3 種方法檢測圍產(chǎn)期孕婦陰道分泌物B 群鏈球菌的效果分析

陶婭琳 毛德超 王寧 王星花 馬麗娟 雷志輝 代嬌

作者單位：655000 云南曲靖，曲靖市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科（陶婭琳、毛德超、王寧、王星花、馬麗娟、雷志輝）

655000 云南曲靖，曲靖市醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校（代嬌）

B 群鏈球菌（group B streptococcus，GBS）俗稱無乳鏈球菌,屬于兼性厭氧革蘭陽性（G+）球菌，是β溶血性鏈球菌屬最重要的條件致病菌之一，正常情況下廣泛定植于陰道和直腸部位。從1938 年Fry首次報道GBS 可引起人類感染導(dǎo)致死亡，該菌就被證實為人類的致病菌［1］。隨后的研究顯示，GBS 屬于條件致病菌，當(dāng)機(jī)體抵抗力降低或微生態(tài)平衡遭到破壞時可發(fā)生機(jī)會性感染［2-3］，如在健康婦女陰道內(nèi)存在多種正常微生物菌落，GBS 不作為致病菌處理。但對于妊娠中晚期孕婦，由于內(nèi)分泌的變化，雌激素和孕激素水平升高，使得局部細(xì)胞免疫功能下降，同時陰道內(nèi)糖原增加，為GBS 提供了良好的生長環(huán)境，可引起圍產(chǎn)期孕產(chǎn)婦感染導(dǎo)致胎膜早破、絨毛膜羊膜炎、胎兒窘迫、早產(chǎn)、產(chǎn)后出血、產(chǎn)褥感染等，導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局［4-5］。并且，GBS 具有一定的母嬰垂直感染風(fēng)險，若新生兒垂直感染該菌可增加其圍產(chǎn)期死亡風(fēng)險［6］。因此，準(zhǔn)確而快速地為臨床診斷提供圍產(chǎn)期孕產(chǎn)婦的GBS 感染情況并采取預(yù)防措施極其重要，對于減少GBS 感染引起的不良妊娠結(jié)局意義重大［7］。本研究采用不同方法對圍產(chǎn)期孕產(chǎn)婦GBS 帶菌率進(jìn)行篩查，比較不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)，旨在為曲靖地區(qū)提供較合適的檢測方法。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2019 年1 —8 月自愿就診于本院婦產(chǎn)科的圍產(chǎn)期孕婦（孕35～37 周）送檢的1 088 份標(biāo)本。

1.2 儀器與試劑 梅里埃VITEK2-Compact 型自動細(xì)菌鑒定儀，美國ABI7300 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增儀，二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱，梅里埃配套G+球菌鑒定卡（GP），5%綿羊血瓊脂平板（鄭州安圖生物工程股份有限公司提供），GBS 顯色培養(yǎng)基，GBS 核酸提取試劑盒（天津達(dá)安集團(tuán)股份有限公司提供）。

1.3 質(zhì)量控制（質(zhì)控）菌株 金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、大腸埃希菌（ATCC25922）、鉛黃腸球菌（ATCC700327）、無乳鏈球菌（ATCC12386）。

1.4 檢測方法

1.4.1 標(biāo)本收集 本研究送檢的標(biāo)本均由產(chǎn)科接診醫(yī)生采集，以無菌棉簽輕輕旋轉(zhuǎn)采集就診孕婦陰道下1/3 處分泌物，同時采集2 份，立即送檢。本院檢驗科接收標(biāo)本后30 min 內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)接種，另一份標(biāo)本加入生理鹽水于-70 ℃冰箱保存，以備PCR檢測。

1.4.2 GBS 檢測

1.4.2.1 一般細(xì)菌培養(yǎng)法 將標(biāo)本均勻涂抹于血瓊脂平板，采用分期劃線法接種標(biāo)本后，平板于35～37 ℃、5%～10% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日觀察篩選β 溶血、革蘭氏染色為陽性的鏈球菌進(jìn)行分純培養(yǎng)，同時挑取單個菌落進(jìn)行GBS 鑒定試驗（CAMP 試驗）和桿菌肽試驗，孵育18～24 h 后選取CAMP 試驗陽性（出現(xiàn)箭頭狀β 溶血現(xiàn)象）、桿菌肽陰性的分純菌株，配制0.5 麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙海迦腓b定卡置入VITEK2-Compact 自動細(xì)菌鑒定儀進(jìn)一步鑒定，以金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、大腸埃希菌（ATCC25922）、鉛黃腸球菌（ATCC700327）、無乳鏈球菌（ATCC12386）作為標(biāo)準(zhǔn)菌株同時進(jìn)行實驗，次日記錄結(jié)果。

1.4.2.2 GBS 顯色培養(yǎng)法 接種方法同一般細(xì)菌培養(yǎng)法，平板于35～37 ℃、5%～10% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～24 h，觀察培養(yǎng)平板上的菌落顯色情況，挑取紅色菌落分純，次日進(jìn)行上機(jī)鑒定（同一般細(xì)菌培養(yǎng)法），記錄結(jié)果。

1.4.2.3 實時熒光PCR 對試劑盒陽性質(zhì)控品（濃度為1×106拷貝/mL）進(jìn)行倍比稀釋，制備濃度為1×103、1×104、1×105、1×106拷貝/mL 的4 個標(biāo)準(zhǔn)品，按照試劑盒說明書進(jìn)行DNA 提取、擴(kuò)增及結(jié)果判讀，將標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、大腸埃希菌（ATCC25922）、無乳鏈球菌（ATCC12386）陰陽性質(zhì)控與標(biāo)本同時提取，試驗結(jié)束后記錄結(jié)果。

1.5 倫理學(xué) 本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)本院倫理批準(zhǔn)（審批號：20191020），所有對患者進(jìn)行的檢測均獲得過患者或家屬的知情同意。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計數(shù)資料以例或百分比表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 種方法篩查GBS 感染的結(jié)果比較 1 088 份圍產(chǎn)期孕婦陰道分泌物標(biāo)本中，一般細(xì)菌培養(yǎng)法檢出GBS 陽性55 份（陽性率5.06%），GBS 顯色培養(yǎng)法檢出GBS 陽性62 份（陽性率5.70%），實時熒光PCR 檢出GBS 陽性78 份（陽性率為7.17%）。實時熒光PCR 陽性率明顯高于一般細(xì)菌培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝4.24，P＝0.036），其余方法比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 3 種方法篩查圍產(chǎn)期孕婦GBS 感染陽性率比較

2.2 3 種檢測方法評價 以一般細(xì)菌培養(yǎng)法作為參考標(biāo)準(zhǔn)［8］，分別計算其余兩種方法的敏感度、特異度和準(zhǔn)確度，GBS 顯色培養(yǎng)法分別為100.0%、99.3%、99.4%，實時熒光PCR 分別為96.4%、97.6%、97.5%，兩種方法比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 GBS 顯色法和實時熒光PCR 評價指標(biāo)

2.3 3種方法檢測時長比較 一般細(xì)菌培養(yǎng)法和GBS 顯色培養(yǎng)法所需時長為24～36 h，耗時較長；實時熒光PCR 檢測法需要4～6 h，耗時較短。

3 討論

目前，GBS 是國際公認(rèn)的導(dǎo)致嚴(yán)重圍產(chǎn)期感染的重要致病菌，據(jù)報道，GBS 在西方國家的圍產(chǎn)期感染中居首位［9-10］，感染率在5%～35%不等［11］。孕產(chǎn)婦GBS 感染可誘發(fā)產(chǎn)褥感染、宮內(nèi)感染、泌尿系統(tǒng)感染等多種疾病，影響產(chǎn)婦產(chǎn)后恢復(fù)，同時約40%～70% GBS 感染的產(chǎn)婦在分娩過程中會通過垂直傳播感染新生兒，引起新生兒菌血癥、新生兒肺炎、新生兒腦膜炎等嚴(yán)重感染。近年來，GBS 感染引起廣泛重視，隨著對疾病研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)母體檢測GBS為陽性者，新生兒發(fā)生感染的機(jī)會較低，僅為1%～3%，一旦發(fā)生感染，病死率約為5%［12］。西方國家對GBS 非常重視,美國疾病預(yù)防控制中心在2010 年已修訂了對于圍產(chǎn)期GBS 的篩查、防治指南［13］，有效減少了圍產(chǎn)期GBS 感染的發(fā)生以及產(chǎn)生的危害。

我國對GBS 感染的研究起步較晚［14］，有部分學(xué)者研究顯示，北京地區(qū)孕婦的GBS 帶菌率為17.6%［15］，桂林地區(qū)孕婦檢出率為7.5%［16］，長沙地區(qū)孕婦感染率為11.25%［17］，上海地區(qū)為3.7%［18］，南京地區(qū)為4.2%［19］等，本研究檢測出的GBS 感染率為5.06%（一般細(xì)菌培養(yǎng)法），提示GBS 感染存在地區(qū)差異，可能還受人群、年齡、教育程度、檢測技術(shù)等因素的影響。因此，還需加強(qiáng)對圍產(chǎn)期孕產(chǎn)婦GBS 的篩查，從而盡早給予干預(yù)治療，以免造成不良的妊娠結(jié)局。目前，我國約90%的圍產(chǎn)期孕婦在產(chǎn)檢時已接受了GBS 感染的篩查，但仍然有部分農(nóng)村地區(qū)的孕產(chǎn)婦因知識不足、意識性不強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)條件落后等原因未接受GBS 的常規(guī)篩查。為進(jìn)一步提高人口出生質(zhì)量，應(yīng)該將GBS 的篩查技術(shù)全覆蓋至基層醫(yī)療單位。

對于GBS 的檢測，不同地區(qū)、不同醫(yī)院采用的檢測技術(shù)不同。本研究主要采用標(biāo)準(zhǔn)方法即一般細(xì)菌培養(yǎng)法，但其在開展的3 種方法中檢出陽性率最低，GBS 培養(yǎng)對營養(yǎng)要求高，菌株在血平板上生長易受多種污染菌的干擾和抑制。采用GBS 顯色培養(yǎng)法陽性率較一般細(xì)菌培養(yǎng)法有提高，顯色培養(yǎng)基選擇為鑒別培養(yǎng)基，可使溶血性的GBS 菌株產(chǎn)生類胡蘿卜樣色素（此法不能檢出不具有溶血性的GBS菌株），在培養(yǎng)基上出現(xiàn)橘紅色、磚紅色或紫紅色的顏色變化。GBS顯色培養(yǎng)法與一般細(xì)菌培養(yǎng)法相比，敏感度、特異度和準(zhǔn)確度分別為100.0%、99.4%、99.4%，該方法操作簡單，僅需根據(jù)培養(yǎng)基顏色變化判讀結(jié)果，成本較低，適合作為孕婦GBS 陽性率篩查和輔助診療的常規(guī)方法進(jìn)行推廣。實時熒光PCR檢測技術(shù)是將DNA 樣本在體外擴(kuò)增獲得較多的特定DNA 片段，利用熒光標(biāo)記探針檢測樣本中GBS特定基因，其優(yōu)點(diǎn)在于可檢測到少數(shù)不溶血菌株和死亡的菌株，檢出陽性率明顯高于一般細(xì)菌培養(yǎng)法，敏感度、特異度和準(zhǔn)確度分別為96.4%、97.6%、97.5%，與文獻(xiàn)報道［20-21］基本一致，且僅耗時4～6 h，大大縮短了檢測時限，但該方法對人員操作技術(shù)要求較高，試劑和儀器成本昂貴，且檢出的陽性菌株不能直接用于藥敏試驗，對于有治療需求的患者可能導(dǎo)致治療時間延長。因此，該方法更適合于為臨床提供準(zhǔn)確、快速的診斷依據(jù)，對于經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)可能增加患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

綜上所述，一般細(xì)菌培養(yǎng)法和實時熒光PCR 各有優(yōu)缺點(diǎn)，本研究顯示，PCR 檢測法的陽性率高于另外兩種方法，符合從傳統(tǒng)微生物學(xué)技術(shù)過渡至分子生物學(xué)的發(fā)展趨勢，但該技術(shù)尚處于發(fā)展初期階段，其對成本、技術(shù)、人員、設(shè)備等的要求較高，臨床推廣有一定的困難［22］，還未能普及至基層醫(yī)院，而GBS 顯色培養(yǎng)法陽性率與實時熒光PCR 陽性率無顯著差異，敏感度和準(zhǔn)確度均較高，雖檢測時限稍長，但能同時為陽性標(biāo)本提供抗菌藥物使用依據(jù)，且成本較低，較適合基層醫(yī)院用于進(jìn)行GBS 的常規(guī)篩查和防治，但我們認(rèn)為GBS 檢測技術(shù)的發(fā)展應(yīng)向經(jīng)濟(jì)、簡便、快捷、高通量、高準(zhǔn)確性的方向轉(zhuǎn)變，以滿足臨床快速篩查的需要，對此臨床可根據(jù)感染患者的具體情況和接受程度選擇合適的檢測方法。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突