呋蟲胺對(duì)環(huán)境生物的急性毒性與安全性評(píng)價(jià)

柳新菊，吳聲敢，安雪花，呂露，蔣金花，李崗，王菲迪，趙學(xué)平

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所 浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 杭州 310021)

呋蟲胺(dinotefuran)是由日本三井化學(xué)開發(fā)并于2002年上市的第三代新煙堿類殺蟲劑，主要作用于昆蟲的乙酰膽堿受體，進(jìn)而阻斷昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常傳導(dǎo)，引起害蟲麻痹，從而發(fā)揮殺蟲作用[1-3]。由于其廣譜殺蟲性和良好的內(nèi)吸滲透作用，近年來呋蟲胺使用量逐年上升，有關(guān)其使用技術(shù)和對(duì)環(huán)境的影響已引起廣大科研人員的關(guān)注。

本研究以意大利蜜蜂、日本鵪鶉、斑馬魚、家蠶和赤子愛勝蚯蚓為試驗(yàn)對(duì)象，按照我國《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[4]的要求，研究呋蟲胺對(duì)上述環(huán)境模式生物的急性毒性，并進(jìn)行安全評(píng)價(jià)。通過系統(tǒng)研究呋蟲胺對(duì)環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)中典型環(huán)境生物的急性毒性，評(píng)價(jià)其安全性，從而為其合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

3%呋蟲胺低容量液劑，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所農(nóng)業(yè)投入品應(yīng)用評(píng)價(jià)研究中心提供。

意大利蜜蜂由浙江省義烏市佛堂鎮(zhèn)王煥興蜂廠引入；家蠶品種為菁松×皓月，由浙江省蠶種質(zhì)量檢驗(yàn)檢疫站提供；斑馬魚為本機(jī)構(gòu)繁殖，種魚購自武漢中科院水生生物研究所的國家斑馬魚資源中心；赤子愛勝蚯蚓購自浙江省杭州市花鳥市場(chǎng)鑫源漁具；日本鵪鶉由杭州市蕭山區(qū)城廂鎮(zhèn)漢良畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)提供。

1.2 方法

1.2.1 蜜蜂毒性試驗(yàn)

采用點(diǎn)滴法進(jìn)行毒性試驗(yàn)。選用個(gè)體大小一致的健康成年工蜂，在25.0～25.4 ℃、相對(duì)濕度53.0%～54.0%條件下進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)包括：5個(gè)呋蟲胺處理組(點(diǎn)滴0.250 0、0.179 0、0.128 0、0.091 1、0.065 1 mg·L-1呋蟲胺溶液)、助劑對(duì)照組(點(diǎn)滴丙酮溶液)和空白對(duì)照組(不進(jìn)行點(diǎn)滴處理)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只蜜蜂。試驗(yàn)時(shí)，呋蟲胺處理組用手動(dòng)微量點(diǎn)滴儀對(duì)準(zhǔn)每只蜜蜂中胸背板處分別點(diǎn)滴不同試驗(yàn)藥液1 μL，助劑對(duì)照組點(diǎn)滴丙酮1 μL，待藥液揮發(fā)后將蜜蜂移入蜂籠中，用脫脂棉浸泡適量50%蔗糖水溶液(m/m)，通過網(wǎng)眼供蜜蜂攝食；空白對(duì)照組直接飼喂50%蔗糖水溶液。觀察并記錄受試蜜蜂24、48 h的中毒癥狀與死亡數(shù)。

1.2.2 家蠶毒性試驗(yàn)

采用浸葉法進(jìn)行毒性試驗(yàn)。選擇個(gè)體大小一致的2齡起蠶，在25.0～25.5 ℃，相對(duì)濕度78%～82%的條件下進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)包括：6個(gè)呋蟲胺處理組和空白對(duì)照組，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20頭2齡起蠶。試驗(yàn)時(shí)，分別將整張桑葉浸沒于不同濃度的試驗(yàn)藥液(呋蟲胺濃度分別為1.800、1.500、1.250、1.040、0.868、0.723 mg·L-1)中浸泡10 s，自然晾干后剪成長(zhǎng)條形并轉(zhuǎn)入直徑為9 cm培養(yǎng)皿中，將家蠶挑入培養(yǎng)皿后置于植物培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)，所有試驗(yàn)用蠶在25 min內(nèi)完成轉(zhuǎn)入；對(duì)照組桑葉不做處理。觀察并記錄受試家蠶24、48、72、96 h的中毒癥狀和死亡情況。

1.2.3 斑馬魚毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)前，在水溫21.0～25.0 ℃，光照與黑暗時(shí)間比為14 h∶10 h，曝氣充氧的環(huán)境條件下馴養(yǎng)斑馬魚7 d以上，試驗(yàn)前1 d停止喂食。試驗(yàn)時(shí)，選擇大小一致(體長(zhǎng)2.20～2.60 cm、體質(zhì)量0.071～0.110 g)的斑馬魚作為受試動(dòng)物。試驗(yàn)在橢圓形玻璃魚缸(無硅膠接縫，容積為9 L)中進(jìn)行，每缸放入3 L試驗(yàn)溶液，水溫22.5～23.4 ℃，pH 7.56±0.14，溶解氧≥78.3%。采用半靜態(tài)法進(jìn)行試驗(yàn)，每24 h更換試驗(yàn)溶液。試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)呋蟲胺處理組(呋蟲胺濃度為2.00、1.74、1.51、1.32、1.14 mg·L-1)和空白對(duì)照組(試驗(yàn)溶液為水)，每個(gè)魚缸為1個(gè)處理，每個(gè)處理20尾斑馬魚。觀察并記錄受試斑馬魚24、48、72、96 h的中毒癥狀和死亡情況。用玻璃棒輕觸斑馬魚尾部，無可見運(yùn)動(dòng)即為死亡，及時(shí)清除死亡斑馬魚。

1.2.4 蚯蚓毒性試驗(yàn)

采用人工土壤混藥法進(jìn)行毒性試驗(yàn)。將呋蟲胺配置成5個(gè)濃度梯度(5.21、4.00、3.08、2.37、1.82 mg·kg-1)，分別在1.5 kg人工土壤(由泥炭蘚、高嶺土、工業(yè)沙和碳酸鈣按一定比例組成，含水量2.52%)中加入450 mL試驗(yàn)溶液，攪拌混勻后各分為3份，置于500 mL燒杯中，每個(gè)燒杯中接入10條蚯蚓(體質(zhì)量0.379～0.572 g)，放入人工氣候箱中；對(duì)照組放入未添加呋蟲胺溶液的人工土壤。試驗(yàn)時(shí)，保持環(huán)境溫度20.2～21.2 ℃，相對(duì)濕度50.3%～78.6%，光照強(qiáng)度550～565 lx，連續(xù)光照。觀察并記錄受試蚯蚓7、14 d時(shí)的中毒癥狀和死亡情況。

1.2.5 鵪鶉毒性試驗(yàn)

選擇體質(zhì)量基本一致、健康、活潑、雌雄各半的日本鵪鶉用于試驗(yàn)。采用經(jīng)口一次灌注法，按100 g體質(zhì)量給藥1 mL試驗(yàn)溶液，每只稱體質(zhì)量，分別給藥。正式試驗(yàn)設(shè)置323 mg·kg-1共1個(gè)試驗(yàn)劑量(此劑量為呋蟲胺超低容量液劑所能配制的最大劑量)，同時(shí)設(shè)置1個(gè)不加藥處理為空白對(duì)照組，每組10只健康活潑鵪鶉(雌雄各半)。供試鵪鶉給藥后，按常規(guī)方法飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度25.5～26.5 ℃，相對(duì)濕度53%～70%，排氣扇通風(fēng)，光照∶黑暗時(shí)間為14 h∶10 h。觀察并記錄受試鵪鶉1、3、5、7 d時(shí)的中毒癥狀和死亡情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)受試物的半數(shù)致死量(median lethal dose，LD50)、半數(shù)致死濃度(median lethal concentration，LC50)及其95%置信區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 呋蟲胺對(duì)蜜蜂的毒性作用

呋蟲胺對(duì)蜜蜂的接觸毒性試驗(yàn)結(jié)果見表1。試驗(yàn)過程中，對(duì)照組蜜蜂活動(dòng)正常；不同濃度呋蟲胺處理蜜蜂后，蜜蜂出現(xiàn)活動(dòng)減少、行動(dòng)緩慢、落地死亡等情況，高濃度組的中毒癥狀較早出現(xiàn)且更加明顯。經(jīng)計(jì)算，呋蟲胺對(duì)蜜蜂的LD50(48 h)為0.156 μg·蜂-1。根據(jù)GB/T 31270.10—2014[4]中農(nóng)藥對(duì)蜜蜂的毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，48 h時(shí)0.001 μg·蜂-1

表1 呋蟲胺對(duì)蜜蜂急性接觸毒性試驗(yàn)結(jié)果

注：24 h時(shí)LD50為0.161 μg·蜂-1，95%置信區(qū)間為0.142～0.193 μg·蜂-1；48 h時(shí)LD50為0.156 μg·蜂-1，95%置信區(qū)間為0.138～0.183 μg·蜂-1。

2.2 呋蟲胺對(duì)家蠶的毒性作用

呋蟲胺對(duì)家蠶的毒性試驗(yàn)結(jié)果見表2。試驗(yàn)過程中，不同濃度處理家蠶出現(xiàn)發(fā)育遲緩、側(cè)倒、扭曲掙扎和死亡等情況，高濃度組的中毒癥狀較早出現(xiàn)且更加明顯。經(jīng)計(jì)算，呋蟲胺對(duì)家蠶的毒性LC50(96 h)為1.26 mg·L-1。根據(jù)GB/T 31270.11—2014[4]中農(nóng)藥對(duì)家蠶的毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，96 h時(shí)0.5 mg·L-1

2.3 呋蟲胺對(duì)斑馬魚的毒性作用

呋蟲胺對(duì)斑馬魚的毒性試驗(yàn)結(jié)果見表3。試驗(yàn)過程中，不同濃度呋蟲胺處理斑馬魚出現(xiàn)游動(dòng)遲緩、側(cè)翻失衡、竄動(dòng)、沉底等癥狀，高濃度組的中毒癥狀較早出現(xiàn)且更加明顯。經(jīng)計(jì)算，呋蟲胺對(duì)斑馬魚的毒性LC50(96 h)為1.55 mg·L-1。根據(jù)GB/T 31270.12—2014[4]中農(nóng)藥對(duì)魚類的急性毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，96 h時(shí)1.0 mg·L-1

表2 呋蟲胺對(duì)家蠶急性接觸毒性試驗(yàn)結(jié)果

注：72 h時(shí)LC50為1.35 mg·L-1，95%置信區(qū)間為1.28～1.45 mg·L-1；96 h時(shí)LC50為1.26 mg·L-1，95%置信區(qū)間為1.19～1.34 mg·L-1。

表3 呋蟲胺對(duì)斑馬魚急性接觸毒性試驗(yàn)結(jié)果

注：24 h時(shí)LC50為1.83 mg·L-1，95%置信區(qū)間為1.69～2.15 mg·L-1；48 h時(shí)LC50為1.75 mg·L-1，95%置信區(qū)間為1.61～2.01 mg·L-1；72 h時(shí)LC50為1.69 mg·L-1，95%置信區(qū)間為1.57～1.90 mg·L-1；96 h時(shí)LC50為1.55 mg·L-1，95%置信區(qū)間為1.45～1.66 mg·L-1。

2.4 呋蟲胺對(duì)蚯蚓的毒性作用

呋蟲胺對(duì)蚯蚓的毒性試驗(yàn)結(jié)果見表4。試驗(yàn)過程中，不同濃度呋蟲胺處理蚯蚓7 d后出現(xiàn)體液滲出、身體腫脹和死亡等中毒癥狀。經(jīng)計(jì)算，呋蟲胺對(duì)蚯蚓的毒性LC50(14 d)為3.40 mg·kg-1。根據(jù)GB/T 31270.15—2014[4]中農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，14 d時(shí)1.0 mg·kg-1

2.5 呋蟲胺對(duì)鵪鶉的毒性作用

試驗(yàn)過程中，最大呋蟲胺劑量處理后，鵪鶉均表現(xiàn)正常。經(jīng)計(jì)算，呋蟲胺對(duì)鵪鶉的毒性LD50(7 d)>323 mg·kg-1。因323 mg·kg-1為呋蟲胺按每100 g鵪鶉直接灌喂1 mL所得，為該藥劑所能配制的最大劑量，且鵪鶉均未見死亡。故評(píng)估呋蟲胺對(duì)鵪鶉7 d急性接觸毒性為低風(fēng)險(xiǎn)。

表4 呋蟲胺對(duì)蚯蚓急性接觸毒性試驗(yàn)結(jié)果

注：7 d時(shí)LC50為4.07 mg·kg-1，95%置信區(qū)間為3.63～4.87 mg·kg-1；14 d時(shí)LC50為3.40 mg·kg-1，95%置信區(qū)間為3.08～3.81 mg·kg-1。

3 討論

在整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中，鳥類、蜜蜂、家蠶、魚類和蚯蚓等是非常重要的環(huán)境生物，農(nóng)藥對(duì)其毒性大小在一定程度上反映了該農(nóng)藥的環(huán)境安全性。本研究所選擇的意大利蜜蜂、家蠶、斑馬魚、赤子愛勝蚯蚓和日本鵪鶉等是目前國內(nèi)外環(huán)境生物毒理學(xué)研究的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試生物，被廣泛應(yīng)用于環(huán)境生物毒性試驗(yàn)及其安全性評(píng)價(jià)[5]。本研究進(jìn)行上述一系列環(huán)境生物的急性毒性測(cè)試和安全性評(píng)價(jià)，能夠了解呋蟲胺在生態(tài)鏈各環(huán)節(jié)的危害，為呋蟲胺原藥和制劑的合理使用及登記提供科學(xué)參考。

本研究結(jié)果顯示，呋蟲胺對(duì)蜜蜂48 h的LD50為0.156 μg·蜂-1，其毒性級(jí)別為高毒，與譚麗超等[6]、季守民等[7]、陳秀[8]研究的毒性等級(jí)一致。因此，田間使用時(shí)，宜在蜜蜂低活動(dòng)時(shí)期時(shí)噴施藥劑，并避免開花期，且田邊也沒有處于開花期的作物，噴施藥劑前，還需將蜂巢和蜂群搬離。呋蟲胺對(duì)家蠶96 h的LC50為1.26 mg·L-1，毒性級(jí)別為高毒，與李雙等[9]、陳偉國等[10]研究的結(jié)果一致。因此，田間使用時(shí)，宜避免在蠶室和桑園附近使用該藥劑，同時(shí)延長(zhǎng)藥后桑葉采摘間隔期。呋蟲胺對(duì)斑馬魚96 h的LC50為1.55 mg·L-1，其毒性級(jí)別為高毒。孫琦等[11]研究了呋蟲胺對(duì)斑馬魚胚胎的急性毒性，結(jié)果顯示，呋蟲胺對(duì)斑馬魚胚胎的96 h-LC50為10.36 g·L-1，屬于微毒，且隨著劑量增加，呈規(guī)律的劑量依賴效應(yīng)。吳若函等[12]研究了20%呋蟲胺懸浮劑對(duì)斑馬魚的急性毒性，其96 h-LC50為59.7 mg·L-1，屬于低毒。張文萍等[13]研究發(fā)現(xiàn)呋蟲胺制劑的毒性比原藥的毒性要高，不同劑型毒性也有差異。因此，田間使用時(shí)，應(yīng)避免藥液污染水源地。呋蟲胺對(duì)蚯蚓14 d的LC50為3.40 mg·kg-1，其毒性級(jí)別為中毒，與馮磊等[14]、肖遠(yuǎn)卓[15]的研究結(jié)果一致。田間使用時(shí)，盡量按規(guī)定劑量不會(huì)造成危害性，但應(yīng)盡量避免高溫天氣使用，同時(shí)輪換使用不同的新煙堿類農(nóng)藥。呋蟲胺對(duì)鵪鶉7 d的LD50>323 mg·kg-1，用農(nóng)藥所能配制的最大劑量直接灌喂，鵪鶉均表現(xiàn)正常。

綜上所述，呋蟲胺對(duì)不同環(huán)境生物的毒性不同。農(nóng)藥對(duì)環(huán)境生物的毒性研究不應(yīng)局限于急性毒性，還應(yīng)研究其慢性毒性效應(yīng)。本研究?jī)H限于呋蟲胺對(duì)環(huán)境生物的急性毒性研究，而其對(duì)鳥類、蜜蜂、家蠶、魚類和蚯蚓等環(huán)境生物的慢性影響尚需進(jìn)一步研究。