離子凝膠法制備殼聚糖納米顆粒在藥物傳遞中的應(yīng)用

金 艷 ，張桂榮，竇茜茜，陳建英 ，邊 玲，李大偉 *，賈慶文 *

（1. 山東福瑞達醫(yī)藥集團有限公司 山東省黏膜與皮膚給藥技術(shù)重點實驗室，山東 濟南 250101；2. 山東省藥學科學院，山東 濟南 250101）

糖胺聚糖是一類天然存在的線性多糖，主要包括肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素、甲殼素、透明質(zhì)酸等。殼聚糖為甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物，是唯一一種帶正電荷的糖胺聚糖，具有優(yōu)異的生物相容性，廣泛應(yīng)用為納米給藥系統(tǒng)的載體材料[1]。

目前制備殼聚糖納米粒的方法主要包括離子交聯(lián)法（離子凝膠法）、共價交聯(lián)法、沉淀法（去溶劑法/凝聚法）、乳滴聚結(jié)法、大分子復(fù)合法等[2]。離子凝膠法近年發(fā)展迅速，相較其他方法，尤其適用于包載蛋白質(zhì)/肽類、DNA、RNA、疫苗等殼聚糖納米顆粒的制備。本文對以離子凝膠法制備的殼聚糖納米顆粒在藥物傳遞中的應(yīng)用作一綜述，以冀為新型藥物傳遞系統(tǒng)的研究與開發(fā)提供參考與支持。

1 離子凝膠法制備殼聚糖納米顆粒的基本原理

離子凝膠技術(shù)制備殼聚糖納米顆粒最初由Calvo等報道[3]，此方法是基于殼聚糖在酸性介質(zhì)中所攜帶的正電荷與陰離子交聯(lián)劑的負電荷之間的靜電作用，多采用三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP）為交聯(lián)劑，反應(yīng)條件溫和，操作簡單，得到該領(lǐng)域研究者的重視，近年殼聚糖納米顆粒的制備多采用此種方法。殼聚糖和TPP的結(jié)構(gòu)分別見圖1、圖2。

圖1 殼聚糖結(jié)構(gòu)

圖2 TPP結(jié)構(gòu)

離子凝膠化過程一般包括兩個水相的混合，其中之一含殼聚糖，另一水相含TPP，兩相混合、凝聚成納米顆粒[4]。納米顆粒形成前后均可對殼聚糖進行酰化、季銨化、聚乙二醇（PEG）化、羧甲基化、半乳糖苷化、硫醇化等修飾。

2 TPP-殼聚糖納米顆粒在藥物傳遞中的應(yīng)用

2.1 用于蛋白質(zhì)藥物的傳遞

1997年，Calvo等[2]首先報道了采用該項技術(shù)制備親水性殼聚糖和殼聚糖/聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物（PEO-PPO）納米顆粒，用作蛋白質(zhì)類藥物的載體。制得的納米顆粒具有以下特征：在溫和條件下自發(fā)形成，無需高溫加熱、使用有機溶劑或超聲處理；表面攜帶正電荷，大小可調(diào)節(jié)；蛋白質(zhì)荷載量大，能在數(shù)日內(nèi)持續(xù)釋放蛋白質(zhì)；具有pH依賴性解離行為。研究發(fā)現(xiàn)，僅某些特定濃度的殼聚糖和TPP可形成納米顆粒。能形成納米顆粒的殼聚糖最大終濃度為4 mg/ml，TPP最大濃度為0.75 mg/ml。為避免形成大的團聚物，殼聚糖:TPP（m/m）不得大于15～20/1。透射電鏡（TEM）觀察顯示，殼聚糖納米顆粒具有堅固、一致的結(jié)構(gòu)，而殼聚糖/PEO-PPO納米顆粒的結(jié)構(gòu)分為兩層，內(nèi)核緊密，被厚而蓬松的外層（推測由PEO-PPO形成）包覆。包載牛血清白蛋白（BSA）納米顆粒的體外釋放研究顯示，殼聚糖/PEO-PPO納米顆粒的釋放速率大于殼聚糖納米顆粒。殼聚糖/PEO-PPO納米顆粒形成過程中，BSA與PEO-PPO競爭殼聚糖的氨基結(jié)合位點。

Li等[5]采用離子凝膠法，以TPP為交聯(lián)劑，制備了包載胰島素的殼聚糖納米顆粒。為克服口服胰島素體內(nèi)吸收的多重屏障，研究者以苯硼酸和L-纈氨酸對納米顆粒進行了修飾，其中苯硼酸為葡萄糖反應(yīng)單元，L-纈氨酸為促進胰島素小腸吸收的靶向配體。具體方法為：制備羧甲基殼聚糖，再以1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳化二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）為偶聯(lián)劑，將3-氨基苯硼酸和L-纈氨酸的氨基連接于羧甲基殼聚糖的羧基。胰島素通過與苯硼酸的疏水作用及與殼聚糖間的靜電作用包封于該納米顆粒內(nèi)。制得的載有胰島素的殼聚糖納米顆粒和空白殼聚糖納米顆粒均具有良好的細胞相容性。以異硫氰酸熒光素（FITC）對胰島素進行標記，將載有FITC-胰島素的殼聚糖納米顆粒與HT-29細胞共同孵育，共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察顯示，載有胰島素的殼聚糖納米顆粒能促進胰島素經(jīng)細胞旁路途徑透過細胞膜進入細胞，并釋放胰島素。動物實驗結(jié)果顯示口服胰島素納米顆粒的降糖效果和維持時間均優(yōu)于皮下注射胰島素。

Roger等[6]采用離子凝膠法，分別以低乙酰化度（17 %）殼聚糖與TPP、高乙?；龋?2 %）殼聚糖與TPP、海藻酸鈉與聚L-賴氨酸為原料制備了載轉(zhuǎn)化生長因子β3（TGF-β3）的納米顆粒。研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖-TPP納米顆粒的形成過程呈pH依賴性，且受控于TPP與殼聚糖量的比值。本研究中殼聚糖與TPP的濃度均為1 mg/ml，體積比為3:1。前期研究發(fā)現(xiàn)，此比值下可達到電荷分布平衡，確保形成納米顆粒[7-8]。研究結(jié)果顯示，TGF-β3可高效包封于納米顆粒，并在生理條件下釋出。釋出的TGF-β3的量足以誘導(dǎo)人間充質(zhì)基質(zhì)細胞的軟骨形成分化。

Mili等[9]以TPP為交聯(lián)劑，采用離子凝膠化技術(shù)制備了載有神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）的殼聚糖納米顆粒，并評價了其對犬骨髓間充質(zhì)干細胞（canine bone marrow derived mesenchymal stem cell，cBM-MSC）的神經(jīng)元分化潛能的影響。制得的納米顆粒粒徑為148.0±10.2 nm，zeta電位為38.7±2.5 mV；NGF包封率為60.99 %，體外動力學研究中未觀察到NGF的突釋，48 h內(nèi)保持緩慢釋放，第8天累積釋放達峰值。NGF殼聚糖納米顆粒濃度達4 mg/ml時，對cBM-MSC仍具有細胞相容性。相比于添加NGF的培養(yǎng)基，添加NGF殼聚糖納米顆粒的培養(yǎng)基能更好地將預(yù)先誘導(dǎo)的cBMMSC轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元。此外， NGF殼聚糖納米顆粒能在沒有任何化學預(yù)誘導(dǎo)的情況下實現(xiàn)cBMMSC的轉(zhuǎn)分化。結(jié)果提示NGF殼聚糖納米顆粒能釋放具有將MSC轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元能力的生物活性NGF，其在神經(jīng)組織分化中的應(yīng)用值得進一步探索。

以上多項研究表明，采用離子凝膠法制備的殼聚糖納米顆粒能有效保存包載蛋白質(zhì)藥物的活性。

2.2 用于疫苗的傳遞

離子凝膠法制備的殼聚糖納米顆粒也用于疫苗的傳遞?？乖蔬f細胞（APC），包括巨噬細胞和樹突狀細胞（DC）表面高水平表達甘露糖受體，可通過細胞膜特異性配體-受體相互作用與抗原上甘露糖殘基結(jié)合，并將其轉(zhuǎn)運至內(nèi)吞途徑，導(dǎo)致主要組織相容性復(fù)合體（MHC）表達和T細胞激活。因此，殼聚糖納米粒的甘露糖修飾可誘導(dǎo)受體介導(dǎo)的靶向APC的內(nèi)吞作用，提高抗原提呈能力和免疫功能響應(yīng)效率。布魯氏菌病是一種常見的人畜共患疾病，目前，尚未有可用于人類布魯氏菌病的疫苗上市。FliC蛋白是一種從B.melitensis16 M的蛋白質(zhì)組中通過反向疫苗學（reverse vaccinology）方法解析得到的一種新型候選疫苗[10]。Sadeghi等[11]以離子凝膠法制備了載有FliC蛋白的甘露糖修飾殼聚糖納米顆粒，作為新型布魯氏菌疫苗的傳遞系統(tǒng)，并采用BALB/c小鼠評價了FliC蛋白和FliC納米顆粒的免疫原性及保護作用。研究表明FliC和FliC納米顆粒均能顯著提高特異性IgG反應(yīng)；免疫小鼠脾細胞產(chǎn)生了高水平的干擾素γ（IFN-γ）和白介素2（IL-2）及低水平的IL-10，其中，F(xiàn)liC納米顆粒免疫小鼠IFN-γ和IL-2水平高于FliC免疫小鼠（P＜0.05）。FliC蛋白和FliC納米顆粒均能增強免疫小鼠對B.melitensis16 M和B. abortus544的保護性免疫反應(yīng)，二者作用相近。研究結(jié)果提示甘露糖修飾殼聚糖納米顆粒用作免疫佐劑和抗原傳遞系統(tǒng)，提高了FliC蛋白的免疫原性。

Sawaengsak等[12]以TPP為交聯(lián)劑，制備了殼聚糖納米顆粒（殼聚糖:TPP=1:0.6，m/m），作為經(jīng)鼻接種的流感病毒血凝素裂解（hemagglutinin-split influenza virus）疫苗的傳遞載體，并采用流感小鼠模型檢測了納米顆粒的免疫原性和保護效果。經(jīng)鼻接受兩劑納米顆粒包載疫苗的小鼠未出現(xiàn)不良癥狀。與單純流感病毒血凝素裂解疫苗相比，接受納米顆粒包載疫苗的動物產(chǎn)生了較高的全身和黏膜抗體反應(yīng)。納米顆粒包載疫苗也能誘導(dǎo)細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，表現(xiàn)為脾臟中出現(xiàn)大量IFN-γ分泌細胞，而單純疫苗無此作用。納米顆粒包載疫苗顯著減少了流感發(fā)生率，并使接種疫苗的小鼠對致死性流感病毒的攻擊有100 %的保護率。結(jié)果表明，本研究制備的殼聚糖納米顆粒是一種安全有效的流感疫苗載體/佐劑。

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（enterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）是引起人類腹瀉的重要原因，目前尚未有預(yù)防ETEC的疫苗上市。與許多革蘭陰性病原體一樣，ETEC也能分泌外膜囊泡（outer membrane vesicle，OMV），其結(jié)構(gòu)中含多種免疫原性毒力蛋白，因此可用作疫苗候選物。Noroozi等[13]以TPP為交聯(lián)劑，采用離子凝膠法制備了包載OMV的殼聚糖納米顆粒。納米顆粒呈球形，平均粒徑為532 nm，對OMV的包封率達90 %。小鼠經(jīng)口服OMV納米顆粒免疫，抑制了ETEC在小腸的定殖，誘導(dǎo)了對不耐熱腸毒素（LT毒素）抗體的產(chǎn)生。結(jié)果提示OMV納米顆粒有望開發(fā)為針對ETEC的疫苗。

2.3 用于DNA/RNA的傳輸

離子凝膠技術(shù)應(yīng)用于多種DNA/RNA納米傳遞系統(tǒng)的制備。RNA干擾（RNAi）介導(dǎo)的基因沉默為人類提供了一種新穎的治療和預(yù)防免疫缺陷病毒（HIV）感染的策略。Co等[14]設(shè)計了雙抗體[抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR）和緩激肽B2受體（bradykinin B2 receptor，B2R）抗體]修飾的殼聚糖/小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）納米顆粒，通過兩種抗體與大腦細胞表達的TfR和B2R結(jié)合，透過血腦屏障（bloodbrain barrier，BBB）靶向遞送siRNA至HIV感染的腦星形膠質(zhì)細胞，抑制HIV的復(fù)制。納米顆粒制備過程中，首先以TPP為交聯(lián)劑，以殼聚糖 [相對分子質(zhì)量（Mr）5×105]為原料，采用離子凝膠法制備載有siRNA的納米顆粒，通過EDC/硫代琥珀酰亞胺（sulfo-NHS）偶聯(lián)反應(yīng)將抗體連接至納米顆粒。制得的納米顆粒呈球形，粒徑為235.7±10.2 nm，多分散指數(shù)（PDI）為0.197±0.015，zeta電位為22.88±1.78 mV，包封率為61.9 %。體外研究顯示，該納米顆粒無明顯細胞毒性。研究發(fā)現(xiàn)，常用人血腦屏障模型——永生化人腦微血管內(nèi)皮細胞（hCMEC/D3細胞）對雙抗體結(jié)合siRNA殼聚糖納米顆粒的攝取顯著高于對未結(jié)合抗體及單抗體結(jié)合的殼聚糖納米顆粒的攝取。雙抗體結(jié)合siRNA殼聚糖納米顆粒能顯著減少人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞（U138-MG細胞）中HIV相關(guān)蛋白SART3和CycT1的表達。研究結(jié)果表明，雙配體修飾殼聚糖納米顆粒是一種提高藥物腦內(nèi)傳遞效率的有效策略。

基因沉默介導(dǎo)雙鏈siRNA作為一種基因缺陷疾病的有潛力的治療手段得到廣泛研究。然而，siRNA的降解速度快，細胞攝取差，因而阻礙了其應(yīng)用。為解決此問題，Katas等[15]以殼聚糖為載體原料，分別采用簡單復(fù)合法和離子凝膠法兩種方法制備了包載siRNA的納米顆粒。在CHO K1和HEK 293細胞中進行的體外研究顯示，離子凝膠法制備的納米顆粒的基因沉默效果明顯優(yōu)于殼聚糖-siRNA復(fù)合納米顆粒。Xiao等[16]分別采用復(fù)合凝聚法和離子凝膠法，分別以殼聚糖和N-（2-羥基）丙基-3-三甲基氯化殼聚糖銨為原料，制備載有腫瘤壞死因子α（TNF-α）siRNA的納米顆粒。兩種方法獲得的納米顆粒均顯示理想的粒徑（210～279 nm）和zeta電位（14～22 mV）。與不含TPP的納米顆粒相比，將TPP引入納米顆粒能顯著提高細胞攝取率，并相應(yīng)產(chǎn)生較高的細胞內(nèi)siRNA濃度。 RNA干擾試驗結(jié)果表明含TPP的納米顆粒下調(diào)TNF-α的mRNA表達水平至陽性對照的7.6 %～14.6 %，遠低于Oligofectamine-siRNA復(fù)合納米顆粒作用下TNF-α mRNA的表達水平。研究結(jié)果提示，TPP輔助殼聚糖納米顆粒是一種無細胞毒性的高效siRNA載體，有望用于炎癥性疾病的治療。

microRNA（miRNA）可通過抑制靶mRNA翻譯，促進其降解或參與細胞功能，包括細胞增殖，分化，凋亡和癌變來確定BM-MSC分化的方向。對miRNA的治療性抑制代表了一種潛在有效的調(diào)節(jié)干細胞分化的方法。antimiR-138是成骨細胞發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，但其在血液循環(huán)中穩(wěn)定性差、細胞攝取量低、免疫反應(yīng)不理想，限制了其在骨再生中的應(yīng)用。Wu等[17]以TPP為交聯(lián)劑，制備了殼聚糖透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）納米顆粒，并以其作為載體，將antimiR-138導(dǎo)入MSC。已有研究顯示，納米顆粒的粒徑及表面電荷對其細胞攝取和轉(zhuǎn)染效率有重要影響[18-19]，該研究制備的納米顆粒的粒徑、PDI和zeta電位與CS:TPP:HA（重量比）有關(guān)，按最優(yōu)CS:TPP:HA（1:0.15:0.1）制得的antimiR-138納米顆粒的粒徑為175.4±3.7 nm，zeta電位為35.0±4.7 mV，PDI為0.203±0.015。殼聚糖氨基與miRNA磷酸基最佳摩爾比為20:1，按此比例制得的antimiR-138納米顆粒對MSC無細胞毒性作用，可成功傳染MSC，轉(zhuǎn)染率接近70 %，并使MSC的成骨能力明顯增強。以上結(jié)果表明殼聚糖納米顆粒是一種有效的非病毒miRNA載體，可用于調(diào)節(jié)MSC的成骨分化。

腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制因子能促進腫瘤生長，抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。腺嘌呤核苷（adenosine）是一種由腫瘤及免疫細胞分泌的重要的免疫抑制因子，阻斷腺嘌呤核苷的產(chǎn)生已被認為是一種有效的腫瘤治療措施。腺嘌呤核苷是在兩種細胞表面分子CD39/CD73的協(xié)同作用下由ATP轉(zhuǎn)化而成，基于此，Jadidi-Niaragh等[20]將CD-73小干擾RNA（CD73-SiRNA）包封于以TPP為交聯(lián)劑制得的殼聚糖納米顆粒，用以抑制乳腺癌細胞中CD73分子的表達。結(jié)果顯示，以Mr5×104的殼聚糖為原料制備的納米顆粒的理化性質(zhì)最優(yōu)，且SiRNA包封率高。殼聚糖分子能與SiRNA完全結(jié)合，保護其不被血清和肝素降解，并促進其轉(zhuǎn)染。CD73-SiRNA殼聚糖納米顆粒能有效抑制CD73的表達，可作為一種有前景的治療工具進行深入研究。

2.4 用于小分子藥物的傳輸

采用離子凝膠技術(shù)制備的殼聚糖納米顆粒也用于小分子藥物的傳輸。Bhattacharya[21]采用離子凝膠化技術(shù)，開發(fā)了一種伊馬替尼（Imatinib，BCS I類藥物）殼聚糖[Mr（2～3）×105]納米顆粒，并采用中心組合設(shè)計（central composite design，CCD）優(yōu)化了制備工藝。按最優(yōu)工藝條件制得的納米顆粒粒徑為208±0.01 nm，zeta電位為-32.56±0.03 mV，體外藥物80 h累積釋放率達86.45 %±0.05 %，藥物包封率達68.52 %±0.01 %。體外細胞毒性試驗結(jié)果顯示相較于未包封伊馬替尼，包封于殼聚糖納米顆粒的伊馬替尼顯示了較高的、可控的細胞毒性。細胞毒組織病理學評價顯示該納米顆粒未造成組織損傷，也證明了其靜脈給藥路線的安全性。

研究者致力于開發(fā)新的藥物傳遞系統(tǒng)，以克服阿霉素（doxorubicin）口服生物利用度低的問題。Zare等[22]以TPP為交聯(lián)劑，采用離子凝膠法制備了阿霉素殼聚糖納米顆粒。制得的納米顆粒平均粒徑為150±10 nm，包封率和裝載率分別為40 %，23 %。約30 %裝載的藥物在6 h內(nèi)釋放，其余藥物釋放速度趨緩。采用大鼠腸囊技術(shù)測定了裝載于殼聚糖納米顆粒的阿霉素的腸道滲透性，結(jié)果顯示，包封于殼聚糖納米顆?？墒拱⒚顾啬c道滲透性提高約90 %。研究提示殼聚糖納米顆?？赡苁且环N安全的阿霉素口服傳遞系統(tǒng)。

Gupta等[23]以TPP為交聯(lián)劑，制備了載有吉非替尼的殼聚糖納米顆粒，并研究了殼聚糖濃度、TPP濃度、TPP用量等關(guān)鍵參數(shù)對納米顆粒粒徑、zeta電位、產(chǎn)率、包封率、藥物含量、體外藥物釋放等性質(zhì)的影響。吉非替尼加入量250 mg，殼聚糖濃度0.1 %（w/v），TPP濃度0.2 %（w/v），用量10 ml，獲得的納米顆粒性質(zhì)最優(yōu)：粒徑123.8 nm，PI為0.247，zeta電位30.4 mV，產(chǎn)率68.09 %，藥物含量74.32 %，包封率70.52 %，24 h體外藥物釋放度56.2 %。體外釋藥分析顯示納米顆?？蓪崿F(xiàn)吉非替尼的緩釋。

為減少抗肺結(jié)核藥物的服用劑量和頻次，藉以減輕一線抗結(jié)核藥物的不良反應(yīng)，Rawal等[24]采用離子膠凝法，以利福平（rifampicin）為模型藥物，制備了包載利福平的納米顆粒，經(jīng)凍干制得吸入粉劑。按優(yōu)化后工藝制得的納米顆粒粒徑為124.1 nm，包封率為72 %。制得的納米顆粒制劑在加速試驗條件下（40±2 ℃，相對濕度75 %±5 %）不穩(wěn)定。體外釋放研究顯示純利福平制劑在12 h內(nèi)釋放達100 %，納米顆粒制劑中利福平在24 h內(nèi)緩慢釋放，累積釋放率約90 %，這與其在肺中的長期滯留和緩慢清除相吻合。體內(nèi)外毒性研究顯示納米顆粒吸入粉劑幾乎無任何毒性?？傊褂脷ぞ厶羌{米顆?？蓪崿F(xiàn)利福平的有效遞送，為開發(fā)治療肺結(jié)核的新型藥物開辟了新途徑。

Hassan等[25]以谷氨酸為模型藥物，采用離子凝膠法，以TPP為交聯(lián)劑，制備了包封谷氨酸的殼聚糖納米顆粒。最佳工藝條件為：殼聚糖（pH 5）濃度0.5 mg/ml，用量600 μl，TPP（pH 2）濃度0.7 mg/ml，用量250 μl。在人腎癌細胞（786-O細胞）中進行的細胞毒性實驗結(jié)果顯示按最佳工藝制備的殼聚糖納米顆粒毒性較低，這一觀察結(jié)果進一步證明了殼聚糖納米顆粒作為藥物載體的可行性和適用性。包封了FITC標記谷氨酸的殼聚糖納米顆粒與786-O 細胞共孵育24 h后，觀測到細胞內(nèi)明顯的綠色熒光，而用FITC標記谷氨酸處理24 h的786-O 細胞內(nèi)則未觀測到熒光信號。未來的研究方向是將殼聚糖納米顆粒與特定的靶向配體結(jié)合，將有利于包載藥物的體內(nèi)靶向傳遞和釋放。

3 其他陰離子交聯(lián)劑的使用

亦有采用其他陰離子交聯(lián)劑制備殼聚糖納米顆粒的研究見諸報道，所采用的交聯(lián)劑多為多聚磷酸鹽。Abdelgawad等[26]嘗試用六偏磷酸鹽（HMP）代替TPP，用作殼聚糖納米顆粒制備中的交聯(lián)劑，并將其與TPP的交聯(lián)效果進行對比。殼聚糖/TPP納米顆粒的平均粒徑小于殼聚糖/HMP納米顆粒；殼聚糖/HMP納米顆粒的zeta電位高于殼聚糖/TPP納米顆粒。二者的最佳反應(yīng)基質(zhì)pH均為5。殼聚糖的濃度增大可提高納米顆粒的zeta電位，從而提高納米顆粒的穩(wěn)定性。以BSA為模型蛋白考察兩種納米顆粒的包封率，殼聚糖/HMP納米顆粒的包封率高于殼聚糖/TPP納米粒顆粒（96.3 %vs91.87 %）。然而，TPP交聯(lián)納米顆粒的穩(wěn)定性優(yōu)于HMP交聯(lián)納米顆粒。Kiilll 等[27]以HMP為交聯(lián)劑，采用離子凝膠化技術(shù)制備了載有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-纈氨酸環(huán)肽（cRGDfV）的殼聚糖納米顆粒，并研究了殼聚糖及HMP濃度對納米顆粒粒徑、zeta電位、形態(tài)及包封率的影響，確定納米顆粒含2.0 %（w/v）殼聚糖和0.6 %（w/v）HMP為佳。此條件下制得的納米顆粒平均粒徑為166 nm，zeta電位為38.7 mV，掃描電鏡（SEM）/原子力顯微鏡（AFM）下觀察呈球形，包封率達97.0 %±2.4 %。細胞毒性檢測顯示該納米顆粒無細胞毒性或毒性極低，適用于蛋白質(zhì)/肽類的傳遞。

Sang等[28]分別以TPP、肌醇六磷酸（phytic acid，PA）和HMP 3種磷酸鹽為交聯(lián)劑制備了殼聚糖納米顆粒，并對其藥物包封率、體外藥物釋放行為、黏膜黏附性和細胞毒性進行了評價。研究結(jié)果顯示高濃度H+會阻礙以TPP為交聯(lián)劑的納米顆粒的形成（最適宜的初始CS溶液pH為4.0～5.0），但會促進另兩種納米顆粒的形成。3種納米顆粒均顯示了良好的生物相容性和生物黏附性。以PA和HMP為交聯(lián)劑的納米顆粒對楊梅黃酮的包封率高于以TPP為交聯(lián)劑納米顆粒的包封率，體外藥物釋放速率則呈相反趨勢。此外，以PA為交聯(lián)劑的納米顆粒顯示了強黏膜黏附性。

Taghizadeh等[29]以檸檬酸鈉為交聯(lián)劑，采用離子凝膠化法制得殼聚糖納米顆粒，并采用X射線衍射（XRD）、傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、TEM技術(shù)對納米顆粒進行了表征。其zeta電位為25±5.64 nm，PDI為0.387。制得的納米顆?？蓪崿F(xiàn)倍他米松和四環(huán)素的緩釋。兩種藥物在pH 4.8介質(zhì)中的釋放度均遠高于在pH 7.4 介質(zhì)中的釋放度。

4 與其他制劑技術(shù)相結(jié)合

近年，有研究將兩種或多種制劑技術(shù)相結(jié)合，制備復(fù)合制劑，以結(jié)合兩種或多種劑型的優(yōu)勢，規(guī)避單一劑型的缺點。Ameeduzzafar等[30]嘗試將納米顆粒和原位凝膠這兩種劑型相結(jié)合，制備殼聚糖納米顆粒原位凝膠，以延長左氧氟沙星在角膜表面的保留時間。研究者首先采用離子凝膠化技術(shù)，以TPP和殼聚糖（Mr1.2×105，脫乙酰度85 %）為原料制備了包封左氧氟沙星的納米顆粒，然后與海藻酸鹽和羥丙基甲基纖維素（HPMC）水溶液相混合，制得原位凝膠。雞胚尿囊膜試驗和角膜組織病理學檢測表明納米顆粒原位凝膠無刺激性，眼科局部使用安全。與左氧氟沙星溶液相比，納米顆粒原位凝膠對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性較高。與左氧氟沙星溶液相比，該納米顆粒原位凝膠系統(tǒng)明顯延長了左氧氟沙星在角膜表面的保留時間。以上結(jié)果表明，該納米顆粒原位凝膠系統(tǒng)是一種有效的左氧氟沙星眼用給藥載體。

Wen等[31]采用同軸靜電紡技術(shù)，以BSA為模型蛋白，制備了一種新型結(jié)腸特異性核-殼結(jié)構(gòu)納米膜。其核心層為采用TPP為交聯(lián)劑制得的載有BSA的殼聚糖納米顆粒，外殼層為以海藻酸鈉和PEO為原料制備的同軸靜電膜。體外釋放研究顯示納米膜中包載的BSA約75 %在模擬結(jié)腸液中釋放，BSA的釋放機制較復(fù)雜，主要機制為納米膜的侵蝕。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和圓二色譜（CD）分析結(jié)果提示納米膜中釋放的BSA仍保持較完整的結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明本研究制得的納米纖維是一種有潛力的結(jié)腸特異性生物活性蛋白控釋傳遞系統(tǒng)。

為減輕難溶性抗癌藥物紫杉醇（paclitaxel，PTX）的不良反應(yīng)，Ye等[32]首先采用2, 6-二-O-甲基-β-環(huán)糊精[(2, 6-di-O-methyl)-β-cyclodextrin，DM-β-CD)]為原料，制備了PTX/DM-β-CD包合物，然后采用離子凝膠法，制得包載PTX/DM-β-CD包合物的殼聚糖納米顆粒。制得的納米顆粒粒徑為323.9～407.8 nm，zeta電位為15.9～23.3 mV。體外釋放研究顯示，該納米顆粒實現(xiàn)了PTX的緩釋。體內(nèi)藥動學研究結(jié)果提示與參比制劑（Taxol?）相比，包載PTX/DM-β-CD包合物的殼聚糖納米顆粒的AUC0→24h和平均駐留時間（mean residence time，MRT）分別提高了2.7倍和1.4倍。因此，此種新型納米顆粒可作為一種具有生物相容性的、可生物降解的藥物載體，顯著增強包括PTX在內(nèi)的難溶性藥物的傳遞和緩釋，從而提高藥物療效，減輕不良反應(yīng)。

5 結(jié)論與展望

離子凝膠法因具有反應(yīng)條件溫和、無需使用有機溶劑、操作簡單等優(yōu)勢，近年發(fā)展迅速，已有多項采用離子凝膠法制備以殼聚糖或殼聚糖衍生物為主要載體材料的納米顆粒的研究見諸報道，其所包載的藥用成分涵蓋蛋白質(zhì)/肽、DNA/RNA、疫苗及小分子化學藥物等。離子凝膠法制備的殼聚糖納米顆粒能有效保存包載生物大分子的活性，實現(xiàn)藥物的緩慢釋放，對殼聚糖或納米顆粒進行特定修飾，可實現(xiàn)藥物在體內(nèi)的靶向傳遞。目前，已有納米顆粒與其他制劑技術(shù)相結(jié)合的復(fù)合制劑技術(shù)出現(xiàn)，以結(jié)合其他劑型的優(yōu)勢，規(guī)避單一劑型的缺陷，這是該技術(shù)的未來發(fā)展趨勢之一。除TPP外其他陰離子交聯(lián)劑的探索，是該技術(shù)的另一發(fā)展方向。