蘿卜抽薹時間的QTLs定位及分析

曲麗君，張見，邢軍，李欣屹

(天津天豐澤田生物科技有限公司，天津 300457)

抽薹是植物從葉叢中抽出花薹的現(xiàn)象，是植株由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵時期，是植物在長期的進化過程中形成的特性[1-2]。由于植物物種及其產(chǎn)品器官的多樣性，對于食用花莖、花蕾和角果的作物來說，適當(dāng)促進抽薹開花是重要的。而對于以變態(tài)根和變態(tài)莖為產(chǎn)品器官的作物來說，抽薹會導(dǎo)致產(chǎn)品器官品質(zhì)下降。蘿卜是世界上重要的蔬菜作物，其產(chǎn)品器官為肉質(zhì)根，不僅具有豐富的營養(yǎng)價值，而且具有較高的藥用價值。蘿卜先期抽薹指肉質(zhì)根在完全膨大之前就已抽薹開花[3]。先期抽薹導(dǎo)致植株進入花芽分化狀態(tài)，肉質(zhì)根膨大基本停止，且隨著花芽分化、抽薹和開花，肉質(zhì)根由致密變?yōu)槭杷?，品質(zhì)快速下降, 失去商品價值[4]。

關(guān)于抽薹性狀的遺傳規(guī)律在甘藍、青花菜、大白菜等十字花科蔬菜中已取得重要進展。Kagawa[5]對大白菜的研究認(rèn)為，早抽薹對晚抽薹為顯性。Baggett等[6]研究青花菜和甘藍的雜交組合，發(fā)現(xiàn)抽薹是數(shù)量性狀遺傳。張韜[7]認(rèn)為，抽薹性狀是由多基因控制的數(shù)量性狀，但是早抽薹性狀對晚抽薹性狀并不是完全顯性，易受環(huán)境的影響且遺傳效力較低。一些控制甘藍和大白菜抽薹性狀的QTLs位點被挖掘。陳書霞等[8]利用F2群體構(gòu)建了甘藍類RAPD標(biāo)記遺傳圖譜，并定位了同抽薹期相關(guān)的3個QTLs，分別位于第1、3和8號連鎖群上。李梅[9]以結(jié)球甘藍品種間雜交獲得的F2群體作為構(gòu)圖群體，構(gòu)建了甘藍分子遺傳圖譜，并對結(jié)球甘藍抽薹時間性狀進行QTLs定位，最終獲得1個與抽薹時間相關(guān)的QTL，可解釋18.7%的表型變異。Kitamoto等[10]在經(jīng)過春化的大白菜F2群體中將控制抽薹時間的QTLs定位于2、3和5號連鎖群，其中位于2號連鎖群的QTL對抽薹性狀的貢獻率達到46.0%，解釋的表型變異最大。目前關(guān)于蘿卜抽薹性狀遺傳規(guī)律的報道較少。Kaneko等[11]在蘿卜異源染色單體中發(fā)現(xiàn)了1個早抽薹基因，它對于控制栽培種晚抽薹性狀的幾個基因均為顯性。趙麗萍[4]利用主基因與多基因混合遺傳模型聯(lián)合分析方法對蘿卜抽薹性狀進行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)蘿卜抽薹性狀符合兩對主基因+多基因遺傳模型。這與其他十字花科蔬菜抽薹性狀的遺傳規(guī)律基本一致。

本研究中以早抽薹材料YS105和晚抽薹材料ZP85為親本構(gòu)建F2群體，同時借助SSR多態(tài)性標(biāo)記構(gòu)建的蘿卜分子遺傳圖譜，進行蘿卜抽薹時間的QTLs定位及分析，可為培育耐抽薹蘿卜新品種及分子輔助育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以蘿卜野生材料YS105為母本，栽培型材料ZP85為父本配制F1，F(xiàn)1嚴(yán)格自交獲得F2群體。其中YS105為早抽薹材料，ZP85為晚抽薹材料。F2群體大小為342株。采取常規(guī)方法進行栽培管理。

1.2 抽薹性狀調(diào)查及分級

自播種至花薹伸長至3～5 cm所需的天數(shù)作為抽薹時間。對親本、F1和F2群體分單株進行連續(xù)調(diào)查并記錄抽薹時間，直至栽培型材料ZP85肉質(zhì)根成熟終止調(diào)查(播種后75 d)。根據(jù)各單株抽薹所需天數(shù)參照以下標(biāo)準(zhǔn)對其抽薹性進行分級：1級，抽薹天數(shù)≤45 d；2級，45 d<抽薹天數(shù)≤55 d；3級，55 d<抽薹天數(shù)≤65 d；4級，65 d<抽薹天數(shù)≤75 d；5級，抽薹天數(shù)>75 d。

1.3 DNA提取和分子標(biāo)記

DNA的提取采用改良的CTAB法[12]。其中親本和F1的DNA用于多態(tài)性SSR標(biāo)記篩選，F(xiàn)2群體的DNA用于構(gòu)建遺傳圖譜和QTL定位。

本文所用的SSR分子標(biāo)記來源于蘿卜基因組序列，根據(jù)蘿卜EST序列設(shè)計的SSR引物[13]以及參照 Hashida 等[14]。PCR反應(yīng)體系15 μL：2 μL DNA(40 ng·μL-1)，正向、反向引物(10 ng·μL-1)各0.25 μL，Taq酶 0.2 μL(2.5 U·μL-1)，dNTP 0.2 μL，Mg2+1.2 μL(25 mmol·L-1)，10×Taqbuffer 1.5 μL，ddH2O 9.4 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；72 ℃保溫8 min。擴增產(chǎn)物用8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠，160 V恒功率電泳分離1 h，銀染顯色后在膠片觀察燈下進行帶型統(tǒng)計分析。SSR引物序列由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.4 遺傳圖譜的構(gòu)建

利用親本篩選多態(tài)性SSR分子標(biāo)記對F2群體DNA進行分析。按照J(rèn)oinMap 4.0軟件[15]要求的方法統(tǒng)計條帶：與父本YS105一致的帶型記為a，與母本ZP85一致的帶型記為b，雜合的帶型記為h，未擴增出的或模糊不清的帶型記為u。采用JoinMap 4.0軟件作圖，利用Kosambi作圖將重組交換率轉(zhuǎn)化為centi-Morgans (cM)[16]。

1.5 QTLs定位

利用MapQTL4.0軟件[17]進行QTLs分析，首先利用置換測驗1 000 次重復(fù)，根據(jù)“Permutation test”進行全基因組掃描，估算基因組范圍內(nèi)α=0.05水平上的LOD閾值。然后，利用區(qū)間作圖法(interval mapping，IM)進行QTL分析，得到大于LOD閾值的QTL位點。對于IM分析得到的QTL，將最高LOD 值所在位置的標(biāo)記或與其緊密連鎖的標(biāo)記作為協(xié)同因子，再對IM檢測到的QTL進行多座位QTL模型(MQM)檢測，作為最終的定位結(jié)果。以連鎖群上LOD值最高的位置作為QTL的位置，同時分析每個QTL對蘿卜抽薹性狀的遺傳參數(shù)和貢獻率。QTL的命名規(guī)則如下：斜體字母“q”+性狀的英文縮寫+連鎖群號+QTL編號[18]。如qbt-1-1即表示位于第1連鎖群上第一個與抽薹時間(bolting time，bt) 相關(guān)的QTL。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

利用 SPSS13.0 統(tǒng)計軟件對雙親、F1及F2群體各單株的抽薹級數(shù)的調(diào)查結(jié)果進行統(tǒng)計分析并獲得其表型變異及分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿卜抽薹時間的表型變異

通過對植株抽薹時間的數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)母本YS105的平均抽薹時間為42 d，抽薹分級為1級，而父本ZP85在調(diào)查結(jié)束時(75 d)均沒有植株發(fā)生抽薹，抽薹分級為5級。F1的平均抽薹時間為68 d，抽薹分級為4級，介于雙親之間。F2群體在調(diào)查結(jié)束時有119株仍沒有發(fā)生抽薹，抽薹分級為5級，其他224株植株的抽薹時間變化幅度為32～75 d, 抽薹分級為1～4級(圖1)。由此可見，蘿卜抽薹時間性狀在F2群體中的分布基本介于雙親之間，少部分植株在該性狀中出現(xiàn)了超親分離現(xiàn)象。

圖1 蘿卜F2群體抽薹時間分級的分布

2.2 SSR 遺傳圖譜構(gòu)建

利用親本和F1篩選到的114對多態(tài)性SSR標(biāo)記對包含342個單株的F2群體進行鑒定。利用JoinMap 4.0[17]建立了包含9個連鎖群的蘿卜遺傳圖譜。該圖譜覆蓋基因組長度894.9 cM，平均標(biāo)記間距為7.85 cM。連鎖群的長度在50.8～155.4 cM。每個連鎖群的標(biāo)記數(shù)在6～20，其中LG1和LG4包含的標(biāo)記數(shù)最多，為20個，LG5和LG9含有的標(biāo)記數(shù)最少，僅有5個(圖2)。

圖2 蘿卜抽薹時間遺傳圖譜及QTL定位

2.3 抽薹時間性狀的QTLs定位

經(jīng)“Permutation test”對全基因組掃描，估算“Rel.cum.count”為0.950 0時的Interval值為3.3，即設(shè)定當(dāng)LOD值≥3.3時存在QTL。利用區(qū)間作圖法并結(jié)合多座位QTL模型(MQM)檢測，共檢測到4個與蘿卜抽薹時間相關(guān)的QTLs，分布于LG 5、LG 6、LG 8和LG 9上，分別命名為qbt-5-1、qbt-6-1、qbt-8-1和qbt-9-1 (圖2、表1)。LOD值介于10.18～18.11，可解釋8.4%～21.6%的表型變異率。

qbt-5-1的LOD值為10.18，介于標(biāo)記RSS2108～RS5-3，貢獻率為8.4%，加性效應(yīng)為0.47，顯性效應(yīng)為0.20；qbt-6-1位于89_21540～89_21637，其LOD值為18.11，可解釋14.7%的表性變異率，其加性效應(yīng)為0.67，顯性效應(yīng)為-0.48；qbt-8-1介于41_14295～RS8-2，LOD值為16.69，可解釋21.6%的表型變異率，該位點的加性效應(yīng)為0.81，顯性效應(yīng)為0.06；qbt-9-1位于標(biāo)記9ssr-10～9ssr-14，LOD值為11.57，貢獻率為10.7%，加性效應(yīng)為0.57，顯性效應(yīng)為0.13。

表1 蘿卜抽薹時間QTLs定位及效應(yīng)分析

3 討論

蘿卜抽薹性狀為主基因和多基因控制的數(shù)量性狀，易受環(huán)境條件影響，人為難以控制，且早抽薹對晚抽薹為不完全顯性，因此，給選育耐抽薹品種及新種質(zhì)資源開發(fā)帶來較大困難[4,11]。分子圖譜構(gòu)建及QTLs定位可加速分子標(biāo)記輔助育種的進程。本研究利用 F2群體對控制蘿卜抽薹時間性狀的QTLs進行定位及效應(yīng)分析，最終得到與蘿卜抽薹時間相關(guān)的4個QTLs位點(qbt-5-1、qbt-6-1、qbt-8-1和qbt-9-1)，分別位于蘿卜第5、6、8和9連鎖群上。它們的遺傳貢獻率分別為8.4%、14.7%、21.6%和10.7%，加性效應(yīng)分別為0.47、0.67、0.81和0.57，顯性效應(yīng)分別為0.20、-0.48、0.06和0.13。這4個位點均為增效位點，可在低世代育種中快速選擇純合的優(yōu)良性狀。qbt-8-1貢獻率達到21.6%，可能是控制蘿卜抽薹時間的主效位點。

一些與抽薹性狀相關(guān)的連鎖標(biāo)記的開發(fā)利用可大大加速耐抽薹品種的改良進程。Ajisaka等[19]利用BSA策略獲得了一個與大白菜極晚抽薹性狀緊密連鎖的RAPD標(biāo)記RA1255C，并成功轉(zhuǎn)化為共顯性RFLP標(biāo)記，該QTL可解釋77%的表型變異，為晚抽薹的分子標(biāo)記輔助選擇奠定了重要基礎(chǔ)。目前對蘿卜抽薹分子標(biāo)記的研究還相對較少，存在遺傳距離較大，尚不能較好地用于分子標(biāo)記輔助育種的問題。趙麗萍[4]采用BSA與GRA策略，對抽薹性狀進行多種遺傳標(biāo)記分析，獲得可能與抽薹性主效位點緊密連鎖的8個標(biāo)記。徐文玲等[20]利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合BSA法，獲得2個與蘿卜耐抽薹基因連鎖的標(biāo)記，其遺傳距離分別為14.6和9.1 cM。在本文中，我們將3個QTLs位點(qbt-5-1、qbt-6-1和qbt-9-1)的遺傳距離控制在11.1 cM以內(nèi)，下一步將繼續(xù)在該區(qū)域附近設(shè)計引物進行加密，將蘿卜抽薹性的基因控制在更小的距離范圍內(nèi)，力求獲得與蘿卜抽薹性更為連鎖的分子標(biāo)記，用于蘿卜耐抽薹品種選育過程。