基于磁免疫微流控芯片對肺炎鏈球菌的快速檢測

高菊逸 邵奕霖 吳傳安 楊偉康 羅裕旋 徐小平

作者單位：518110 廣東深圳，深圳市龍華區(qū)婦幼保健院檢驗科（高菊逸、吳傳安、楊偉康、羅裕旋）518053 廣東深圳，香港大學(xué)深圳醫(yī)院（邵奕霖、徐小平）

引起細菌性腦膜炎（bacterial meningitis，BM）的主要病原菌包括肺炎鏈球菌、腦膜炎雙球菌和流感嗜血桿菌等［1］，其中肺炎鏈球菌可以穿過血腦屏障侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成感染，病死率高達16%～37%，而且存活者中有30%～50%的患者發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥［2］。盡管目前臨床已采取抗菌藥物治療及疫苗接種的措施，但BM 仍然具有較高的發(fā)病率和病死率。實驗室檢測方法對肺炎鏈球菌的檢出率較低，常造成結(jié)果報告不及時導(dǎo)致患者病情延誤。因此，研制一種可快速檢測肺炎鏈球菌的方法對于臨床早期用藥和早期治療是非常必要的。

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，臨床上對人體生化指標檢測的要求也越來越高。微型化、智能化和集成化將成為分析儀器發(fā)展的主流方向［3-5］。微流控芯片技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用在病原微生物檢測方面有一定意義，因此本研究研制一種簡易化磁免疫微流控芯片，探討其對肺炎鏈球菌的檢測效果，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株 肺炎鏈球菌 ATCC 49619、大腸埃希菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌 ATCC 25923 均由深圳市龍華區(qū)婦幼保健院檢驗科微生物室提供。

1.2 儀器與試劑 倒置熒光顯微鏡（日本尼康儀器有限公司），高速攝像熒光電荷耦合器件（charge coupled device，CCD，英國Andor Zyla 公司），注射泵（美國Kd Sciencefic 公司），勻膠機（美國Laurell 公司），對準型光刻機（韓國MIDAS 公司），等離子清洗機（美國Harrick 公司）；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS），親 和 素 化 磁 珠（美 國Thermo Fisher 公司），聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS，美國Dow Corning 公司），光刻膠SU8-3050（美國Microchem 公司），Hoechst 33342 熒光染色劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），生物素化抗肺炎鏈球菌抗體（英國Abcam 公司），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）。

1.3 磁免疫微流控芯片的制作方法

1.3.1 微流控芯片的設(shè)計 根據(jù)研究對象的形態(tài)學(xué)特征，使用Pro/Engineer 輔助軟件設(shè)計芯片大小為40 mm×20 mm（如圖1A 所示），其中a、b 分別為進、出樣孔，直徑為0.5 mm；c 為進樣微通道，寬0.2 mm，長10 mm；d 為出樣微通道，寬0.2 mm，長15 mm；e 為檢測區(qū)域，寬1.4 mm，長3.2 mm，高3 mm。

1.3.2 磁免疫微流控芯片的制作 根據(jù)設(shè)計圖形制作掩膜備用，將硅片置于勻膠機上，以500 r/min 旋轉(zhuǎn)15 s，接著以3 500 r/min 旋轉(zhuǎn)50 s，在硅片上均勻懸涂一層SU-8 負光刻膠，95 ℃加熱10 min，通過前烘使光刻膠固化；將處理好的硅片置于紫外光刻機上，與掩膜貼合曝光10 s；再經(jīng)過后烘、顯影和腐蝕，制作陽膜。使用顯微鏡觀察通道及進、出樣口。之后將配制好的PDMS 混合液（PDMS 基質(zhì)∶PDMS預(yù)聚物＝5：1 或10：1）澆鑄在陽膜上，使其均勻平鋪，真空抽氣后置于80 ℃電熱干燥箱中烘烤，將最后固化好的PDMS 從陽膜上剝離并切割，再使用顯微鏡觀察進、出樣孔是否準確。最后將制作好的PDMS 蓋片（檢測芯片）和潔凈的玻片一起放入等離子清洗機，抽真空后等離子清洗30 s，取出后將兩者不可逆封接，芯片制作完成。最后將可食用性染料通入芯片，用于驗證芯片的實用性，結(jié)果見圖1B。

圖1 磁免疫微流控芯片的設(shè)計圖及實物圖

1.3.3 磁珠的制備 首先將40 μL親和素化磁珠（直徑為2.8 μm）加入到含有1 mL PBS（pH 7.2）的離心管中，輕搖洗滌后于磁力架上靜置3～5 min 至液體澄清，吸出上清液，重復(fù)操作3 次。然后加入1 mL PBS，再加入1 μL 生物素化抗肺炎鏈球菌抗體（4 g/L），置于搖床（25 ℃，100 r/min）孵育2 h 后將離心管置于磁力架上至液體澄清，吸出上清液，加入1 mL PBS，搖晃、洗滌后置于磁力架上至液體澄清，吸出上清液，重復(fù)操作3 次，洗滌完成后加入1 mL PBS，再加入2 μL 5 mg BSA，混勻后置于搖床（25 ℃，100 r/min）孵育30 min。最后將離心管置于磁力架上至液體澄清，吸出上清液，加入1 mL PBS，搖晃、洗滌后置于磁力架上至液體澄清，用移液器吸出清液，重復(fù)操作3 次，加入0.5 mL PBS 重懸備用，保存于4 ℃冰箱。

1.4 檢測方法

1.4.1 菌株制備 肺炎鏈球菌于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后取0.2 mL 加入無菌生理鹽水配制成濃度為1.5×105cfu/mL 的初始菌液，經(jīng)平板菌落計數(shù)確定濃度。使用同樣方法將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌配制成1.5×105cfu/mL 的菌懸液備用。

1.4.2 選擇最佳進樣流速和時間 根據(jù)本實驗組之前的研究數(shù)據(jù)［6-8］，選擇4 個進樣流速（1、5、10、15 μL/min）分別進樣并進行調(diào)試對比，直至60 min，計算細菌捕獲率。

1.4.3 磁免疫微流控芯片檢測 首先，取出制作好的芯片，磁鐵位置對應(yīng)芯片檢測區(qū)，與注射泵連接，從進樣口通入1% BSA 溶液，流速10 μL/min，反應(yīng)10 min，對芯片通道封閉處理。緊接著通入結(jié)合有抗肺炎鏈球菌抗體的免疫磁珠溶液，流速10 μL/min，反應(yīng)10 min，用 PBS 清洗通道，除去通道中未被固定的免疫磁珠。然后以最佳進樣流速和時間將濃度范圍在1.5×101～1.5×105cfu/mL 的肺炎鏈球菌菌懸液通入芯片。最后通入Hoechst 33342 熒光染色劑，避光染色30 min 后置于倒置熒光顯微鏡下觀察并用CCD 拍照記錄。

1.4.4 芯片的特異度和可重復(fù)性 將制備好的濃度為1.5×105cfu/mL 的肺炎鏈球菌ATCC 49619、大腸埃希菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 25923菌懸液分別以最佳進樣流速和時間通入芯片內(nèi)，以PBS 作為陰性對照，在顯微鏡下觀察并記錄數(shù)據(jù)。采用SPSS 20.0 軟件對結(jié)果進行獨立樣本t 檢驗，確定該微流控芯片的特異度。相同條件下，取濃度為1.5×105cfu/mL 的肺炎鏈球菌菌懸液，重復(fù)檢測10 次，確定芯片可重復(fù)性。

2 結(jié)果

2.1 成功制作磁免疫微流控芯片 PDMS 的硬度是制作芯片的關(guān)鍵，不同PDMS 基質(zhì)和PDMS 預(yù)聚物混合配制比例制作的PDMS 具有不同硬度，實驗證明，當比例為5：1 時，配制的PDMS 會出現(xiàn)芯片破裂的現(xiàn)象，出現(xiàn)的碎屑會堵塞進樣口且不易清理；當比例為10：1 時，配制的PDMS 無芯片破壞的現(xiàn)象且使用膠布能很好地清理打孔碎屑。本研究根據(jù)實驗結(jié)果選用制作PDMS 的比例為10：1，成功制作磁免疫微流控芯片。見圖1B。

2.2 確定最佳進樣流速及時間 進樣流速越快，檢測所用時間越短，芯片對細菌的捕獲率越低；相反進樣速度越慢，所用時間越長，捕獲率越高，主要原因可能是進樣速度太快產(chǎn)生的高流體剪切力使已經(jīng)結(jié)合的細菌脫離下來，導(dǎo)致捕獲率下降。因此本研究選擇5 μL/min 作為最佳進樣流速，進樣時間為20 min。見表1。

表1 不同進樣流速下磁免疫微流控芯片的捕獲率

2.3 不同濃度肺炎鏈球菌菌懸液通過磁免疫微流控芯片的捕獲率比較 被捕獲的肺炎鏈球菌在熒光顯微鏡下觀察熒光信號清晰可見，而陰性對照無熒光。見圖2。當樣本菌懸液濃度≥1.5×103cfu/mL時，芯片捕獲率可達到90%以上，樣本菌懸液濃度≤1.5×102cfu/mL 時，芯片捕獲率降至9%。見圖3。

圖3 磁免疫微流控芯片對不同濃度肺炎鏈球菌捕獲率比較

2.4 磁免疫微流控芯片的檢測特異度和可重復(fù)性

此芯片對肺炎鏈球菌的捕獲率為95%，對大腸埃希菌及金黃色葡萄球菌均無檢測信號，捕獲率為0，檢測捕獲率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明此磁免疫微流控芯片在檢測過程中具有良好的特異度。同批檢測的變異系數(shù)（CV）為1.1%，證明此方法具有較好的可重復(fù)性。

圖2 磁免疫微流控芯片對不同濃度肺炎鏈球菌菌懸液的反應(yīng)區(qū)熒光信號

3 討論

3.1 研究意義 肺炎鏈球菌不僅是引起B(yǎng)M 的主要致病菌，也是引起細菌性肺炎的首位病原菌，由于抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，使其臨床治療遇到了用藥瓶頸期。冒山林等［9］報道肺炎鏈球菌是導(dǎo)致急診社區(qū)發(fā)生血流感染的主要致病菌之一，且耐藥率呈上升趨勢。目前，實驗室常用檢測方法最快需要48 h，耗時較長，不能及時有效地協(xié)助臨床早期診斷。因此，亟需一種快速且準確的肺炎鏈球菌檢測方法。

近年來，越來越多的研究證明微流控芯片技術(shù)在此方面具有突出的優(yōu)越性，它可實現(xiàn)在微米級通道內(nèi)操控微量流體，通過微進樣技術(shù)對微通道內(nèi)流體進行控制，在顯微鏡下可觀察到微通道內(nèi)不同于宏觀體系的現(xiàn)象。Nuchtavorn 等［6］設(shè)計的毛細管電泳微流控芯片，是通過激光誘導(dǎo)熒光檢測大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌，與傳統(tǒng)技術(shù)相比，納米熒光檢測的生物相容性更優(yōu)，且光強度更高，但此方法制作芯片操作復(fù)雜，不適合批量生產(chǎn)。Suehiro 等［10］采用阻抗檢測技術(shù)實現(xiàn)大腸埃希菌的定量分析，但操作也較為復(fù)雜，需要經(jīng)預(yù)處理使細菌吸附在電極表面才能實現(xiàn)細菌的檢測，不利于快速診斷。Zhu等［11］將微流體芯片與電化學(xué)阻抗檢測技術(shù)相結(jié)合，對大腸埃希菌等細菌進行快速鑒定，可在2 h 內(nèi)完成檢測，檢測限達103cfu/mL，但芯片結(jié)合電阻抗技術(shù)制作流程復(fù)雜，且操作繁瑣。本研究團隊此前以PDMS、雙面黏性薄膜和玻片為材料設(shè)計制作了一種簡易型微流控芯片，經(jīng)表面修飾后檢測循環(huán)腫瘤細胞，捕獲率達到（95±2）%，可在30 min 內(nèi)完成檢測，但芯片通道高度為50 μm，不適用于檢測大小只有幾微米的病原微生物［12］。相比上述研究，本研究實現(xiàn)了在芯片外進行預(yù)處理，將修飾好的磁珠通入芯片內(nèi)，增大了芯片檢測室的比表面積，提高抗原與抗體的結(jié)合效率，使抗體更加穩(wěn)定、均勻地固定在芯片通道內(nèi)，不僅簡化了抗體修飾過程，而且適用于批量快速制作。利用此磁免疫微流控芯片檢測肺炎鏈球菌，捕獲率可達95%，特異度為100%，可重復(fù)性強，對臨床早期診斷和治療由肺炎鏈球菌引起的BM 及肺炎具有一定的意義。

3.2 磁免疫微流控芯片的優(yōu)勢 本研究設(shè)計的微流控芯片選用免疫磁珠結(jié)合熒光抗體法，芯片設(shè)計簡單，根據(jù)肺炎鏈球菌大小設(shè)計芯片尺寸，并且在芯片外實現(xiàn)磁珠的表面修飾，減少微流控芯片制作過程中繁瑣的步驟，簡化流程，縮短檢測時間，提高抗體結(jié)合率，實現(xiàn)95%的高捕獲率。

3.3 不足與展望 磁免疫微流控芯片目前已實現(xiàn)對肺炎鏈球菌的高捕獲率，是否能將芯片制作材料改進為環(huán)烯烴聚合物（cycloolefin polymer，COP）等新型高科技材料，從而利于批量生產(chǎn)還有待研究。本團隊將以此為研究基礎(chǔ)，優(yōu)化實驗方案，以實現(xiàn)同時檢測幾種引起B(yǎng)M 的主要病原菌為最終目標。

綜上所述，本研究研制的磁免疫微流控芯片結(jié)合抗原抗體特異性反應(yīng)，極大提高了芯片檢測的敏感度和特異度；利用外部磁場固定免疫磁珠，在芯片外完成磁珠表面抗體修飾，便于免疫芯片批量修飾制造；而且此方法操作簡單，可適用于基層醫(yī)院及社區(qū)健康醫(yī)療服務(wù)中心，市場應(yīng)用前景較為廣闊。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突