細胞角蛋白及波形蛋白在原發(fā)性肺肉瘤樣癌中的診斷價值及其與臨床預后的關(guān)系

陶慧峰, 吳慶國, 張曉林, 潘 磊, 李 鋒

(上海市公共衛(wèi)生臨床中心 呼吸科, 上海, 201508)

原發(fā)性肺肉瘤樣癌(PSC)占肺部惡性腫瘤的0.1%～1.3%, 是一種分化差且含有肉瘤形態(tài)細胞(惡性骨、軟骨或骨骼肌)或肉瘤樣分化(梭形細胞或巨細胞)的非小細胞肺癌，包括多形性癌(PC)、梭形細胞癌(SCC)、巨細胞癌(GCC)、癌肉瘤(CS)和肺母細胞瘤(PB) 5個亞型[1]。PSC早期無明顯表現(xiàn)，缺乏特異性，但其具有高度侵襲性、預后差的特點[2]。X線、CT及MRI等影像學檢查是診斷肺癌和評估患者病情的重要手段，但PSC影像學表現(xiàn)介于肉瘤與肺癌之間，各亞型缺乏典型的臨床及影像表現(xiàn)[3], 早期及術(shù)前診斷存在一定困難。目前對細胞角蛋白(CK)及波形蛋白(Vimentin)在PSC診斷和預后中應用價值的研究鮮有報道。本研究對PSC患者進行CK及Vimentin檢測，探討CK及Vimentin對PSC診斷和預后的應用價值，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月—2016年6月在本院就診的139例疑似PSC患者作為研究組。納入標準: ① 經(jīng)本院倫理委員會審核通過; ② 具有病理組織學檢查結(jié)果; ③ 發(fā)病部位為肺且為首次診斷; ④ 入組前未行任何抗腫瘤治療; ⑤ 患者或其委托代理人對研究知情并簽署知情同意書; ⑥ 精神狀態(tài)正常; ⑦ 病歷資料完整，患者依從性良好。排除標準: ① 不符合納入標準者; ②合并其他臟器原發(fā)惡性腫瘤者; ③ 合并其他威脅生命安全的嚴重疾病者; ④ 合并精神疾病者; ⑤ 已進入或擬進入其他臨床研究者; ⑥ 自主要求退出或后期失訪者。選取同期30名健康人肺組織標本作為對照組。2組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 具有可比性。見表1。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要儀器: 石蠟切片機，生物組織包埋機，微波爐，高壓鍋，電磁爐，濕盒，電熱干燥箱，冰箱，恒溫孵育箱，光學顯微鏡，圖像采集系統(tǒng)。

表1 2組一般資料比較

1.2.2 主要試劑: 免疫組化試劑鼠抗人CK、鼠抗人Vimentin單克隆抗體，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，聚合物輔助劑，辣根酶標記羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)多聚體，DAB試劑盒，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，檸檬酸鹽緩沖液等。

1.3 CK及Vimentin檢測方法

研究組患者入組后經(jīng)活檢取材并固定保存以備CK及Vimentin檢測用。CK及Vimentin檢測采用免疫組織化學SP法，一抗由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，具體操作步驟嚴格參照試劑盒說明進行。石蠟切片，先經(jīng)脫蠟、水化、蒸餾水漂洗、高壓鍋修復、3%過氧化氫(H2O2)封閉、PBS緩沖液沖洗、加一抗4 ℃過夜、PBS沖洗、加聚合物輔助劑等步驟，再于37 ℃室溫下孵育20 min, 二抗37 ℃室溫下孵育30 min、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、沖洗、透明、封固。

CK及Vimentin陽性判定標準[4-6]: 以細胞質(zhì)和/或細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒者為陽性細胞。每切片均取10個高倍視野, 100個癌細胞計數(shù)，觀察陽性細胞所占比例。陽性細胞比例≤10%計1分, >10%～40%計2分, >40%～70%計3分, >70%計4分。觀察陽性細胞染色程度，無染色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。最終結(jié)果以二者分數(shù)乘積為準，乘積結(jié)果為0分評定為陰性(-), 1～2分為弱陽性(+), 3～4分為陽性(), 大于4分為強陽性()。陽性率=非陰性例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 治療方法及隨訪

139例患者均行手術(shù)治療，包括肺葉切除術(shù)、全肺切除術(shù)等，術(shù)后均接受常規(guī)輔助化療，定期通過微信、QQ、電話、復查等方式對患者進行隨訪。以入組時間為起點，患者死亡時間或隨訪截止時間為終點，隨訪截止時間定為2019年6月，起點至終點時間為生存時間，記錄患者臨床資料，分析患者3年存活率與臨床資料的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標準差表示，比較行t檢驗，計數(shù)資料采用率或百分比表示，比較行χ2檢驗，采用受試者工作曲線(ROC)計算CK及Vimentin診斷PSC的靈敏度、特異性、臨界值(cut-off值)、曲線下面積(AUC)和95%置信區(qū)間(95%CI), 采用Cox比例風險回歸模型進行多因素分析。檢驗水準α=0.05。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組患者CK及Vimentin表達情況比較

139例疑似PSC患者經(jīng)術(shù)后病理診斷確診132例, 7例為小細胞肺癌。研究組CK、Vimentin陽性表達率分別為95.68%、97.84%, 對照組CK及Vimentin無陽性表現(xiàn)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者CK及Vimentin表達情況比較

CK: 細胞角蛋白; Vimentin: 波形蛋白。與對照組比較, *P<0.05。

2.2 CK及Vimentin對PSC的診斷價值

ROC結(jié)果顯示, CK診斷PSC的靈敏度、特異性、AUC和95%CI分別為0.985、0.904、0.952和0.899～1.000, Vimentin診斷PSC的靈敏度、特異性、AUC和95%CI分別為1.000、0.919、0.959和0.908～1.000。見表3、圖1。

表3 CK及Vimentin對PSC診斷價值的ROC分析

CK: 細胞角蛋白; Vimentin: 波形蛋白。

圖1 CK及Vimentin診斷PSC的ROC曲線

2.3 PSC患者預后情況

132例PSC患者末次隨訪時間為2019年6月30日, 132例患者均完成隨訪，隨訪率100%, 隨訪時間4～36個月，中位隨訪時間13個月，患者1、3年生存率分別為81.06%(107/132)和56.06%(74/132)?？偵媲€見圖2。

圖2 132例PSC患者總生存曲線

2.4 影響PSC患者3年生存率的單因素分析和多因素分析

以患者3年是否死亡為應變量，對指標進行變量賦值并行單因素分析。年齡<60歲=0, ≥60歲=1; 性別為男=0, 女=1; 腫瘤大小<3 cm=0, 3～<7 cm=1, ≥7 cm=2; 病變位于左肺=0, 右肺=1; 吸煙史為否=0, 是=1; 手術(shù)方式為肺葉切除=0, 全肺切除=1; 輔助化療次數(shù)<6次=0, ≥6次=1; 遠處轉(zhuǎn)移為否=0, 是=1; CK為陰性=0, 弱陽性=1, 陽性=2, 強陽性=3; Vimentin為陰性=0, 弱陽性=1, 陽性=2, 強陽性=3。多因素Cox風險模型分析結(jié)果顯示，腫瘤大小、遠處轉(zhuǎn)移、CK和Vimentin是影響PSC患者3年生存率的風險因素(P<0.05)。見表4、5。

表4 影響PSC患者3年生存率的單因素分析(n=132)

CK: 細胞角蛋白; Vimentin: 波形蛋白。

表5 影響PSC患者3年生存率的多因素分析

CK: 細胞角蛋白; Vimentin: 波形蛋白。

3 討 論

PSC屬非小細胞肺癌中的罕見類型，由于PSC對放化療敏感性較低，臨床仍以外科手術(shù)治療為主[7]。由于PSC早期缺乏特異性臨床及影像表現(xiàn)，早期及術(shù)前診斷存在一定困難，易出現(xiàn)誤診，進而延誤病情。研究[8]顯示，晚期PSC患者預后生存狀態(tài)較差。肺癌及大多數(shù)實體瘤的遷移存在很大的共性，如細胞外基質(zhì)脫離、局部遷移和侵入、血液或淋巴系統(tǒng)滲入、轉(zhuǎn)移部位外滲、增殖和新腫瘤的形成等[9]。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷徙和侵害能力的重要生物學過程，在癌細胞的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。在肺癌中, EMT的異常激活導致腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移性播散和獲得治療抗性，對患者預后造成嚴重威脅[10]。EMT過程的主要特征是上皮標志物的喪失和間充質(zhì)標志物的上調(diào)。

CK是由微絲構(gòu)成的較為復雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，主要見于上皮細胞中，是角質(zhì)細胞中的骨架蛋白，是典型的上皮標志物，陽性表達多見于上皮細胞、間皮細胞、癌、間皮瘤等，且CK是目前臨床常用的免疫組織化學標記物之一[11]。Vimentin屬于間充質(zhì)標志物，控制從溶酶體傳送的由低密度脂蛋白(LDL)所衍生的膽固醇至酯化位點，其動態(tài)性質(zhì)對細胞的靈活性非常重要，對維持細胞骨架的完整性至關(guān)重要[12], 在胚胎發(fā)育、慢性炎癥、組織重建、癌癥轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮了重要作用。通過EMT作用，上皮細胞失去了細胞極性，失去與基底膜的連接，獲得較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質(zhì)的能力[13]。

不同腫瘤組織中, CK與Vimentin陽性表達情況存在一定差異。梁克誠等[14]研究發(fā)現(xiàn), Ⅰ期非小細胞肺癌患者淋巴結(jié)中CK表達陽性檢測率為27.78%(15/54)。Zhang B等[15]研究發(fā)現(xiàn), CK18在不同腫瘤類型中的表達不同，在肺部大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌(LCNEC)中的表達高于小細胞肺癌(SCLC), 而在腺癌中的表達高于鱗狀細胞癌。郭媛等[16]對8例PSC患者進行臨床研究發(fā)現(xiàn), Vimentin陽性表達率為75.0%, CK陽性表達率為87.5%。朱莉等[17]研究發(fā)現(xiàn), PSC患者Vimentin陽性表達率為100.00%, CK陽性表達率為94.74%。張曉瑩等[18]研究顯示，上皮細胞CK陽性表達率為76.47%(13/17), Vimentin陽性表達率為100.00%(17/17)。顧海艇等[19]研究中, 76例PSC患者Vimentin陽性表達率為87.7%, CK陽性表達率為93.9%。本研究139例疑似PSC患者中, CK、Vimentin陽性表達率分別為95.68%、97.84%, 提示CK及Vimentin在PSC患者中具有高陽性率表達的特點，這可能為PSC患者早期診斷提供新的思路。

本研究ROC結(jié)果顯示, CK診斷PSC的靈敏度、特異性、AUC和95%CI分別為0.985、0.904、0.952和0.899～1.000, Vimentin診斷PSC的靈敏度、特異性、AUC和95%CI分別為1.000、0.919、0.959和0.908～1.000。結(jié)果提示, CK和Vimentin對診斷PSC具有較高的臨床價值，考慮與PSC中CK和Vimentin高表達有關(guān)，但仍有待進一步研究證實。大量研究[20-22]證實, CK和Vimentin在預測表皮生長因子受體(EGFR)外顯子突變中具有重要的作用。Luo HT等[23]研究顯示, CK7陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和T分期的病理特征相關(guān)，是患者預后不良的獨立危險因素。本研究中, 132例PSC患者1、3年生存率分別為81.06%(107/132)和56.06%(74/132)。Cox風險模型分析結(jié)果顯示，腫瘤大小、遠處轉(zhuǎn)移、CK和Vimentin陽性表達是影響患者3年生存率的風險因素(P<0.05), 提示CK和Vimentin有望成為預測PSC患者預后狀態(tài)的免疫組織化學指標。

綜上所述, CK和Vimentin在PSC診斷和預后評估中均有一定的臨床價值，有望成為PSC診斷和預后評估的免疫組織化學指標。