丁酸梭菌早期干預(yù)對大腸桿菌攻毒肉雞腸道炎癥因子和抗菌肽基因表達的影響

申露露，徐 娥*，肖英平， 桂國弘， 呂文濤， 任敏敏

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所，浙江杭州310021）

近年來，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌是畜牧養(yǎng)殖中誘發(fā)初生動物腹瀉，從而導(dǎo)致動物死亡的重要致病菌，給畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。丁酸梭菌（Clostridium butyricum）作為重要的益生菌之一（Liao等，2015），其能夠促進有益菌群的增殖，抑制有害菌群的生長、繁殖（朱曉慧等，2002），并于2009年被批為一種新的飼料添加劑 （桂國弘等，2016）。 Yang（2012）等報道，日糧中添加丁酸梭菌可降低肉雞盲腸中大腸桿菌的數(shù)量，提高肉雞盲腸中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量。丁酸梭菌對畜禽感染大腸桿菌具有保護作用 （邢帥等，2018）。另有研究表明，丁酸梭菌能抑制機體中促炎性因子的表達，提高抗炎性因子IL-10的表達（Liu 等，2017）。 趙敏孟等（2018）提出丁酸梭菌提高畜禽免疫力與血清細胞因子含量和抑制腸道炎癥的發(fā)生有關(guān)。但丁酸梭菌早期干預(yù)對肉雞抵抗大腸桿菌感染和腸道炎癥反應(yīng)的影響還鮮見報道。本試驗用丁酸梭菌作早期干預(yù)，通過ETEC攻毒，研究丁酸梭菌對雛雞大腸桿菌感染攻毒后死亡率和下痢率以及腸道炎癥因子和抗菌肽基因表達的影響，為丁酸梭菌作為畜牧業(yè)生產(chǎn)中預(yù)防大腸桿菌引起的疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 丁酸梭菌MIYAIRI II 588，購自日本米雅利桑株式會社；產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88（菌株編號：CVCC1556），購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理 試驗設(shè)計和分組情況如表1所示，試驗選用200只健康1日齡肉雞（ROSS308，購自江蘇鎮(zhèn)江騰達孵化廠），隨機分為2組，每組100只雞，分別為丁酸梭菌組和對照組，在1～3 d時每天對丁酸梭菌組灌喂1 mL濃度為109cfu/mL的丁酸梭菌菌液，對照組灌喂1 mL生理鹽水。到7 d時把丁酸梭菌組再隨機分為丁酸梭菌組 （CB組）和丁酸梭菌+大腸桿菌組（CB+EC組），同時對照組也隨機分成大腸桿菌組（EC組）和對照組（Control組），在7 d時對丁酸梭菌+大腸桿菌組（CB+EC組）、大腸桿菌組（EC組）每天灌喂1 mL 108cfu/mL大腸桿菌液，其余組灌喂1 mL生理鹽水。

表1 試驗處理情況

試驗在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物房進行，試驗前對動物房全舍及飼養(yǎng)設(shè)備進行嚴格消毒，飼養(yǎng)周期為14 d。試驗為自由采食，自由飲水，人工投料，每天投喂3次，24 h光照，使用白熾燈調(diào)節(jié)動物房室內(nèi)溫度，第一周溫度保持37℃，之后每周逐漸減低2～3℃直至室溫。基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)成分如表2所示。

表2 日糧組成及主要營養(yǎng)成分

1.3 樣品采集 在肉雞大腸桿菌攻毒第3天（第10日齡）和第7天（第14日齡），從各試驗組隨機取8只肉雞，取回腸組織中段放入1.5 mL離心管中，液氮速凍后轉(zhuǎn)置于-80℃超低溫冰箱保存，用于炎癥因子和抗菌肽基因表達分析。

1.4 熒光定量PCR 采用TRIzol Plus RNA Purification Kit（Invitrogen）試劑盒提取回腸組織RNA，用Nanodrop-2000測定所提取RNA的濃度和質(zhì)量，采用SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR（Invitrogen公司）反應(yīng)體系進行逆轉(zhuǎn)錄。所用引物相關(guān)信息見表3。以GAPDH為內(nèi)參基因進行熒光定量PCR測定，按照 Power SYBR○RGreen PCR Master Mix試劑盒（TaKaRa），采用CFX96熒光定量PCR儀 （美國Bio-Rad）進行Real-Time PCR檢測。反應(yīng)體系為20μL；反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性1 min；40個循環(huán)（95 ℃變性 15 s，63 ℃退火 25 s，收集熒光）。

表3 實時熒光定量PCR引物

1.5 統(tǒng)計分析 使用SPSS軟件單因素方差分析進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，基因相對表達量運用2-△△Ct法計算，結(jié)果以“平均數(shù)±標準誤”表示。

2 結(jié)果

2.1 丁酸梭菌對大腸桿菌攻毒肉雞死亡率和下痢率的影響 如表4所示，灌喂丁酸梭菌的雛雞未出現(xiàn)死亡情況，對照組和大腸桿菌組中雛雞死亡率為3%。各組雛雞在灌喂大腸桿菌后均出現(xiàn)了下痢的情況，其中大腸桿菌組下痢率為73.52%，大腸桿菌+丁酸梭菌組下痢率為29.41%，可見丁酸梭菌可顯著降低大腸桿菌攻毒引起的腹瀉。

表4 丁酸梭菌對大腸桿菌攻毒肉雞死亡率和下痢率的影響%

2.2 丁酸梭菌對大腸桿菌攻毒肉雞回腸炎癥因子表達的影響 如圖1所示，攻毒3 d后肉雞回腸組織炎癥反應(yīng)相關(guān)基因TNFα、白細胞介素1β（IL-1β）的表達量在各組無顯著差異 （P＞0.05），丁酸梭菌組 Toll樣受體 4（TLR4）和白細胞介素8（IL-8）的表達量顯著低于大腸桿菌組和大腸桿菌+丁酸梭菌組（P＜0.05）。而丁酸梭菌組和大腸桿菌+丁酸酸梭菌組抗炎癥因子白細胞介素10（IL-10）的表達量顯著高于大腸桿菌組（P ＜ 0.05）。

攻毒7 d后結(jié)果如圖2所示，回腸組織炎癥反應(yīng)相關(guān)基因TNFα、IL-1β和IL-8的表達量各組間無顯著性差異（P＞0.05）。大腸桿菌組與丁酸梭菌組＋大腸桿菌組TLR4的表達量顯著高于對照組和丁酸梭菌組（P＜0.05）。大腸桿菌組抗炎因子IL-10的表達量顯著低于其他各組（P＜0.05）。

2.3 丁酸梭菌對大腸桿菌攻毒肉雞回腸內(nèi)源性宿主防疫肽表達的影響 如圖3所示，在攻毒3 d后AvBD9和Cath-B1在回腸組織中的表達量各組間無顯著差異（P＞0.05），而丁酸梭菌組AvBD10表達量極顯著的高于其他各組（P＜0.01）。

攻毒7 d后回腸組織內(nèi)源性宿主防御肽表達結(jié)果如圖4所示，丁酸梭菌組與大腸桿菌組回腸組織中AvBD9的表達量顯著高于其他組 （P＜0.01），Cath B1表達量各試驗組均顯著高于對照組 （P＜0.01）。AvBD10在各組無顯著性差異（P＞0.05），但丁酸梭菌組和丁酸梭菌+大腸桿菌組的表達量較高。

3 討論

3.1 丁酸梭菌對大腸桿菌攻毒肉雞死亡率和下痢率的影響 ETEC是一種引起初生幼畜腹瀉的主要病原體。ETEC入侵腸道后，會引起腸道功能紊亂，進而導(dǎo)致急性腹瀉（Dubreuil等，2016）。 邢帥（2018）等研究表明，丁酸梭菌對仔豬感染大腸桿菌引起的應(yīng)激反應(yīng)有保護作用。本試驗結(jié)果也顯示丁酸梭菌作為一種益生菌，可以降低雛雞因大腸桿菌引起的下痢，與前人研究結(jié)果一致（李?；ǖ?，2017；Hayakawa 等，2016）。 丁酸梭菌可能是抑制了雛雞腸道內(nèi)大腸桿菌的黏附素和腸毒素的表達，降低雛雞的腹瀉。

3.2 丁酸梭菌對大腸桿菌攻毒肉雞回腸組織中炎癥因子表達的影響 動物機體炎癥反應(yīng)主要是由于血清中抗炎性因子和促炎性因子失調(diào)導(dǎo)致的。有研究表明，在動物飼糧中添加益生菌可調(diào)節(jié)血清中抗炎性因子和促炎性因子的表達，對動物機體炎癥反應(yīng)有改善作用（李玉鵬等，2017）。丁酸梭菌可以增強機體免疫功能，主要是通過特異性受體調(diào)控基因的表達，調(diào)節(jié)機體的免疫通路（楊玲等，2018）。在本試驗回腸組織中，10 d時TNFα、IL-1β無顯著性差異 （P＞0.05），相比EC組與CB+EC組，丁酸梭菌組IL-8基因的表達量顯著降低（P＜0.05），而IL-8是導(dǎo)致機體炎癥反應(yīng)促炎性因子，IL-8的表達量降低，說明丁酸梭菌可以調(diào)控IL-8的表達來改善機體炎癥反應(yīng)；同時與CB組相比，大腸桿菌組炎癥抑制因子IL-10的表達量顯著降低（P＜0.05），丁酸梭菌能促進炎癥抑制因子的表達，與李玉鵬（2017）等研究一致；14 d時 TNFα、IL-1β、IL-8 沒有顯著 性差異 （P ＞0.05）。與CB＋EC組相比，大腸桿菌組IL-10的表達量顯著降低（P＜0.05），同時這段時間肉雞的腹瀉情況有所好轉(zhuǎn)，表明丁酸梭菌對大腸桿菌攻毒肉雞引起的腹瀉有一定改善作用。因此，丁酸梭菌早期干預(yù)可以提高雛雞血清中抗炎性因子的表達，同時抑制促炎性因子的表達。

3.3 丁酸梭菌對大腸桿菌攻毒肉雞回腸內(nèi)源性宿主防疫肽表達的影響 宿主防御肽（HDPs），又被稱作抗菌肽（AMPs），大多由20～100個氨基酸組成，廣泛表達于動植物的各個組織中（Shafee等，2016；Schneider等，2010）。 宿主防御肽在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，對各種病原物質(zhì)具有廣譜抗性，能直接殺滅各種細菌、病毒、真菌等（張龍等，2017）。同時，宿主防御肽具有強大的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠調(diào)節(jié)免疫細胞和炎癥反應(yīng)。因此，宿主防御肽具有很高的應(yīng)用價值，可直接作為抗菌劑或者疫苗輔劑，或者作為免疫及生殖調(diào)控劑等（Hancock 等，2012；Skerlavaj等，1996）。 宿主防御肽作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，在病原菌感染機體時，腸道內(nèi)抗菌肽基因會相應(yīng)的表達（Su等，2018）。本研究結(jié)果可以看出在大腸桿菌攻毒后的第3天，丁酸梭菌組AvBD10的表達量顯著高于其他試驗組，而AvBD9和CathB1在各個試驗組之間沒有顯著差異，可能原因是丁酸梭菌早期定植在雛雞體內(nèi)主要調(diào)節(jié)AvBD10的表達，有研究表明AvBD10 mRNA在雞的卵黃囊上皮細胞中高度表達，參與先天免疫（Zhang等，2019）。攻毒后第7天，丁酸梭菌組與大腸桿菌組AvBD9在回腸組織的表達量顯著增加（P＜0.01），試驗組CathB1表達量相對于對照組顯著增加（P＜ 0.01），在三個試驗組中都無顯著性差異。AvBD10在各組中都無顯著性差異（P＞0.05），而丁酸梭菌組與丁酸梭菌+大腸桿菌組的 AvBD10表達量都高于對照組與大腸桿菌組。從總體結(jié)果可以看出丁酸梭菌可以提高雛雞腸道抗菌肽基因的表達，對大腸桿菌早期攻毒肉雞腸道有一定的保護作用。

4 結(jié)論

丁酸梭菌早期干預(yù)可以在一定程度上降低大腸桿菌攻毒肉雞腸道中的炎癥反應(yīng)和提高抗菌肽基因的表達，從而減少大腸桿菌引起的下痢。