骨髓間充質(zhì)干細胞關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射對膝骨性關(guān)節(jié)炎炎癥因子表達的影響

姚金龍 吳睿哲 梁曉輝 孫紹裘 馮海波

作者單位：410208 湖南長沙，湖南中醫(yī)藥大學（姚金龍、吳睿哲）

410000 湖南長沙，湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院骨傷四科（梁曉輝、孫紹裘、馮海波）

膝骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是中老年人群中常見的慢性退行性疾病，隨著社會老齡化，KOA 的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已成為中老年人跛行甚至致殘的重要原因［1］。KOA 的臨床常見癥狀以關(guān)節(jié)軟骨損害為特征，病變常累及軟骨、滑膜以及關(guān)節(jié)周圍軟組織［2］。因此保護患者膝關(guān)節(jié)軟骨，延長膝關(guān)節(jié)使用壽命，從而提高中老年患者生活質(zhì)量，是當前亟需解決的課題。透明質(zhì)酸是人體自身存在的物質(zhì)，具有良好的生物相容性，以透明質(zhì)酸為支架，混合骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）構(gòu)成可利用的三維支架行關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，在避免關(guān)節(jié)損傷的同時，可以起到抗炎及修復軟骨的作用，具有其特有的優(yōu)勢。本研究旨在探討B(tài)MSCs 關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射對KOA 炎癥因子表達的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心購得成年健康雄性新西蘭白兔30 只，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，編號后按隨機數(shù)字表法分組，最終納入動物數(shù)分別為生理鹽水組8 只、玻璃酸鈉組9 只、玻璃酸鈉混合干細胞組9 只。飼養(yǎng)1 周，觀察各組動物無明顯疾患并確保健康。本實驗過程中對動物的處置方法符合動物倫理學標準，并經(jīng)本單位倫理批準（審批號：20200519）。

1.2 實驗細胞及試劑

1.2.1 自體BMSCs 的制備 將模型兔分別穿刺雙側(cè)股骨大轉(zhuǎn)子骨髓腔，可得4 mL 骨髓，以全血培養(yǎng)法培養(yǎng)純化原代自體BMSCs。待細胞長至鋪滿瓶底90%時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1：3 傳代培養(yǎng)。以后各代均以此密度傳代擴增。原代培養(yǎng)細胞記為P0，此后順次為P1、P2 等。誘導液由營養(yǎng)培養(yǎng)基F-12、20%胎牛血清、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）15 μg/L、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒（insulin-transferrin-selenium，ITS）10 μL/mL、維生素C 80 mg/L、地塞米松50 mg/L 組成。消化、離心收集第3 代BMSCs，再加入誘導液和透明質(zhì)酸（haluronic acid，HA）制成6×108/mL 的細胞懸液。在24 孔板中每孔接種1 滴（每滴10 μL），形成微小三維細胞球團結(jié)構(gòu)，不加入誘導液在培養(yǎng)箱靜置2～3 h后，每孔輕輕加入適量誘導液，避免吹散細胞，置于細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每日更換2/3 量培養(yǎng)液。培養(yǎng)第14 天，取出細胞團用0.25%胰蛋白酶消化，輕輕吹散后洗滌離心，留取沉淀的已分化細胞備用。

1.2.2 試劑 玻璃酸鈉注射液（山東博士倫福瑞達制藥有限公司，國藥準字H20067379）和生理鹽水（中國大冢制藥有限公司，產(chǎn)品批號9J74B2）均購于湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備及處理 通過手術(shù)切斷兔膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶復制KOA 模型。具體方法：采用化學純氨基甲酸乙酯（烏拉坦）麻醉，用0.9%鹽水將其配制成25%的溶液，按1 g/kg 體質(zhì)量（4 mL/kg 體質(zhì)量）耳緣靜脈注射。麻醉滿意后，剪除右后肢膝關(guān)節(jié)周圍毛發(fā)，常規(guī)消毒，髕旁內(nèi)側(cè)切口長約3 cm，切開關(guān)節(jié)囊，將髕骨向外翻轉(zhuǎn)，切斷前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶，止血，縫合關(guān)節(jié)囊及皮膚，術(shù)后每日1 次給予每只動物肌內(nèi)注射400 kU 青霉素進行抗感染治療，共3 d。1 周后待傷口愈合良好，開始強迫兔活動膝關(guān)節(jié)，每次0.5 h，每日2 次，4 周后KOA 模型復制成功。

1.3.2 藥物干預(yù) 術(shù)后每周經(jīng)皮關(guān)節(jié)穿刺并注射藥物，生理鹽水組給予膝關(guān)節(jié)腔注射生理鹽水（每只0.3 mL），玻璃酸鈉混合干細胞組給予膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射玻璃酸鈉混合干細胞（每只0.3 mL）、玻璃酸鈉組給予關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射玻璃酸鈉注射液（每只0.3 mL），每周1 次，持續(xù)4 周；對側(cè)肢體（左后肢）不予干預(yù)。

1.3.3 標本采集及處理

1.3.3.1 血清樣本 4 周后各組白兔禁食12 h，取頸外靜脈血8 mL，使用低溫高速離心機3 000 r/min 離心10 min，提取血清。

1.3.3.2 滑膜組織樣本 4 周后過量麻醉處死兔，每只依次打開關(guān)節(jié)腔用銳刀切取內(nèi)側(cè)滑膜和股骨內(nèi)髁下面全層關(guān)節(jié)軟骨，留取標本備檢。

1.3.4 炎癥因子水平測定 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清及滑膜組織中白細胞介素（interleukin，IL）-1β和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，采用t 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

玻璃酸鈉組和玻璃酸鈉混合干細胞組兔血清及滑膜組織中IL-1β 和TNF-α 水平均明顯低于生理鹽水組；玻璃酸鈉混合干細胞組血清及滑膜組織中IL-1β、TNF-α 水平均明顯低于玻璃酸鈉組（均P＜0.05）。見表1。

表1 不同干預(yù)方式3 組KOA 模型兔血清及滑膜組織IL-1β、TNF-α 含量的比較（）

表1 不同干預(yù)方式3 組KOA 模型兔血清及滑膜組織IL-1β、TNF-α 含量的比較（）

注：KOA 為膝骨性關(guān)節(jié)炎，IL-1β 為白細胞介素-1β，TNF-α為腫瘤壞死因子-α；與生理鹽水組比較；與玻璃酸鈉組比較，bP＜0.05

3 討論

KOA 屬于臨床常見骨科疾病，主要以關(guān)節(jié)軟骨慢性退行性改變?yōu)榕R床病理特征，目前其治療關(guān)鍵仍為減緩軟骨退變［3］。KOA 晚期手術(shù)治療費用高，并發(fā)癥多，手術(shù)風險大。軟骨細胞的新生目前仍是骨科領(lǐng)域面臨的難題，軟骨細胞本身遷徙能力不高，增生能力差，再生能力也非常低，故軟骨損傷后很難自體恢復。另外軟骨細胞取材困難，來源有限，故體外培養(yǎng)困難，因此難以成為有效的種子細胞［4］。

BMSCs 是一類來源于中胚層具有多向分化潛能的干細胞。Caplan 等［5］及Lodi 等［6］認為BMSCs注射以及移植方案正在成為一種用于軟骨修復的有效治療方法，主要由于其具有較強的分化成各種結(jié)締組織（包括軟骨、骨、脂肪、肌腱、韌帶等）的能力。近年來對BMSCs 的研究逐漸深入，BMSCs 存在于自體骨髓中，具有取材方便、來源廣泛、無免疫排斥反應(yīng)并且性狀穩(wěn)定、易于保存等優(yōu)勢［7］。這促使BMSCs 用于軟骨修復變?yōu)榭赡?。其中在動物實驗中，Caplan 等［8］用適量的BMSCs 干預(yù)兔膝關(guān)節(jié)的股骨髁全層軟骨損傷模型，發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨有不同程度的修復。Mason 等［9］利用腺病毒轉(zhuǎn)染BMP27基因到兔BMSCs，促進BMSCs 的表達，在修復兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型中有效改善軟骨質(zhì)量并縮短軟骨修復時間。而Yoo 等［10］分離骨髓中的BMSCs，體外培養(yǎng)導入基因，而后將這些經(jīng)過遺傳修飾的細胞與軟骨誘導因子一起輸回體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)靶細胞和生物活性因子到達受損的關(guān)節(jié)軟骨處并使關(guān)節(jié)軟骨逐漸恢復功能。張鐘元等［11］也發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)鏡清理聯(lián)合自體BMSCs 移植能有效促進早期KOA 關(guān)節(jié)軟骨的修復，延緩KOA 病程的進展。

促炎細胞因子也稱前炎性細胞因子，具有較強的生物學效應(yīng)，主要由免疫細胞生成，可介導多種免疫反應(yīng)。而膝關(guān)節(jié)內(nèi)促炎細胞因子與抗炎細胞因子保持動態(tài)平衡，共同維持關(guān)節(jié)軟骨的生理代謝。目前發(fā)現(xiàn)的KOA 促炎細胞因子主要包括IL-1β、TNF-α、IL-15、IL-6、IL-17 及IL-18 等。其中IL-1β和TNF-α 在KOA 發(fā)病進程中可通過絲裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信號通路調(diào)控，從而釋放炎癥介質(zhì)，引發(fā)關(guān)節(jié)軟骨退變［12］?；谝陨涎芯浚茢郆MSCs 保護軟骨可能與其抑制促炎細胞因子有關(guān)。

本實驗結(jié)果表明，BMSCs 關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射可減少KOA 模型兔血清和滑膜組織中IL-1β 和TNF-α的表達，并與玻璃酸鈉互為協(xié)同作用，從而保護關(guān)節(jié)軟骨，這為臨床治療KOA 提供了實驗依據(jù)，但其具體干預(yù)機制尚有待進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突