起輕度呼吸系統(tǒng)疾病，如5%～30%的普通感冒[8]。冠狀病毒屬套氏病毒目(Nidoviralest)冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirinae)，是具有正鏈單股RNA基因組的被膜病毒，直徑為60～200 nm[9]。冠狀病毒(Nidovirales家族)分為α、β、γ和δ 4個屬[9]。已知可感染人類的冠狀病毒有7種，其中2種(HCoV-229E和HCoV-NL63)為α屬冠狀病毒，5種(SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-HKU1和SARS-CoV-2)為β屬冠狀病毒。γ、δ屬冠狀病毒不是已知的感染人類病毒，但具有牲畜高致病性。動物流行性冠狀病毒會引起呼吸、腸道和神經(jīng)系統(tǒng)的多種疾病。SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2引發(fā)的傳染性疾病顯示了冠狀病毒越過物種屏障感染人類且具有致命性特征。

冠狀病毒基因組編碼的主要結構蛋白有4種(圖1)：位于病毒囊膜表面的刺突糖蛋白(spike protein，S)、包膜蛋白(membrane protein，M)和小包膜蛋白(envelope protein，E)，以及位于病毒囊膜內(nèi)側的核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N)[10-11]。

N蛋白的唯一功能是與冠狀病毒基因組核糖核酸(RNA)結合構成核衣殼[12]，在很大程度上參與了與病毒復制周期有關的其他方面，以及宿主細胞對病毒感染的反應[13]。M蛋白[14]是決定病毒包膜形狀的最豐富的結構蛋白，是病毒結構的主要組織者，可與所有其他主要結構蛋白相互作用[10]。M蛋白的同型相互作用是包膜形成的主要驅動力，但僅此一項不足以形成病毒體[14-16]。S、M蛋白的相互作用對于S蛋白在內(nèi)質網(wǎng)-高爾基體中間體(ERGIC)/高爾基復合體中組裝新病毒是必要的，但這兩種蛋白單獨并不能完成病毒的組裝過程[17-19]。M蛋白與N蛋白的結合穩(wěn)定了核殼蛋白(N蛋白-RNA復合物)及病毒體的內(nèi)部核心，并最終促進了病毒的裝配[18-20]。M蛋白和E蛋白共同構成病毒包膜，M、E蛋白的相互作用可促使病毒樣顆粒(virus like particles，VLPs，即一種不含病毒核酸的空殼結構)的產(chǎn)生和釋放[11,21-22]。

E蛋白是一種短的完整膜蛋白，包含60～120個氨基酸，在結構蛋白中最小(8.4～12 kD)，也最神秘。E蛋白由短而親水性的氨基末端(由7～12個氨基酸組成)，疏水性跨膜結構域(TMD，包含25個氨基酸)，以及長而親水性的羧基末端(包含大部分蛋白質)組成(圖2)[23-26]。TMD的疏水區(qū)至少包含一個兩親性α-螺旋，該α-螺旋低聚形成膜中的離子導電孔[27-28]。 該肽的總凈電荷為零，中間區(qū)域不帶電荷，一側為帶負電荷的氨基(N)末端，另一側為可變電荷的羧基(C)末端。

圖1 冠狀病毒的系統(tǒng)發(fā)育樹及基因組結構[9]Fig.1 Genomic structure and phylogenetic tree of coronaviruses[9]

在病毒復制周期中，E蛋白在感染細胞內(nèi)大量表達，但僅一小部分被整合到病毒膜中[29-30]。大部分E蛋白位于細胞內(nèi)運輸位點，參與冠狀病毒組裝和綁定靶點，包括雌激素受體、高爾基體和ERGIC[31]。缺乏E蛋白的重組冠狀病毒表現(xiàn)為毒滴度顯著下降，不成熟或子代產(chǎn)量不足，表明E蛋白在病毒裝配和成熟過程中起重要作用[32-35]。有研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV E蛋白與病毒毒力有關[32]，能夠在高爾基體膜中形成鈣離子滲透性的蛋白脂質通道。E蛋白離子通道活性與肺損傷、水腫積聚和死亡密切相關，白細胞介素(interleukin，IL)-1β介導的炎癥與肺損傷、水腫等有關，但與離子通道活性的關系尚不明確。鈣離子濃度和pH值共同調(diào)節(jié)E蛋白孔的電荷和選擇性。有研究發(fā)現(xiàn)，E蛋白離子通道活性與NLRP3炎癥小體的活化密切相關，可導致IL-1β過量產(chǎn)生[36]。鈣離子通過E蛋白離子通道轉運是炎性因子激活的主要觸發(fā)因素。綜上，SARS-CoV E蛋白離子通道在細胞水平上引起的離子紊亂及感染與機體免疫病理結果和疾病惡化有關。SARS-CoV E蛋白的蛋白質結合基序(protein binding motif，PBM)位于C-末端的最后4個氨基酸(DLLV)[37-38]。

圖2 SARS-CoV E蛋白的氨基酸序列和結構域Fig.2 Amino acid sequence and domains of SARS-CoV E protein

目前已知E蛋白與5種宿主蛋白相互作用，即BclxL、PALS1、多功能的胞內(nèi)銜接蛋白(syntenin)、鈉/鉀(Na+/K+) ATPase α-1亞基及stomatin樣蛋白[31,39-40]。 Teoh等[38]發(fā)現(xiàn)E蛋白與PALS1相互作用可破壞肺上皮細胞的緊密連接，提示SARS-CoV病毒粒子可以突破肺泡壁并發(fā)展為全身感染。有研究發(fā)現(xiàn)，E蛋白與Na+/K+ATPase α-1亞基和stomatin樣蛋白的相互作用可能是人類上皮鈉通道水平和活性降低的原 因[31]。還有研究發(fā)現(xiàn)，E蛋白是動物體內(nèi)SARS發(fā)病的決定因素[39]。通過用重組SARS-CoV感染小鼠發(fā)現(xiàn)，E蛋白可導致銜接蛋白重新分布到細胞質，引發(fā)炎性細胞因子的過表達，從而加劇免疫反應，導致組織損傷、水腫，并最終導致典型的ARDS。綜上，冠狀病毒E蛋白至少有3個作用：①E蛋白與其他蛋白之間的相互作用驅動了病毒樣顆粒(VLPs)的產(chǎn)生，參與了病毒裝配[16,21,37]；②E蛋白的TMD對病毒粒子的釋放至關重要[34,41]；③SARS-CoV E蛋白與病毒致病性有關[28,39]。E蛋白的作用值得重視，一些抗冠狀病毒藥物可能與E蛋白關系密切。圖3以MERS-CoV為例說明冠狀病毒的結構及基因組構成。

圖3 冠狀病毒病毒體的結構和基因組構成[42]Fig.3 Virion structure and genomic organization of coronavirus[42]

2 流行病學特征

2.1SARS-CoV 2002-2003年，SARS在中國南部出現(xiàn)后不久，SARS-CoV被證實為SARS的病因[1,43-44]。人類自身是該病的主要傳染源，感染的動物源和中間宿主可能為果子貍、蝙蝠、野貓等野生動物[45-47]。 潛伏期為4～20(7.6±3.4) d。傳播途徑主要為呼吸道飛沫傳播、接觸傳播和醫(yī)院內(nèi)傳播，人群普遍易感。有研究表明，年齡>60歲、有慢性病等是造成SARS患者死亡或出現(xiàn)嚴重后果的危險因素，其中患有糖尿病的SARS患者出現(xiàn)嚴重后果的相對危險度(relative risk，RR)最大(RR=5.4)。我國>60歲的SARS患者病死率為22.77%，是平均病死率的3.48倍。而≤60歲的SARS患者的病死率僅為13.2%，糖尿病和(或)心臟病是SARS病例死亡的重要危險因素。

2.2MERS-CoV 自2012年沙特阿拉伯報告了首例MERS確診病例[2]后，MERS-CoV已擴散到20多個國家和地區(qū)[4]，其中沙特阿拉伯、阿拉伯聯(lián)合酋長國和韓國疫情最為嚴重。典型的MERS癥狀包括發(fā)熱、咳嗽和呼吸急促；肺炎很常見，但并非所有患者都存在；其他癥狀還包括胃腸道癥狀，如腹瀉。部分MERS患者無癥狀，是在確診病例的積極接觸追蹤后發(fā)現(xiàn)的。約35%的MERS患者死亡。盡管大部分人感染MERS-CoV歸因于醫(yī)療環(huán)境中人與人之間的傳播，但目前有科學證據(jù)顯示，駱駝是MERS-CoV的主要宿主，也是人類感染MERS-CoV的動物源。目前駱駝在病毒傳播中的確切作用和傳播途徑尚不清楚。

2.3SARS-CoV-2 2019年12月，武漢市部分醫(yī)療機構陸續(xù)出現(xiàn)不明原因肺炎患者。自SARS-CoV-2[5,48]發(fā)病，截至2020年2月7日，中國境內(nèi)確診病例31 211例，重癥4821例，死亡637例；境外確診病例270例，死亡1例。中國境內(nèi)病例占全世界病例的99%，其中湖北省確診病例22 112例，占中國境內(nèi)確診病例的70.85%。野生動物蝙蝠、蛇和穿山甲可能為宿主或中間宿主。已經(jīng)確定SARS-CoV-2可在人與人之間傳播，密切接觸和呼吸道飛沫是其主要傳播途徑，也有經(jīng)糞-口傳播的可能。各年齡段人群普遍易感，被感染的主要是成人，老人和體弱多病的人更容易被感染[49]。SARS-CoV-2屬于β屬冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑60～140 nm，其基因特征與SARSr-CoV和MERSr-CoV有明顯區(qū)別。體外分離培養(yǎng)時，SARS-CoV-2在96 h左右即可在人呼吸道上皮細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)。目前病毒來源、感染后排毒時間、發(fā)病機制等尚不明確[50]。

3 發(fā)病機制

3.1冠狀病毒進入細胞 Ⅰ型跨膜糖蛋白即S蛋白，其跨膜途徑是冠狀病毒進入細胞的主要途徑：MERS-CoV S蛋白的受體結合域(RBD)由S1亞基組成，含有367～606個氨基酸，可分為外部亞結構域和核心域，其RBD核心通過特殊的插入環(huán)并通過下部和上下區(qū)域夾具與細胞受體(主要是DDP4R)綁定，從而促進病毒顆粒向細胞質中釋放并促進感染進展[51]。此外，病毒也可經(jīng)過細胞表面輔助途徑產(chǎn)生膜融合作用而進入細胞。

3.2內(nèi)質網(wǎng)(E R)應激反應/未折疊蛋白反應(unfolded protein reaction，UPR)和細胞凋亡 ER可以承受很高的蛋白質含量[52]。當ER折疊和加工蛋白質的能力超出極限時，未折疊或錯誤折疊的蛋白質會迅速在管腔中積聚，從而激活ER應激反應或UPR。通過增強蛋白質的折疊能力，分子伴侶和ER輔助降解(estrogen receptor assisted degradation，ERAD)共同組成UPR的多種信號途徑[53]。若UPR延長且不可逆，則會啟動細胞凋亡[54]。病毒感染通過增加內(nèi)質網(wǎng)的蛋白質含量也可觸發(fā)UPR，該途徑可被宿主細胞用作抗病毒反應[55]。冠狀病毒E蛋白通過抑制UPR信號途徑在感染細胞中發(fā)揮抗凋亡作用，這可能是一種生存機制，可以繼續(xù)病毒繁殖。迄今為止，E蛋白的這一功能僅在SARS-CoV中被證實。

3.3免疫反應/炎性體活化 病毒通常會編碼蛋白質來干擾免疫系統(tǒng)，從而抑制一種反應或增強另一種反應作為其致病性的一部分。部分病毒蛋白可破壞免疫反應途徑的成分以干擾破壞免疫系統(tǒng)并促進病毒逃逸和疾病發(fā)生，或者調(diào)節(jié)其他細胞因子，這些細胞因子也可能破壞免疫反應以促進發(fā)病[56]。MERS-CoV感染細胞的免疫機制可能為[57]：MERS-CoV通過DPP-4受體結合感染巨噬細胞，然后巨噬細胞將MERS-CoV抗原呈遞給Th0細胞，該過程導致T細胞活化和分化，包括：①產(chǎn)生其他T細胞亞群(即Th1、Th2和Th17)相關細胞因子，然后釋放大量細胞因子以放大免疫應答。這些細胞因子的持續(xù)產(chǎn)生是由病毒持續(xù)存在引起的。②產(chǎn)生IL-12和IFN-γ對Th0、NK和CD8+T細胞活化產(chǎn)生負面影響。雖然CD8+T細胞可產(chǎn)生非常有效的介質(如IFN-γ和顆粒酶)來清除MERS-CoV，但MERSCoV的抗體產(chǎn)生過程會產(chǎn)生長期或短期保護性抗體尚不清楚。MERS-CoV通過S蛋白結合宿主細胞的DPP-4受體，導致細胞質中出現(xiàn)基因組RNA。在MERS-CoV復制過程中可以部分產(chǎn)生對dsRNA的免疫反應。dsRNA致敏的TLR-3和信號通路的級聯(lián)反應分別通過TRAF3和TRAF6激活IRF和NF-κB，以促進炎性細胞因子產(chǎn)生，其中IL-12和IFN-γ對增加抗病毒蛋白的釋放以保護未感染的細胞至關重要。MERS-CoV的輔助蛋白也可結合MERS-CoV的dsRNA，在復制過程中干擾TLR-3信號傳導，防止TLR-3激活并逃避免疫反應。TLR-4可能識別S蛋白并通過MyD88依賴性信號通路導致炎性細胞因子激活。病毒與細胞的相互作用導致產(chǎn)生大量免疫介質。MERS-CoV感染的細胞會分泌大量趨化因子和細胞因子(MCP-1、IL10和CXCL10)，這些因子又將淋巴細胞和白細胞募集到感染部位(圖4)。

圖4 MERS-CoV病毒感染過程和免疫反應途徑[57]Fig.4 Sketch map of infection process and immune response of MERS-CoV[57]

4 疫苗及藥物展望

目前尚無特效疫苗或藥物用于預防和治療高致病性冠狀病毒(SARS-CoV、MERS-CoV和SARSCoV-2)感染，主要采取對癥和支持治療。目前研究的抗冠狀病毒藥物和(或)方法主要有：①靶向冠狀病毒非結構蛋白的藥物，如瑞德西韋(GS-5734類)、羅匹那韋/利托那韋、利巴韋林。②靶向冠狀病毒結構蛋白和輔助蛋白的藥物，包括單克隆抗體療法和冠狀病毒疫苗。除冠狀病毒S蛋白外，膜(基質)蛋白和其他結構蛋白可能在候選疫苗的開發(fā)中起重要作用。因此，靶向這些病毒蛋白可能有助于疫苗或藥物的開發(fā)。③冠狀病毒感染必不可少的宿主因子和免疫調(diào)節(jié)，如環(huán)孢素、干擾素和中藥。

抗病毒候選藥物僅表現(xiàn)出窄譜活性，或僅在異常高劑量時治療有效，否則會引起嚴重的不良反應或免疫抑制[58-59]；在體外細胞培養(yǎng)或動物實驗中，部分藥物已經(jīng)顯示出抑制病毒的有效性。瑞德西韋(Remdesivir，RDV，GS-5734)是一種廣譜抗病毒核苷酸類似物，對多種RNA病毒[如埃博拉病毒(EBOV)，Marburg病毒，MERS-CoV，SARS-CoV，呼吸道合胞病毒]具有較強的體外抗病毒活性[60-63]。 RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)是基因組RNA復制的發(fā)動機，以核苷酸(NTP)為原料合成大量的新基因組RNA。而在人類化學庫中也能找到一類與NTP長得非常像的分子，稱之為核苷酸類似物，如RDV。核苷酸類似物可代替NTP與RdRp結合，插入到正在合成的RNA鏈中。當病毒聚合酶試圖加入下一個NTP時會無法添加，因為核苷酸類似物化學結構的不同，不能和NTP發(fā)生聚合反應，從而導致RNA合成提前終止。近日RDV已經(jīng)在中國北京中日友好醫(yī)院進入臨床實驗，是否會引起嚴重的不良反應或免疫抑制有待進一步觀察。

有研究發(fā)現(xiàn)，免疫抑制劑(環(huán)孢素A)在體外冠狀病毒感染實驗和動物實驗中對病毒有明顯抑制作用[64-67]。環(huán)孢素A是在某些絲孢綱(Hyphomycetes)真菌如光澤柱孢菌(Cylindrocarponlucidum)和膨大彎頸霉(Tolypocladiuminfla Chemicalbooktum)的培養(yǎng)液中分離出的一種親脂性環(huán)狀多肽化合物，20世紀80年代作為免疫抑制劑在全球范圍內(nèi)被廣泛應用，現(xiàn)用于多種組織、器官移植預防排斥反應和免疫性疾病的治療。環(huán)孢素A具有可逆地選擇性地改變T淋巴細胞的功能，可阻止淋巴激活素基因的轉錄，干擾抗原呈遞，抑制IL-2、IFN和其他免疫因子的釋放，影響體液免疫和細胞免疫，抑制NK細胞的殺傷活力，抑制淋巴細胞在抗原或促分裂原刺激下的分化與增殖，但對骨髓無活性，對B細胞的作用較小，在治療劑量下對粒細胞生存亦無顯著抑制作用。其作用機制可能為：環(huán)孢素A能夠與免疫細胞中的親環(huán)蛋白結合[68]，通過形成親環(huán)蛋白-環(huán)孢素A復合物來抑制神經(jīng)鈣蛋白[69]；對鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶具有抑制作用[70]；抑制T淋巴細胞活化核調(diào)控因子(NF-AT)的核轉位[71]。環(huán)孢素A也可通過阻止MTP打開對線粒體產(chǎn)生影響[72]，不同劑量的環(huán)孢素A對CD8+T淋巴細胞活化、自體免疫性疾病、移植物抗宿主病和腫瘤的影響不同[73]。低劑量環(huán)孢素A具有免疫調(diào)節(jié)特性，可作為一種連續(xù)的免疫抑制劑。小劑量應用可能成為一種新的治療策略，尤其是治療腫瘤。環(huán)孢素A可能通過與細胞親環(huán)素結合競爭性抑制病毒復制(包括冠狀病毒)，從而使其順反肽脯氨酰異構酶功能失活[66]；亦可能是對鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶具有抑制作用，阻止MTP打開對線粒體產(chǎn)生影響，從而抑制冠狀病毒裝配、結構蛋白(S、M、E、N)生成來抑制冠狀病毒的復制和免疫細胞的過激反應。已經(jīng)證實E蛋白在病毒復制和免疫激活反應中起著重要作用[39]。

其他抗病毒藥物如羅匹那韋、利托那韋聯(lián)合IFN-β、恢復期血漿和單克隆抗體有待臨床進一步評價[61]；石蒜堿、依米汀、莫能菌素鈉、霉酚酸酯、霉酚酸、非那吡啶和吡咯烷酸對冠狀病毒體外復制具有強抑制作用[74]。

綜上所述，SARS-CoV-2引起的COVID-19正在暴發(fā)流行，除積極有力的防控外，減輕SARSCoV-2感染引起的嚴重并發(fā)癥和降低病死率是重中之重。對體外實驗效果確切且可行性高的藥物盡快開展臨床研究是當務之急。免疫抑制劑環(huán)孢素A的臨床應用安全，或可成為新的理想藥物以抗擊COVID-19疫情，但其臨床抗冠狀病毒效果有待進一步檢驗。部分天然中藥中含有真菌成分可能與環(huán)孢素有一定同源性，如豬茯苓可能會有抗冠狀病毒的效果。