基于HPLC-MS測(cè)定淚液中小分子化學(xué)成分的研究進(jìn)展

仲 潔，于艷梅

（1. 禹城市人民醫(yī)院眼科，山東 禹城 251200；2. 濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 濟(jì)南 250102）

淚液是一種可通過簡(jiǎn)單非侵入性方式收集的生物液體。與汗液或唾液相比，淚液不易受到環(huán)境污染。淚液能潤(rùn)滑角膜上皮細(xì)胞和組織，并反映人體生理狀態(tài)。由于淚液體積小、樣品濃度低，淚液小分子化學(xué)成分的測(cè)定研究對(duì)分析儀器檢測(cè)水平提出了較大挑戰(zhàn)[1-8]。高效液相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用（HPLC-MS）有高靈敏度、高通量、高精確度和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢(shì)，已廣泛用于動(dòng)物、植物等微量樣品的分析和鑒定工作[9-14]。

與血液樣品相比，淚液采集創(chuàng)傷小，樣品復(fù)雜程度低。淚液作為血漿樣品的替代物可用于檢測(cè)治療藥物濃度。近年，基于HPLC-MS測(cè)定眼科局部給藥、口服給藥和胃部注射給藥后淚液中外源性藥物濃度的研究工作已有報(bào)道[15-23]。然而，相比血液樣品，研究者對(duì)淚液中外源性藥物的定量分析研究相對(duì)較少。另外，機(jī)體的生理狀態(tài)與淚液內(nèi)源性小分子化學(xué)成分的組成有相關(guān)性[3]。目前，淚液中類固醇、脂質(zhì)及多肽等內(nèi)源性小分子化學(xué)成分的測(cè)定也僅有少量報(bào)道[24-30]。

1 外源性藥物的檢測(cè)

1.1 眼科局部給藥

眼科局部給藥是治療眼科疾病常用的給藥方式。貝西沙星（besifloxacin）是治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的第四代廣譜氟喹諾酮類藥物。Su等[15]以Sepax GP苯基柱為分離柱，建立了基于HPLC-MS/MS快速、靈敏和高選擇性地定量測(cè)定兔血漿、淚液、房水、結(jié)膜和角膜中besifloxacin的新方法。采用電噴霧離子（ESI）源和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）的正離子模式，以那格列奈（nateglinide）為內(nèi)標(biāo)物，建立besifloxacin的分析方法。其中besifloxacin的監(jiān)測(cè)躍遷為394.2→377.1，內(nèi)標(biāo)物的監(jiān)測(cè)躍遷為318.3→166.1。血漿樣品中besifloxacin在0.103～206 ng/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，淚液、房水、結(jié)膜和角膜樣品中besifloxacin在2.06～2060 ng/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。該方法成功地應(yīng)用于單次及多次局部給藥后兔血漿及眼組織中besifloxacin的藥動(dòng)學(xué)研究。

由于環(huán)孢菌素A（cyclosporine A）水溶性低，其眼科給藥劑型受到較多關(guān)注。一種新型的水溶性cyclosporine A前藥用于治療干眼疾病[16]。研究表明，此前藥制劑有良好的眼耐受性，對(duì)基礎(chǔ)淚液產(chǎn)生無影響，并維持眼表特性不變。為了研究水溶性cyclosporine A 前藥和cyclosporine A水包油乳劑的藥動(dòng)學(xué)差異，建立了一種基于超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-MS/MS）測(cè)定cyclosporine A含量的方法，證明水溶性cyclosporine A 前藥和cyclosporine A水包油乳劑在15 min至48 h之間具有相似的藥動(dòng)學(xué)過程。Cyclosporine A前藥能滲透到眼內(nèi)其他組織，在眼前段和后段的組織中均達(dá)到治療濃度水平，且cyclosporine A前藥比乳劑具有更高的生物利用度和更低的消除率。

第二代氟喹諾酮衍生物氧氟沙星（ofloxacin）是目前治療和預(yù)防動(dòng)物和人類眼表感染最常用的藥物之一。眼科藥物緩釋系統(tǒng)能提高眼科疾病治療療效，同時(shí)減少副作用和用藥頻率。為了比較新型眼科ofloxacin緩釋裝置與傳統(tǒng)ofloxacin滴眼液給藥方式的差異，首次建立了一種HPLC-ESI-MS/MS法測(cè)定兔眼淚中ofloxacin含量的方法[17]。該方法結(jié)果可靠、重現(xiàn)性好，已經(jīng)成功應(yīng)用于ofloxacin新型聚合物植入式裝置與常規(guī)眼用制劑的藥動(dòng)學(xué)比較研究。與傳統(tǒng)ofloxacin滴眼劑相比，新型裝置可調(diào)節(jié)ofloxacin的釋放速度，提高其在眼內(nèi)的生物利用度。為了增加氯替潑諾（loteprednol etabonate）在眼表的滯留量，改善眼內(nèi)組織的藥物輸送，Glogowski等[18]研制了一種治療眼部炎癥的新型凝膠制劑。結(jié)果表明，這種凝膠制劑能延長(zhǎng)兔眼表面loteprednol etabonate的滯留時(shí)間，并能將該藥物輸送至眼前段組織如兔結(jié)膜、角膜和虹膜睫狀體等。人和兔眼淚液中l(wèi)oteprednol etabonate在24 h內(nèi)均維持在可測(cè)量水平。

Besifloxacin、cyclosporine A、ofloxacin和loteprednol etabonate 4種藥物均采用反相LC-MS/MS進(jìn)行定量分析研究。對(duì)于含有極性功能基如多羥基、氨基或羧基的待檢測(cè)藥物，這些成分可能在反相色譜保留較弱，因此可選擇一些極性色譜固定相開展淚液樣品的分析研究。納他霉素（natamycin）是一種多羥基的大環(huán)內(nèi)酯類化合物。Bhatta等[19]以氰基柱（100 mm×2 mm，3 μm）為色譜分離柱，首次建立了一種基于HPLC-MS/MS高選擇性和高靈敏度地測(cè)定兔眼淚液中natamycin含量的方法。采用ESI源和MRM的負(fù)離子模式，以兩性霉素B （amphotericin B）為內(nèi)標(biāo)物，建立natamycin的分析方法。Natamycin在25～800 ng/ml濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，檢測(cè)限為12.5 ng/ml。本方法成功地用于natamycin滴眼液在新西蘭兔眼淚液的藥動(dòng)學(xué)研究。奧洛他定（olopatadine）是一種含有羧基和叔胺片段的小分子藥物。Maksi? 等[20]以酰胺柱（100 mm×2.1 mm, 1.7 μm）為色譜固定相發(fā)展了一種親水作用液相色譜（HILIC）-MS/MS法測(cè)定人淚液中olopatadine含量的方法。該方法有靈敏度高、選擇性好、樣品制備簡(jiǎn)單和色譜運(yùn)行時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，可用于人淚液中olopatadine的藥動(dòng)學(xué)評(píng)價(jià)。

1.2 口服給藥

口服給藥是疾病治療中常用的給藥方式，有給藥方式簡(jiǎn)便、不直接損傷皮膚或黏膜的優(yōu)點(diǎn)。部分研究發(fā)展了口服給藥后淚液中小分子藥物成分的分析方法。Hirosawa等[21]利用超高速LC-MS/MS快速、高靈敏地測(cè)定了人淚液和血漿中的非甾體抗炎藥物布洛芬（ibuprofen）和洛索洛芬（loxoprofen）的濃度。這是在淚液中檢測(cè)非甾體抗炎藥物的首次報(bào)道。兩種藥物在淚液和血漿中的回收率分別為96.0 %～117.0 %和99.0 %～105.7 %，并在0.02～1.0 μg/ml（淚液）和0.1～5.0 μg/ml（血漿）的濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。該檢測(cè)方法僅需10 μl淚液和20 μl血漿即可完成定量分析，因此在臨床和毒理學(xué)分析中具有較好應(yīng)用前景。

Sebbag等[22]采用HPLC-MS/MS法測(cè)定了淚液中強(qiáng)力霉素（doxycycline）的含量，并比較了口服給藥后Schirmer試紙和聚乙烯醇縮醛海綿兩種收集裝置采集的淚液中定量分析doxycycline的精密度。結(jié)果表明，doxycycline在貓淚液中濃度達(dá)45.1～900.7 ng/ml，犬淚液中濃度達(dá)45.4～632.0 ng/ml。與聚乙烯醇縮醛海綿相比，Schirmer試紙收集淚液方式有更高精密度。因此，Schirmer試紙是定量分析淚液中doxycycline的良好選擇。

1.3 注射給藥

Shiokawa等[23]首次報(bào)道了基于氨基鍵合固定相的HILIC-MS/MS高通量定量分析人眼淚和血漿中替加氟（tegafur）和5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil）的新方法。他們采用大氣壓化學(xué)電離和MRM監(jiān)測(cè)的負(fù)離子模式，以5-chlorouracil為內(nèi)標(biāo)物，建立tegafur和5-fluorouracil的分析方法。淚液和血漿樣品中藥物在0.04～4.0 μg/ml濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。本方法成功地用于臨床樣品中tegafur和5-fluorouracil的高通量分析。

2 內(nèi)源性小分子化學(xué)成分的檢測(cè)

2.1 類固醇類

干眼癥是一種多因素眼表疾病，有研究表明類固醇類組分對(duì)眼表有保護(hù)作用。為了探討干眼癥與淚液中類固醇水平的關(guān)系，Pieragostino等[24]建立了一種穩(wěn)定、特異、選擇性地同時(shí)定量分析淚液中皮質(zhì)醇（cortisol）、皮質(zhì)酮（corticosterone）、11-脫氧皮質(zhì)醇（11-deoxycortisol）、4-雄烯酮-3, 17-二酮（4-androstene-3, 17-dione）、睪丸激素（testosterone）、17α-羥孕酮（17α-hydroxyprogesterone）和黃體酮（progesterone）的方法。結(jié)果表明，干眼病患者中cortisol、11-deoxycortisol、4-androstene-3, 17-dione和17α-hydroxyprogesterone的含量明顯低于對(duì)照組。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，表明此法對(duì)干眼病有良好的預(yù)測(cè)能力。因此，淚液可用于研究眼部的病理生理狀態(tài)。

Gibson等[25]開發(fā)了一種UPLC-高分辨率（HR）-MS技術(shù)同時(shí)測(cè)定14種性類固醇標(biāo)準(zhǔn)品的方法。此法測(cè)定人淚液中progesterone、androsterone glucuronide（雄甾酮葡萄糖醛酸）和5α-雄甾烷-3α,17β-二醇（5α-androstane-3α,17β-diol）的含量。由于淚液體積小且性類固醇濃度低，因而需混合淚液樣品才能獲得足夠的樣品量進(jìn)行分析。

2.2 脂質(zhì)類

Schnur等[26]采用薄層色譜法、酶法和質(zhì)譜法對(duì)淚液中脂質(zhì)成分進(jìn)行分析和鑒定。根據(jù)酶分析，含膽堿的脂類、甘油三酯和膽固醇酯的濃度分別為48±14，10±0和21±18 μmol/L。UPLC-飛行時(shí)間（TOF）-MS分析表明，極性脂類磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺占所有鑒定脂類的88 %±6 %。從生理學(xué)角度分析這些脂質(zhì)成分，揭示了淚液中脂質(zhì)的功能作用，為眼表疾病的治療提供了新途徑。Dean等[27]采用HPLC-MS鑒定了刺激性人眼淚中的磷酸膽堿脂質(zhì)化合物，并證明了淚液中高質(zhì)量數(shù)、完整的磷脂酰膽堿為淚液脂質(zhì)蛋白的天然配體。

2.3 多肽和氨基酸類

內(nèi)源性肽是生物學(xué)過程分析的重要指標(biāo)。淚膜含有淚腺/黏膜細(xì)胞釋放的蛋白質(zhì)和多肽，包括參與抵抗外源性病原體的抗微生物肽。但是，鑒定淚液中多肽含量的報(bào)道較少。Elortza等[28]采用不同的裂解方法碰撞誘導(dǎo)裂解（CID）、電子轉(zhuǎn)移離解（ETD）和高能誘導(dǎo)裂解（HCD）分別從淚液中鑒定了157，131和122個(gè)肽，共鑒定234個(gè)不同的肽，是迄今為止最大的淚液內(nèi)源性多肽數(shù)據(jù)集。此法有望應(yīng)用于不同的生物體液中，以鑒定和發(fā)現(xiàn)具有其他生物學(xué)功能的多肽，如細(xì)胞保護(hù)、抗炎或傷口愈合等，從而拓寬此法的應(yīng)用范圍。

Nakatsukasa等[29]采用HPLC-ESI-MS/MS分析了人淚液中23種氨基酸組成。結(jié)果表明，氨基酸組成聚類分析能明確區(qū)分嚴(yán)重眼表疾病和非眼表疾病。與非眼表疾病組相比，嚴(yán)重眼表疾病組?；撬?、L-蛋氨酸和精氨酸的相對(duì)含量較低，表明眼表疾病狀況可能與氨基酸變化有密切關(guān)系。

2.4 維生素類

Khaksari等[30]采用HPLC-MS法測(cè)定嬰兒及母親淚液及血清中水溶性和脂溶性維生素的水平。樣本來自于15個(gè)家庭，每對(duì)包括1個(gè)4個(gè)月大的嬰兒和1位哺乳期母親，比較每個(gè)受試者的眼淚和血清之間及嬰兒和母親之間的維生素濃度差異。結(jié)果表明，水溶性的維生素B1，B2，B3（nicotinamide），B5，B9和脂溶性維生素E（α-tocopherol）在淚液和血清中均能檢測(cè)到，然而脂溶性維生素A（retinol）僅在血清中檢測(cè)到。該工作首次實(shí)現(xiàn)了維生素 A、B和E的同時(shí)檢測(cè)，并明確了淚液和血清中維生素濃度之間的相關(guān)性。因而，淚液能充分反映血清中維生素水平，加快維生素缺乏癥的診斷速度。

3 淚液樣品制備

淚液是唯一可輕易獲得的非侵入性的樣品基質(zhì)。淚液可通過Schirmer試紙[15,17,18,20,22,24-25,30]、聚乙烯醇縮醛海綿[22]和刻度毛細(xì)管[16,19,21,23,26-29]（玻璃或塑料）等方式收集。Raju等[31]概述了常見的淚液收集技術(shù)，強(qiáng)調(diào)標(biāo)準(zhǔn)化的取樣時(shí)間和體積對(duì)獲得重復(fù)性結(jié)果非常重要。由于操作簡(jiǎn)單，較多研究工作采用 Schirmer試紙收集淚液，個(gè)別采用聚乙烯醇縮醛海綿收集。收集淚液后，常采用高速離心或者甲醇洗脫。Schirmer試紙和聚乙烯醇縮醛海綿收集淚液的缺點(diǎn)是滲透到試紙/海綿上的淚液體積很難準(zhǔn)確測(cè)定，小分子化學(xué)成分的回收率也無法保證。采用玻璃或塑料毛細(xì)管直接取樣可提供準(zhǔn)確的小體積樣品，采用小體積流動(dòng)相稀釋并離心后，上清直接質(zhì)譜進(jìn)樣或經(jīng)固相萃取步驟再進(jìn)行HPLC-LC分析。毛細(xì)管直接取樣避免了從支撐材料中不完全萃取分析物的潛在風(fēng)險(xiǎn)。不論是采用Schirmer試紙/聚乙烯醇縮醛海綿取樣，還是采用毛細(xì)管取樣均應(yīng)避免刺激眼睛，防止淚液的過多分泌而稀釋淚液中小分子化學(xué)成分的濃度。

4 展望

淚液體積小、濃度低，是測(cè)定淚液小分子化學(xué)成分過程中的難點(diǎn)，極大地限制著淚液在藥物濃度監(jiān)測(cè)和代謝組學(xué)方面的研究工作。另外，即便采用毛細(xì)管能準(zhǔn)確測(cè)定淚液體積，然而在質(zhì)譜分析前，仍不可避免地稀釋淚液樣品，引起小分子化學(xué)成分濃度下降。發(fā)展淚液樣品在線預(yù)處理-微柱LCMS/MS新技術(shù)可能提高淚液小分子化學(xué)成分的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度，從而豐富淚液的研究手段，擴(kuò)寬淚液的研究范圍。