腫瘤突變負荷對結直腸癌患者免疫治療療效的預測價值

張奧倫, 殷 婷, 張西志

(1. 揚州大學醫(yī)學院, 江蘇 揚州, 225009; 2. 揚州大學附屬蘇北人民醫(yī)院 腫瘤科, 江蘇 揚州, 225001)

結直腸癌(CRC)位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第3位(10.2%), 死亡率位居第2位(9.2%)[1]。中國結直腸癌發(fā)生率較低，但近年來有升高的趨勢[2]。目前, CRC的治療已經從“外科為主、放化療為輔”的固有治療模式轉向了精準化、個體化的治療理念，應運而生的免疫治療也越來越受到重視。不同于依靠外界干預殺死腫瘤細胞的傳統模式，免疫治療是依靠自身的免疫系統殺死腫瘤細胞。近年來研究[3]發(fā)現，腫瘤細胞可通過激活免疫檢查點活性，從而逃避免疫系統的監(jiān)視。免疫檢查點抑制劑(ICPI)通過拮抗免疫檢查點蛋白，促進T細胞活化，進而產生抗腫瘤免疫效應。免疫檢查點抑制劑在多種實體瘤的治療方面已顯示出良好的療效，且具有不良反應較少、與放化療無交叉耐藥等優(yōu)勢。然而，只有部分接受ICPI治療的患者能夠獲得持久的臨床療效[4]。因此，預測治療反應的可能性將有助于患者對這些藥物進行適當的選擇。

在接受免疫治療的結直腸癌患者的血液或腫瘤組織中已發(fā)現了各種潛在的生物標志物。程序性死亡蛋白-1配體(PD-L1)通常表達于細胞表面，它將程序性死亡蛋白-1(PD-1)結合在啟動的細胞毒性T細胞上，從而抑制細胞介導的攻擊，這種配體在腫瘤細胞上的過表達提供了對腫瘤細胞攻擊的保護。目前，免疫組化檢測PD-L1已廣泛應用于篩選結直腸癌免疫治療可獲益的患者。然而，腫瘤組織微環(huán)境可干擾PD-L1的表達，且在結直腸癌中PD-L1的表達與免疫治療的療效關系并不確切。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)是ICPI反應的一個已確定的生物標志物。然而, MSI-H型結直腸癌患者對ICPI的應答率也是可變的，且腫瘤應答者比無反應者具有更多的體細胞突變和更高的新抗原負荷[5], 表明需要額外的預測生物標志物。腫瘤突變負荷(TMB)是一種新興的獨立生物標志物[6-7], 即檢測腫瘤基因編碼區(qū)的突變總數，可用于分層患者對ICPI的反應可能。研究[8]發(fā)現，TMB高表達(TMB-H)肺癌患者中，ICPI組應答率高于TMB低表達(TMB-L)患者，且客觀緩解率(ORR)、無進展生存期(PFS)均顯著改善，提示高TMB與免疫治療的療效呈正相關。本研究對TMB在結直腸癌免疫治療中的療效預測價值及其臨床應用進行綜述。

1 TMB概述

基因突變分為胚系突變和體細胞突變。TMB是指腫瘤細胞基因組中所評估基因的外顯子編碼區(qū)每兆堿基中發(fā)生置換、插入、缺失突變的總數。高度突變的腫瘤被認為含有增加的新抗原負荷，使其具有免疫原性，并對免疫治療有反應[9]。在癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中，由于基因組改變導致細胞功能致病性變化，這一過程被稱為“驅動”突變，它導致了腫瘤的發(fā)生; 大量的體細胞突變可以產生新抗原，這些新抗原可被患者的免疫系統識別。新抗原的大量產生與對檢查點阻斷反應的增強相關，被認為是ICPI作用于腫瘤組織的機制[10-12]。研究[13]證實，高突變負荷和腫瘤新表位負荷是結直腸癌免疫活性的主要驅動因素。

Panda A等[14]研究提出，在癌癥基因組圖譜33種實體癌中, 8種存在突變負荷閾值，該閾值識別出具有免疫檢查點激活特征的腫瘤。突變負荷高于閾值(ICAM+)的腫瘤具有如下特征: ① 存在免疫激活，高CD8AmRNA水平、免疫浸潤證據以及白細胞中高CD8+T細胞比例; ② 可以上調免疫檢查點途徑基因表達。對黑色素瘤、肺腺癌和結腸癌等研究分析表明，ICAM+腫瘤患者對免疫檢查點治療有更好的反應。而突變負荷低于閾值的腫瘤(ICAM-)和ICAM+腫瘤具有不同的突變模式和免疫微環(huán)境，使用臨床測序分析可識別該閾值。

TMB不僅受外源性因素(如受紫外光照射、接觸有毒化學物質)的驅動，而且由編碼DNA修復機制的基因中的破壞性突變所驅動。Endris V等[15]研究顯示，發(fā)生DNA錯配修復機制缺陷的MSI-H腫瘤的TMB值范圍為10～100 Mut/Mb, 同時具有MSI-H及POLE28核酸外切酶結構域突變的癌癥TMB值大于100 Mut/Mb, 表明這些DNA修復機制有缺陷的案例可以從檢查點抑制劑治療方案中明顯獲益。

2 TMB在結直腸癌免疫治療中的療效預測及相關研究進展

目前, TMB對MSI-H mCRC的免疫治療的療效預測價值已在多項臨床研究中得到證實。Schrock AB等[16]收集了經免疫治療的22例MSI-H mCRC患者的臨床資料，用下一代測序(NGS)技術在DNA的0.8～1.1 Mbp上測定TMB, 對療效和進展時間的潛在生物標志物進行分析。他們通過單因素分析和多變量分析，發(fā)現TMB與ORR和PFS的相關性最強(P<0.001)。經統計估計TMB的最佳預測切點在37～41個突變/Mb。13例TMB-H的病例均有療效，而9例TMB-L中有6例存在病情進展。TMB-H患者的中位PFS隨訪大于18個月，而TMB-L的中位數PFS為2個月。該研究[16]還在大量MSI-H mCRC人群(821/18 140, 4.5%)中使用NGS評估TMB為37.4個突變/Mb, 與第35百分位點相對應，再一次證實了評估TMB可能有助于在MSI-H mCRC人群中進一步分層ICPI的可能應答者。

Dung T L等[17]探討了TMB和衍生的新抗原對PD-1阻斷劑敏感性的影響，結果證明ICPI治療的錯配修復缺陷型(dMMR)結直腸癌患者顯示出更高的免疫相關的ORR和PFS，高于錯配修復正常型(pMMR)的結直腸癌患者。他們分析整個外顯子的序列發(fā)現，與pMMR型相比, dMMR型腫瘤的每個體細胞突變數明顯更高。研究[18]表明，較長的PFS與大量的體細胞突變與潛在的突變相關的新抗原有關。由此可見，使用MSI-H/dMMR和TMB作為ICPI的生物標志物的原理是相似的，即存在的DNA突變越多，產生的改變肽就越多，導致新抗原被免疫系統成功識別的可能性就更高。因此, MSI-H/dMMR和具有TMB-H的腫瘤之間存在重疊[19]。

一項納入6 004例大腸癌的研究[20]用CLIA批準的CGP測序確定MSI和TMB狀態(tài)。他們根據MSI-H患者TMB分布的90%概率間隔的下限值來定義TMB-H的界值。結果顯示, 6 004例CRC患者中有302例(5.0%)觀察到MSI-H腫瘤，其中99.7%的病例均為TMB-H (范圍6.3～746.9 μt/Mb), 而其余的5 702例病例中, 5 538例(97.1%)為TMB-L(范圍0～10.8 mut/Mb)。另外，在5 702例微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS)的病例中，有164例(2.9%)被證實為TMB-H (范圍為11.7～707.2 μt/Mb), 而且在MSS/TMB-H的病例中也顯示出了對PD-1抑制劑的良好反應。結果顯示，從ICPI治療獲益的目標人群增加了54%(466人vs. 302人)。由此可見, MSI-H CRC中的TMB普遍升高，但仍然相當多變。

TMB檢測可幫助對CRC患者進行重新分類, TMB-H可能反映突變相關新抗原的存在，伴隨著腫瘤微環(huán)境中淋巴細胞浸潤的增加，即使在MSS結直腸癌中也存在這種現象[21]。極突變可導致結直腸癌的MSS表型超突變[22]。Stadler ZK等[23]的一項NGS研究證實，突變負荷增加與MSI相關，但區(qū)別于MSI腫瘤具有最高突變負荷的結直腸腫瘤都含有極突變。在Ⅰ～Ⅲ期CRC中，高達50%的MSS腫瘤具有高免疫核心，新抗原負荷升高和/或高免疫核心與較好的生存有關[21, 24]。根據Gong J等[25]研究的CRC病例結論顯示，盡管免疫組化確認為pMMR, NGS確認了MSS狀態(tài)，但TMB高的隊列對免疫治療的臨床療效較好; 高TMB和高突變表型相關分子的存在可以識別對ICPI可能有反應的MSS mCRC患者亞群。可見, TMB檢測有效地增加了符合ICPI治療的患者數量。

此外，研究[26]顯示TMB在結直腸癌患者中與化療結果具有一定相關性。在TMB-L組中，與以奧沙利鉑為基礎的化療患者相比，以伊立替康為基礎的化療患者的PFS有所改善(11.9月vs. 6.5月,P<0.001), 而在TMB-H中, 2個治療隊列間沒有差異。此項研究提出, TMB-L可能是結直腸癌患者化療結果的一個預測性生物標志物，但這些結果還需要在更大的研究中進行驗證。

3 TMB的應用現狀及其局限性

檢測TMB的具體方法為對腫瘤組織切片或血液標本進行高通量測序(HTS)。根據最新研究[27]結果，可以使用NGS測定法，用經過驗證的算法來可靠地估算TMB, 該算法可查詢足夠大的外顯子集，以替代全外顯子組測序。但TMB檢測目前仍未廣泛應用于臨床，主要的因素有: ① 高成本。全基因組、全外顯子組測序檢測時間長且價格高昂，目前在臨床應用較多的是選擇性測序，但相比免疫組化法測定MSI及PD-L1, 其消耗成本相對較大。② 不同檢測平臺標準不一。目前有多家基因檢測公司都建立了自己的 TMB檢測方案，但是每個公司的基因集合所涵蓋的基因不同，設定的閾值不同，因此目前TMB檢測的現狀無法標準化，這是無法廣泛應用于臨床最為關鍵的因素。③ 不同類型腫瘤TMB水平差異大。需要區(qū)分不同類型腫瘤的可能致病基因組[28]。Chowell D等[29]指出，由于腫瘤免疫機制及微環(huán)境尚在進一步的探索中，且基因突變產物具有免疫原性的差異，僅僅依據TMB的數值可能并不能足以準確預測免疫治療的療效，同時還取決于TMB突變的“質量”，即HLA分型。研究[30]報道，富含移碼基因突變(堿基插入或缺失)的腫瘤比含有非同義突變的腫瘤更具免疫原性。還有研究[31]提示石蠟包塊組織樣本與血液樣本檢測的TMB結果有所偏差。

總之, TMB的檢測雖然已從臨床研究逐步走向臨床應用，但仍面臨較多的問題，影響TMB表達的相關因素及如何提高其準確度、靈敏度等都需要進一步的研究。

4 總結與展望

近年來，免疫治療將結直腸癌的治療帶入了一個精準治療的時代, PD-1/PD- L1抗體可誘導惡性腫瘤的持久緩解，極大延長了疾病緩解期。然而，免疫治療在結直腸癌治療領域的總體有效率并不高，如何篩選優(yōu)勢人群更加迫切。TMB是跨多種腫瘤類型的ICPI治療結果的最新獨立預測因子。某些NGS技術從外顯子組的一個子集就能夠可靠地評估TMB, 而無需使用全外顯子測序，從而有助于在臨床采用TMB評估結腸癌患者的免疫治療療效。在結直腸癌中，雖然PD-L1和MSI-H/dMMR都已被確立為對結直腸癌患者進行分層的生物標志物，但還是不夠完美，在敏感性和特異性方面都存在缺陷。

TMB可以幫助在MSI-H患者人群中進一步篩選，并且可以在MSS/TMB-H的亞組中找到在MSI檢測中被遺漏的可能獲益的優(yōu)勢人群。雖然PD-L1檢測可以預測療效，但其在結直腸癌患者中的陽性率并不高, TMB檢測可以與之相互補充，成為評估結直腸癌患者免疫治療療效的更具包容性的生物標志物。TMB可在血液中進行測定，當腫瘤組織不可用或無法獲得時, TMB便成為優(yōu)勢生物標志物[32-35]。然而，當前TMB的檢測仍然面臨著很多挑戰(zhàn)，有待更多的前瞻性研究進一步證實。當然，除了腫瘤突變負荷外，關于免疫治療療效預測因素的研究還有非常廣闊的空間，比如腫瘤微環(huán)境中浸潤的淋巴細胞數量及種類、外周血循環(huán)標志物等，都有希望將更多的合適患者篩選出來接受免疫治療，從而獲得更低的副作用及更久的療效維持時間。