感染性疾病實(shí)驗(yàn)診斷實(shí)用技術(shù)—免疫層析試驗(yàn)

廖遠(yuǎn)泉

作者單位：242500 安徽宣城，安徽省涇縣醫(yī)院檢驗(yàn)科

2019 年底，湖北武漢出現(xiàn)新型冠狀病毒肺炎，后證實(shí)是由新型冠狀病毒（2019-nCoV）感染導(dǎo)致［1］。2019-nCoV可經(jīng)呼吸道飛沫、密切接觸傳播，目前已知的傳染源主要是2019-nCoV 感染患者和病毒攜帶者［2-3］。臨床實(shí)驗(yàn)室診斷新冠肺炎主要采用核酸檢測技術(shù)，但該方法成本較高，有一定局限性，所以研究和探討新的診斷檢測方法十分必要。

本文參考日本國際醫(yī)療福祉大學(xué)熱海醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部谷直人教授的原著《抗原檢出用迅速キットの有用性と使用上の留意點(diǎn)》［4］進(jìn)行全文編譯，希望能夠借他山之石為“抗疫”工作者和臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)醫(yī)師提供參考資訊和科研思路。亦希望檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)不斷地創(chuàng)新，可以為臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展以及2019-nCoV 的快速實(shí)驗(yàn)診斷插上翅膀［5-6］。

1 感染性疾病實(shí)驗(yàn)診斷的實(shí)用技術(shù)—免疫層析試驗(yàn)

近年來，在臨床檢查手段多樣化的趨勢下，即時(shí)檢驗(yàn)（point-of-care-testing，POCT）備受關(guān)注。POCT 是在患者身旁，醫(yī)護(hù)工作者應(yīng)用便攜式儀器和診斷試劑實(shí)施的臨床檢測，其最大的優(yōu)點(diǎn)是可在臨床現(xiàn)場快速獲得檢測結(jié)果報(bào)告，從而可以縮短決定治療方案的時(shí)間，并根據(jù)POCT 的檢測結(jié)果快速采取治療措施。單純尋求臨床現(xiàn)場緊急檢查的時(shí)代已經(jīng)過去，感染性疾病的快速診斷和在家檢查等亦擴(kuò)展為臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的一個(gè)分支范疇。

作為可應(yīng)用于“門診診療”或“常規(guī)設(shè)施”概念納入快速診斷技術(shù)的理想條件是：① 判定檢測結(jié)果所需時(shí)間短（數(shù)十分鐘之內(nèi)）；② 實(shí)驗(yàn)操作簡便；③ 不需要特殊的儀器設(shè)備；④ 可用肉眼判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果；⑤ 標(biāo)本采集容易；⑥ 檢測前樣本不需要預(yù)處理；⑦ 敏感度及特異度符合試驗(yàn)要求。

就POCT 而言，抗原抗體反應(yīng)所采用的免疫層析試劑盒檢測基本可以滿足上述要求。該方法在初級(jí)衛(wèi)生保健等實(shí)地醫(yī)療現(xiàn)場能夠直接獲得必要的診療相關(guān)檢測數(shù)據(jù)，是在診所或醫(yī)生辦公室可以利用的有效工具。目前，免疫層析技術(shù)的應(yīng)用已進(jìn)入臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域并擴(kuò)展到感染性疾病、心肌標(biāo)志物、激素、腫瘤標(biāo)志物、藥物濃度、過敏等的臨床檢測。

免疫層析試劑盒在感染性疾病快速診斷中的應(yīng)用見表1。感染性疾病快速診斷試劑盒對(duì)于感染性疾病的診斷結(jié)果可能出現(xiàn)無法明確解讀的情況。但也有可能作為明確診斷典型病例十分有用的信息。在“門診診療”乃至“平時(shí)的常規(guī)診療”中發(fā)揮了重要作用。

表1 免疫層析試劑盒在感染性疾病快速診斷中的應(yīng)用

2 感染性疾病快速診斷試劑盒的臨床實(shí)用性

2.1 感染性疾病的臨床快速檢測 引起感染性疾病的病原體在初診階段就必須予以明確診斷。因此，在診療時(shí)間內(nèi)病原微生物檢查的快速檢測結(jié)果對(duì)于感染性疾病的初期治療十分重要。為適應(yīng)這一需求，感染性疾病快速診斷試劑盒的開發(fā)和研制成果頗豐。

POCT 中感染性疾病快速診斷試劑盒檢測所需時(shí)間或等候檢測時(shí)間（turn around time，TAT）與感染性疾病病原體細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)所需的時(shí)間相比明顯縮短，并且其檢驗(yàn)結(jié)果可以直接應(yīng)用于臨床治療。病原體抗原的檢出時(shí)間可縮短至數(shù)十分鐘以內(nèi)，實(shí)用性較強(qiáng)?？焖僭\斷試劑盒的代表是應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)-免疫層析試驗(yàn)的臨床檢驗(yàn)方法。目前，感染性疾病快速診斷的相關(guān)試劑盒已被開發(fā)并應(yīng)用于臨床現(xiàn)場的檢查，如對(duì)流行性感冒（流感）的檢測試劑盒已開始應(yīng)用，其他如社區(qū)獲得性肺炎、小兒感染性疾病、性傳播疾病（sexually transmitted disease，STD）等的快速診斷試劑盒也在日本的城市醫(yī)藥商場有售。

2.2 感染性疾病快速診斷試劑盒的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀

2.2.1 流感 流感等傳染性強(qiáng)的感染性疾病應(yīng)該迅速獲得檢測結(jié)果，以制定早期防止其傳播的策略。為預(yù)防流感的流行，防患于未然，也強(qiáng)調(diào)了實(shí)驗(yàn)檢測的快速性。流感快速診斷試劑盒可以檢測出流感病毒的A、B 型，操作時(shí)只需滴下試劑，大約10～15 min 即可得到檢測結(jié)果，而且可依據(jù)顯色帶上的著色情況判讀結(jié)果，方法簡便，其實(shí)用性也獲得很高的評(píng)價(jià)。流感的快速診斷決定了抗流感病毒藥物的處方，有利于流感的治療。目前在日本已有多種流感病毒快速診斷試劑盒出售，但在流感流行前期試劑盒需求量的急增往往導(dǎo)致庫存短缺，一時(shí)難以獲得。應(yīng)用免疫層析試驗(yàn)檢測流感病毒抗原，不僅在公立醫(yī)院，私人診所也已頻繁使用。

2.2.2 小兒感染性疾病 感染性疾病快速診斷試劑盒的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡便、快捷，并可即時(shí)報(bào)告檢測結(jié)果，而快速診斷試劑盒所需檢測時(shí)間較病原體的細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)明顯縮短，且檢測結(jié)果可以直接應(yīng)用于疾病診療。

根據(jù)A 群溶血性鏈球菌感染的病變程度來確定其治療方法，咽炎及發(fā)熱等癥狀應(yīng)用青霉素類或頭孢類抗菌藥物治療。通過快速診斷試劑盒檢測結(jié)果顯示陽性即可診斷A 群溶血性鏈球菌感染，不必進(jìn)行咽部分泌物的細(xì)菌培養(yǎng)。

輪狀病毒感染所致胃腸炎的主要癥狀是腹瀉，呈灰白色的水樣便，伴嘔吐，在小兒病毒性胃腸炎中很容易進(jìn)展為重癥，給予抗菌藥物后反而有可能轉(zhuǎn)變?yōu)槁赃w延性腹瀉，因此有必要與細(xì)菌性胃腸炎進(jìn)行鑒別診斷。除去快速診斷試劑盒以外，在日常診療中尚無病毒檢驗(yàn)方法可用。

腺病毒感染的臨床癥狀多表現(xiàn)為約40 ℃的高熱，持續(xù)4～5 d，鑒于患兒白細(xì)胞計(jì)數(shù)及C-反應(yīng)蛋白水平常見升高，易與重癥細(xì)菌感染性疾病混淆而被誤診。如果應(yīng)用快速診斷試劑盒檢測就容易予以鑒別診斷。因?yàn)椴皇菓?yīng)用抗病毒藥物治療而是采用對(duì)癥療法，應(yīng)用快速診斷試劑盒檢測明確為腺病毒感染的臨床診斷能夠提示預(yù)后，這樣也就緩解了患兒監(jiān)護(hù)人的不安情緒。

病毒的分離培養(yǎng)等經(jīng)典檢驗(yàn)方法所需時(shí)間長，所以快速診斷試劑盒作為小兒感染性疾病實(shí)驗(yàn)診斷的一個(gè)分支在門診的應(yīng)用已經(jīng)明顯增加。而且，根據(jù)快速診斷試劑盒檢測結(jié)果也可以向患兒的監(jiān)護(hù)人說明患兒是否需住院接受治療。

2.2.3 社區(qū)獲得性肺炎 革蘭氏染色是快速檢驗(yàn)診斷技術(shù)之一，但其操作過程繁雜，檢驗(yàn)結(jié)果的解釋也較為困難。快速診斷試劑盒鑒定病原菌不取決于操作者的技能，然而革蘭氏染色、細(xì)菌分離培養(yǎng)等檢驗(yàn)技術(shù)則有一定操作規(guī)程。

肺炎鏈球菌是細(xì)菌性肺炎最常見的病原菌，作為社區(qū)獲得性肺炎的病原菌檢出率很高。社區(qū)獲得性肺炎發(fā)病初期其病原體的一部分即可從尿液中被排出，快速診斷試劑盒約15 min 即可檢測出尿液中的肺炎鏈球菌抗原。而且細(xì)菌培養(yǎng)未能分離到病原菌的病例亦可應(yīng)用快速診斷試劑盒檢測出肺炎鏈球菌感染。

軍團(tuán)菌肺炎具有高致死率，所以早期診斷十分重要。應(yīng)用快速診斷試劑盒早期診斷軍團(tuán)菌感染的實(shí)用性很高，僅約15 min 即可檢測出尿液中的軍團(tuán)菌抗原。

通過細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)和鑒定可以明確診斷支原體感染所致的支原體肺炎，但因?yàn)橹гw的細(xì)菌學(xué)檢查通常需要1 周以上時(shí)間，臨床很少進(jìn)行這項(xiàng)檢查。一般的支原體抗體效價(jià)檢測使用血清學(xué)診斷，而快速診斷試劑盒比血清抗體法檢測所需時(shí)間短（約10 min），且檢測的敏感度較好?；诳焖贆z測結(jié)果給予恰當(dāng)?shù)闹委熆梢愿纳浦匕Y肺炎和膿毒癥患者的預(yù)后，所以應(yīng)強(qiáng)調(diào)臨床檢查的快速性。

2.2.4 STD 在日本，很多醫(yī)院采取業(yè)務(wù)外包形式進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）等基因檢測診斷。因此，需要等待一段時(shí)間才能獲得檢測結(jié)果。很多醫(yī)師往往在患者初診時(shí)僅根據(jù)臨床癥狀就給予基本的抗菌藥物處方。尤其當(dāng)STD 患者就診時(shí)，即使抗菌藥物的療效并不十分顯著，患者也主觀認(rèn)為癥狀有所減輕，因此再次就診的可能性較低。臨床使用快速診斷試劑盒進(jìn)行檢測，從初診時(shí)即可明確診斷并給予治療，避免了僅依據(jù)臨床癥狀就給予抗菌藥物治療，減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

3 免疫層析快速診斷試劑盒臨床使用時(shí)的注意事項(xiàng)

3.1 試劑盒臨床檢測的操作 大部分免疫層析試劑盒（包括檢測必需的器具以及試藥等全部備用品）均為一次性使用，而且采樣器具（棉棒等）、樣本前處理液、樣本的滴液儀器、檢測試劑等構(gòu)成品均應(yīng)包裝在一起。即使同一檢查項(xiàng)目的試劑盒，如果生產(chǎn)廠商不同也不可共用（或混用）。另外，檢驗(yàn)標(biāo)本的種類和采集方法也對(duì)試劑盒的檢測結(jié)果具有很大的影響，因此，需要熟練、正確地掌握檢驗(yàn)標(biāo)本的采集技術(shù)才能獲得可信度大的檢測結(jié)果。

免疫層析快速診斷試劑盒在使用時(shí)應(yīng)注意，必須準(zhǔn)確掌握檢測的反應(yīng)時(shí)間。一般情況下，免疫層析試驗(yàn)由于反應(yīng)停止或中斷無法進(jìn)行操作，未完成免疫反應(yīng)（或變化）而單方面從層析的構(gòu)像譜來判讀這一時(shí)間段的檢測結(jié)果是欠準(zhǔn)確的。因?yàn)?，免疫層析試?yàn)快速診斷試劑盒檢測結(jié)果記錄的主要是結(jié)果不再變化時(shí)所顯示的最長時(shí)間段。在這種情況下，未在規(guī)定的檢測時(shí)間段內(nèi)出現(xiàn)的陽性層析構(gòu)像譜的可信度較低。因此，嚴(yán)格遵照免疫層析的規(guī)定反應(yīng)時(shí)間是快速診斷試劑盒性能評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。為確保免疫層析快速診斷試劑盒質(zhì)量的可靠性，必須嚴(yán)格遵守檢測結(jié)果的判讀時(shí)間。

3.2 試劑盒臨床檢測的敏感度及特異度 抗原檢測試劑盒敏感度的問題，從現(xiàn)在已售的流感檢測試劑盒開始上市就備受關(guān)注。雖然不能說與PCR 檢測技術(shù)的敏感度并列（或相近），以輔助臨床診斷為目的，其檢測的敏感度已經(jīng)有了較大的提升，但“交叉污染”仍是值得關(guān)注的問題。為防止“交叉污染”，應(yīng)認(rèn)真進(jìn)行檢測樣本的處理。此外，考慮到有利于臨床檢查，一般認(rèn)為免疫層析試驗(yàn)檢測設(shè)定的敏感度范圍，即臨床應(yīng)用上陽性與陰性的臨界點(diǎn)，應(yīng)該恰當(dāng)實(shí)用。

免疫層析快速診斷試劑盒的特異度，與所使用的抗體性質(zhì)以及有效除去來源于檢體樣本中的非特異性反應(yīng)物質(zhì)密切相關(guān)。現(xiàn)在市售的檢測試劑制品已被疊加了相關(guān)功能，在實(shí)用性方面達(dá)到較高水平。但是，因?yàn)闄z體標(biāo)本存在差別，所以非特異性反應(yīng)物質(zhì)的影響是否能夠被完全排除仍有待進(jìn)一步探討，必須予以注意。

此外，細(xì)菌抗原檢測試劑盒因?yàn)榇嬖谖⑸锕餐乖挠绊?，在檢測中與抗體的交叉反應(yīng)問題亦應(yīng)受到重視。

4 總結(jié)與展望

感染性疾病病原體的檢驗(yàn)方法大體可區(qū)分為病原體的培養(yǎng)與鑒定、血清學(xué)診斷、基因擴(kuò)增、抗原檢測等4 類（表2）。其中病原體的培養(yǎng)與鑒定、血清學(xué)診斷不適合感染性疾病的快速診斷；PCR 檢測代表了基因擴(kuò)增技術(shù)，但需要一定的時(shí)間；另一方面，關(guān)于病原體抗原的檢測，所需時(shí)間縮短至數(shù)十分鐘以內(nèi)的檢測方法被認(rèn)為是適用的。作為感染性疾病診療中實(shí)驗(yàn)診斷的另一分支，免疫層析快速診斷試劑盒已經(jīng)開發(fā)并應(yīng)用于POCT。

表2 感染性疾病病原體檢驗(yàn)方法的種類及特點(diǎn)

綜上所述，免疫層析快速診斷試劑盒可用于感染性疾病的臨床輔助快速診斷，其檢測質(zhì)量和性能受操作和使用方法影響。該方法操作簡單，雖然相比可大量應(yīng)用、價(jià)廉的液體試劑檢測成本較高，但其具有的利用價(jià)值彌補(bǔ)了該缺點(diǎn)。未來針對(duì)感染性疾病的快速診斷試劑盒應(yīng)用范圍將更加廣泛，與多種微生物相對(duì)應(yīng)的快速診斷試劑盒有望面世，能夠量化分析的快速診斷試劑盒也可能會(huì)逐漸出現(xiàn)。但應(yīng)注意，感染性疾病的快速診斷試劑盒為輔助診斷方法，必須根據(jù)臨床癥狀，綜合考慮進(jìn)行疾病的臨床診斷。

志謝：本文主要參考日本國際醫(yī)療福祉大學(xué)熱海醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部谷直人教授的原著《抗原檢出用迅速キットの有用性と使用上の留意點(diǎn)》編譯，謹(jǐn)致謝忱。

利益沖突作者聲明不存在利益沖突