乳及乳制品中β-內(nèi)酰胺酶檢測方法研究

郝苗苗

（1.錫林郭勒職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古錫林浩特 026000；2.錫林郭勒食品檢驗(yàn)檢測和風(fēng)險(xiǎn)評估中心，內(nèi)蒙古錫林浩特 026000）

隨著生活水平的提高，人們對于乳及乳制品食用安全問題的關(guān)注不斷增加，其中最為突出的就是乳及乳制品生產(chǎn)過程中的抗生素殘留問題（買合木提·克衣木等，2009）。為了防治牛乳房炎和細(xì)菌性感染疾病等，在飼養(yǎng)過程中普遍會對奶牛使用廣譜性β-內(nèi)酰胺類抗生素藥物 （殷曉燕等，2007；崔生輝等，2007），藥物會隨著生物體代謝進(jìn)入乳腺分泌的乳中，這就會導(dǎo)致乳中高濃度抗生素殘留。2001年9月，我國農(nóng)業(yè)部頒布了《無公害食品生鮮牛乳》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定生鮮乳中“不得檢出”抗生素（周家華等，2001）。一些不法分子為了謀求經(jīng)濟(jì)利益，通過人為添加β-內(nèi)酰胺酶以分解乳中抗生素藥物，使“高抗奶””變?yōu)椤盁o抗奶”（國家藥典委員會，2015）。但β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)入人體后極易引起過敏反應(yīng)（彭司勛，1986）、腸道菌群失調(diào)以及耐藥性等一系列不良影響 （謝磊等，2015）。衛(wèi)生部于2009年3月發(fā)布了《全國打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項(xiàng)整治近期工作重點(diǎn)及要求》和《全國打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項(xiàng)整治抽檢工作指導(dǎo)原則和方案》的通知，明確指出β-內(nèi)酰胺酶是非食品用物質(zhì)且屬違法添加劑。乳及乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的檢測勢在必行，然而目前國內(nèi)僅在《SN/T 3979-2014乳及乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的測定方法》中規(guī)定了β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法，尚無國家檢測標(biāo)準(zhǔn)。本文通過分析當(dāng)前微生物法、碘量法和高效液相色譜法等β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法，比較各方法特點(diǎn)和適用性，為β-內(nèi)酰胺酶檢測方法的選擇提供參考，并對未來乳及乳制品中β-內(nèi)酰胺酶檢測的研究進(jìn)行了展望。

1 β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法

1.1 微生物法 微生物法主要有三維試驗(yàn)法 （王寅等，2009）、紙片法（Awad 等，2013）、顯色培養(yǎng)法（周愛春，2009）以及杯蝶法（中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，2015）等。其中杯碟法是應(yīng)用比較廣泛的商檢標(biāo)準(zhǔn)方法，該法采用對青霉素類藥物絕對敏感的藤黃微球菌作為標(biāo)準(zhǔn)菌株，在樣品中加入青霉素G作為對照，利用舒巴坦的特異性抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性，通過比對加入舒巴坦與未加入舒巴坦的樣品所產(chǎn)生抑菌圈的大小，來間接測定樣品中是否含有β-內(nèi)酰胺酶類藥物。

歐陽雪君等（2014）用杯蝶法檢測牛乳中β-內(nèi)酰胺酶，檢測結(jié)果良好，檢出限為0.2 U/L。郭長紅等 （2018）依據(jù)微生物杯蝶法對吉林市生乳中β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行調(diào)查檢測。侯東軍等（2013）研究了原料乳的保藏溫度、保藏時(shí)間等因素對微生物杯蝶法檢測結(jié)果的影響，并通過相應(yīng)的優(yōu)化試驗(yàn)，提高了微生物法檢測的準(zhǔn)確性。

微生物法因檢測費(fèi)用較低、抗生素靈敏度好，而在實(shí)驗(yàn)室被廣泛應(yīng)用，但該法檢測過程繁瑣、影響因素較多、檢測時(shí)間較長，不適用于條件較低的奶站牧場，并且只能對β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行定性檢測，并不能對抗生素的種類和含量進(jìn)行定性、定量分析。

1.2 碘量法 碘量法主要是β-內(nèi)酰胺酶與青霉素作用產(chǎn)生的青霉噻唑酸會競爭溶液中的碘離子，從而使淀粉褪色，通過顏色的變化來判斷其是否含有β-內(nèi)酰胺酶。

歐陽雪君等（2014）在無抗牛乳中按梯度添加β-內(nèi)酰胺酶，以純水為空白對照，加入淀粉溶液和碘液，并及時(shí)混勻后在2 min內(nèi)觀察樣液顏色，依據(jù)變色情況進(jìn)行定量檢測，檢出限為4.0 U/L。Chao等（2013）以碘量法為依據(jù)制作凝膠試劑盒，其可對不同類型的底物以及酶活性進(jìn)行直接測定，檢測時(shí)間0.5 h，檢出限為0.1 U/mL。蒙嘉鵬（2016）在進(jìn)行碘量法測定時(shí)發(fā)現(xiàn)，若樣品未進(jìn)行去脂肪處理，其實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性低，褪色反應(yīng)快，極易出現(xiàn)假陽性。

碘量法檢測時(shí)間短、成本低且操作簡單，適用于現(xiàn)場采樣檢測，多為奶站、樣品收購等實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行初篩使用，但該方法對反應(yīng)時(shí)間、溫度等條件要求較嚴(yán)格，每次試驗(yàn)均需要設(shè)置陽性和陰性對照，同時(shí)要避免乳及乳制品中的油脂造成的靈敏度低和重現(xiàn)性差等情況。

1.3 酸度計(jì)法 酸度計(jì)法檢測原理是青霉素在β-內(nèi)酰胺酶的作用下被水解生成青霉噻唑酸，該酸又可電離產(chǎn)生H+，使樣品的pH下降，根據(jù)穩(wěn)態(tài)處理米氏方程：v＝K[E][S]/（K m+[S]）（崔生輝等，2007），利用酸度的變化測定β-內(nèi)酰胺酶的殘留量。

馬潔等（2009）利用雙酸度計(jì)檢測，通過方法優(yōu)化以抵消干擾因素的影響，最低檢出限達(dá)到15 U/mL，同時(shí)得到米氏常數(shù)為0.0351 mmol/L。劉珊珊等（2010）利用此原理改進(jìn)牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的檢測，以牛奶為基本反應(yīng)體系，嚴(yán)格控制溫度、聲波、震動等外界環(huán)境干擾，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行檢測，其最低檢出限為8.29 U/mL。張鑫瀟（2011）利用酸度法測定市售純牛奶中β-內(nèi)酰胺酶含量，當(dāng)β-內(nèi)酰胺酶的濃度一定時(shí)，酶催化青霉素底物反應(yīng)速率增快，pH變化量隨之增加，而當(dāng)青霉素的濃度達(dá)到25 mg/mL時(shí)，反應(yīng)速率達(dá)到頂峰后pH變化量基本保持不變。該方法相關(guān)性好，理論最低檢出限為12.3 U/mL。

早在1961年Saz等就建立了用于致病性金黃色葡萄球菌胞外酶測定的酸度法，后來衍生出許多酸度指示劑方法，甚至用一些酸度定量紙片來檢測β-內(nèi)酰胺酶。該法雖簡單易行、易獲取結(jié)果，但假陽性和假陰性問題較嚴(yán)重。

1.4 高效液相色譜法 高效液相色譜法主要有間接測定法和直接測定法兩種，其中間接測定法是指向樣品中定量添加青霉素，根據(jù)青霉素經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶酶解后濃度降低量，從而檢測樣品中是否存在β-內(nèi)酰胺酶；直接測定法則是將樣品中的青霉素鉀經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶酶解后生成青霉噻唑酸鉀，經(jīng)前處理后，上機(jī)進(jìn)行青霉噻唑酸鉀測定，從而檢測β-內(nèi)酰胺酶含量。

李雪芳等（2015）以乳粉為基質(zhì)定量添加β-內(nèi)酰胺酶酶解青霉素鉀，后經(jīng)高效液相色譜測定青霉素鉀含量，當(dāng)β-內(nèi)酰胺酶添加量為0.2～1.4 mg/L時(shí)，青霉素鉀濃度的減少量與β-內(nèi)酰胺酶的濃度呈較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.99，回收率為89.0%～95.0%，該方法檢測靈敏度高、回收率和重現(xiàn)性良好。林楠（2008）利用高效液相色譜法直接測定青霉噻唑酸鉀含量，檢測限為20μg/L，回收率為76.4%～81.3%。

現(xiàn)有的液相色譜方法靈敏度和準(zhǔn)確度較好，但檢出限略高，樣品前處理過程繁瑣，所用儀器對實(shí)驗(yàn)人員要求較高，檢測成本昂貴。

1.5 快速高分離液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（RRLCMS/MS） 快速高分離液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法與高效液相色譜法原理相同，利用β-內(nèi)酰胺酶能夠酶解青霉素族藥物的特性，在樣品中加入適量氨芐青霉素進(jìn)行酶解，并檢測原樣品中氨芐青霉素酶解率，完成對β-內(nèi)酰胺酶定性、定量的檢測。孫漢文等（2010）將原乳中氨芐青霉素經(jīng)乙腈提取、凈化和濃縮后，利用RRLC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行定性與定量分析，結(jié)果表明，該方法檢出限為4 U/mL，回收率為92.3% ～95.5%。

RRLC-MS/MS法雖然具有靈敏度高，檢測時(shí)間相對短的優(yōu)點(diǎn)，但由于儀器設(shè)備昂貴，對操作人員要求較高而無法普遍開展。

1.6 試劑盒檢測法 王艷華等（2014）依據(jù)β-內(nèi)酰胺酶在原料乳中可降解青霉素G的原理，利用SNAPβ-內(nèi)酰胺類抗生素檢測試劑盒進(jìn)行β-內(nèi)酰胺酶檢測，并通過多次試驗(yàn)確保了該方法的重復(fù)性和抗干擾性能，該方法的檢出限為4 IU/mL。謝巖黎等（2014）依據(jù)β-內(nèi)酰胺酶能將青霉素鉀分解形成青霉噻唑酸，其可將Cu2+還原為Cu+，并與2，2′-聯(lián)喹啉反應(yīng)后生成紫紅色絡(luò)合物，利用可見分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，該絡(luò)合物顏色變化與β-內(nèi)酰胺酶的含量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，方法最低檢出限為4 U/mL。此外，張威等（2018）使用Charm試劑盒進(jìn)行牛奶中β-內(nèi)酰胺酶含量測定，結(jié)果表明，檢測限為4 U/mL，該方法雖與杯碟法得出的結(jié)果無明顯差別，但仍存在檢出假陽性的情況。

試劑盒檢測方法速度快，成本低，但因其尚未列入到國家標(biāo)準(zhǔn)中，目前僅限于前期快速檢測或樣品初步驗(yàn)收，可選用其進(jìn)行大量樣品篩查，若出現(xiàn)陽性樣品則應(yīng)采用杯碟法進(jìn)一步試驗(yàn)以確證。

1.7 其他檢測方法 沈祝飛等（2015）以美羅培南作反應(yīng)底物，用中性羥胺與硫酸鐵胺進(jìn)行顏色反應(yīng)，通過紫外分光光度計(jì)檢測美羅培南剩余含量，間接測定金屬β-內(nèi)酰胺酶含量，該方法檢測限為0.05 U，回收率為90%～119%。顯色頭孢菌素法檢測β-內(nèi)酰胺酶與酸度計(jì)法原理相似，β-內(nèi)酰胺酶與顯色頭孢菌素發(fā)生特異性的顏色反應(yīng)從而進(jìn)行定量檢測，但頭孢硝噻吩不僅價(jià)格昂貴，而且易與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性（唐群力，2008）。除以上方法外，β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法還有酶熱生物傳感器法 （周爽等，2013）、SDS-PAGE 電泳法（張鑫瀟，2011）、酶聯(lián)免疫法（姜侃等，2013）等。

2 目前存在問題與展望

通過對傳統(tǒng)方法的分析以及對現(xiàn)有檢測技術(shù)的討論，β-內(nèi)酰胺酶在檢驗(yàn)檢測方法和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)上仍存在諸多問題。

2.1 β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品狀態(tài)與單位不統(tǒng)一 在檢測過程以及文獻(xiàn)查閱過程中發(fā)現(xiàn)，不同廠家生產(chǎn)的β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品，其酶活性單位以及藥品狀態(tài)不一。其中Sigma公司為13 U/mg（干粉），TCI為 250萬 U/瓶（干粉）或 12萬 U/mL（液態(tài)），中國食品藥品鑒定研究院為600萬U/2 mL（液態(tài)），北京康牧興農(nóng)發(fā)展中心為300萬IU/mL（液態(tài)）。標(biāo)準(zhǔn)品的狀態(tài)與單位均會對β-內(nèi)酰胺酶檢測結(jié)果的可比性產(chǎn)生影響。酶的貯存狀態(tài)會直接影響酶的活力，液態(tài)酶標(biāo)品開封后酶活性降低較快，不易保存，而干粉狀標(biāo)準(zhǔn)品易于保存，溶解后在較長時(shí)間內(nèi)活性相對穩(wěn)定。并且U（單位）和IU（國際單位）（這里的單位是指生物效價(jià)單位）之間是沒有互相換算的關(guān)系（湖北畜牧獸醫(yī)，2008）。在今后的檢測過程中應(yīng)統(tǒng)一酶活力單位，以確定不同的β-內(nèi)酰胺酶活性換算關(guān)系以及酶在最適條件下的單位活性之間的差異。

2.2 無法區(qū)分內(nèi)、外源性β-內(nèi)酰胺酶 目前已知的各種檢測方法仍無法進(jìn)行內(nèi)、外源性區(qū)分，這可能會導(dǎo)致檢測中假陽性的出現(xiàn)。外源性β-內(nèi)酰胺酶多為人為添加，內(nèi)源性β-內(nèi)酰胺酶大多由牛體本身產(chǎn)生或牛感染了某些具有抗性的微生物，這些微生物在體內(nèi)能夠分泌β-內(nèi)酰胺酶，從而導(dǎo)致樣品檢測呈陽性（姜侃等，2013）。為進(jìn)一步優(yōu)化完善β-內(nèi)酰胺酶檢測方法，應(yīng)建立內(nèi)、外源性β-內(nèi)酰胺酶分離檢測技術(shù)，并對內(nèi)、外源性β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生機(jī)理進(jìn)行研究。

2.3 微生物法中標(biāo)準(zhǔn)菌株的選擇 在實(shí)驗(yàn)過程中購買的商業(yè)化藤黃微球菌按微生物標(biāo)準(zhǔn)方法活化后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其活菌不能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求的1×108～1×109cfu/mL。需對菌體進(jìn)行富集后，再調(diào)節(jié)菌體濃度使之滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。此外，藤黃微球菌在上機(jī)（微生物全自動分析儀）鑒定驗(yàn)收時(shí)會出現(xiàn)無法鑒定出結(jié)果的情況，有些菌種鑒定儀器已將藤黃微球菌重新分類為嗜根庫克菌（Kocuria rhizophila）（Jane 等，2003）， 所以在菌種購買與選擇上應(yīng)盡量購買CICC或ATCC菌株。

2.4 試劑與儀器檢測前處理除脂 不論是碘量法、酸度計(jì)法以及液相色譜法在實(shí)驗(yàn)過程中都應(yīng)去除油脂，以避免油脂導(dǎo)致顏色反應(yīng)，影響上機(jī)檢測結(jié)果?？煽紤]采用物理方法超高速離心機(jī)進(jìn)行高速離心，此法對離心機(jī)要求轉(zhuǎn)速為21000 r/min（李雪芳等，2015），或者采用化學(xué)試劑正己烷、石油醚等進(jìn)行中和。

3 小結(jié)

目前β-內(nèi)酰胺酶檢測方法較多，如微生物法、碘量法、酸度計(jì)法以及其他方法等。但沒有一種快速、準(zhǔn)確、高效的檢測方法，能為仲裁檢測提供依據(jù)。因此，優(yōu)化現(xiàn)有方法或重新建立一種可方便快捷檢測β-內(nèi)酰胺酶，又可區(qū)分內(nèi)、外源性β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法具有重要意義。β-內(nèi)酰胺酶檢測作為乳及乳制品安全性評價(jià)中的一種指標(biāo)，一個(gè)輔助手段，仍需從源頭進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)管控，建議加強(qiáng)畜牧業(yè)與乳及乳制品生產(chǎn)全過程的監(jiān)控。