復(fù)合酶輔助高壓法提取金針菇黃酮的純化及活性測定

王廣慧，譚吉麗，杜艷超，楊靜怡，尚雅楠，任麗娜

（綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江綏化 152061）

金針菇（FLammuLina veLutipes（Fr.）Sing）屬于典型的木腐生菌類，口感香脆滑嫩、味道鮮美，而且含有多種生物活性物質(zhì)如多糖、黃酮類化合物和其他免疫調(diào)節(jié)蛋白等，其中金針菇黃酮在抗氧化、抗腫瘤、抗誘變和改善記憶等方面具有明顯功效（譚一羅等，2018），可開發(fā)為人及動(dòng)物的保健食品。大孔吸附樹脂因其具有理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和有機(jī)溶劑中，對(duì)有機(jī)物選擇性好，不受無機(jī)鹽等離子和低分子化合物影響，節(jié)省費(fèi)用等諸多優(yōu)點(diǎn)，常被用于天然產(chǎn)物中有效成分的分離及純化，但目前對(duì)大孔樹脂純化金針菇黃酮的研究報(bào)道較少。王廣慧（2016）對(duì)復(fù)合酶輔助高壓法提取金針菇黃酮的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，本文將在此基礎(chǔ)上繼續(xù)探討利用此法提取的金針菇黃酮經(jīng)X-5型大孔樹脂純化后的抑菌性及抗氧化性問題，并對(duì)X-5型大孔樹脂純化金針菇黃酮的最佳工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期能為金針菇黃酮的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 金針菇、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（salmonella enteritidis），由綏化學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；X-5型大孔吸附樹脂，購自鄭州勤實(shí)科技有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、乙醇、氫氧化鈉等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純，購自天津市博迪化工有限公司；木瓜蛋白酶、纖維素酶，購自北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 主要儀器 HL-2型恒流泵，上海青浦滬西儀器廠；752型紫外-可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；TGL-20bR型冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS-25酸度計(jì)，上海偉業(yè)儀器廠；YXQ-LS-75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FW100型高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；普通玻璃層析柱（16 mm×240 mm），上海青浦滬西儀器廠；牛津杯（內(nèi)徑6 mm），上海魯碩實(shí)業(yè)有限公司；ZD-85型氣浴恒溫振蕩器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃酮含量的測定 采用硝酸鋁-亞硝酸鈉法測定金針菇中黃酮的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及線性回歸方程的獲得參見王廣慧（2016）報(bào)道的方法。

1.3.2 復(fù)合酶輔助高壓法提取金針菇黃酮 將金針菇干品用高速萬能粉碎機(jī)粉碎，過80目篩。稱取金針菇干粉，放入錐形瓶中，按照 1：35（g/mL）的料液比加入pH為6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和樣品量1.00%的復(fù)合酶 （木瓜蛋白酶和纖維素酶按質(zhì)量比1：1混合）。將錐形瓶放入50℃恒溫水浴鍋中酶解80 min。然后在115℃下進(jìn)行高壓熱水浸提40 min。提取后以3500 r/min離心處理10 min，將上清液蒸發(fā)濃縮后加入3倍體積濃度為95%的乙醇，于4℃下醇沉12 h，將多糖等雜質(zhì)離心除去，留上清液備用（王廣慧，2016）。

1.3.3 X-5型大孔吸附樹脂的預(yù)處理 稱取X-5型大孔樹脂放于錐形瓶中，加入體積濃度為95%的乙醇浸泡24 h后，先用95%乙醇洗至流出液清亮、無渾濁，再用蒸餾水洗至無醇味。然后分別用酸堿處理，即以5%（g/g）的 HCl溶液浸泡 4 h，蒸餾水洗至中性，再用 4%（g/g）的NaOH溶液浸泡4 h，蒸餾水洗至中性，備用。按如下公式計(jì)算大孔樹脂的吸附率和解析率：

式中：C1、C2、C3分別為上樣液黃酮質(zhì)量濃度、飽和時(shí)流出液黃酮質(zhì)量濃度、洗脫液黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V1、V2、V3分別表示飽和時(shí)上樣液消耗的體積、飽和時(shí)流出液體積、洗脫液體積，mL。

1.3.4 X-5型大孔吸附樹脂純化金針菇黃酮工藝的優(yōu)化 將處理后的樹脂裝入層析柱中，裝柱高度為12 cm。先以樹脂對(duì)金針菇黃酮的飽和吸附率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別探討樣品液pH、樣品液濃度、樣品液流速對(duì)吸附率的影響，然后再以黃酮解吸率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察洗脫液濃度、洗脫速率、洗脫劑用量對(duì)解析率的影響（張星等，2017；吳海霞等，2013；王國軍等，2013）。

1.3.5 純化前后金針菇黃酮純度的對(duì)比 在最佳條件下進(jìn)行吸附和洗脫，對(duì)比吸附前的黃酮純度和洗脫后的黃酮純度，即通過計(jì)算黃酮在解析液及樣品液烘干后物質(zhì)中所占的比例，得到純化倍數(shù)。做平行試驗(yàn)3次。

1.3.6 純化后金針菇黃酮的抑菌能力檢測 采用抑菌圈法測定純化后金針菇黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌4種常見菌種的抗菌活性（曹培杰等，2019；許偉等，2010）。

1.3.6.1 菌懸液的制備 將活化后的菌種放置在37℃恒溫振蕩器中，以轉(zhuǎn)速120 r/min連續(xù)振蕩培養(yǎng)約24 h。當(dāng)菌懸液在波長600 nm處OD值為0.1時(shí)取出備用。此時(shí)菌體濃度約為106～107菌落形成單位（cfu/mL）。

1.3.6.2 抑菌試驗(yàn) 在LB培養(yǎng)基平板上加入各菌懸液0.1 mL，用涂布棒涂布均勻，插入牛津杯。將0.1 mL不同質(zhì)量濃度（mg/mL）經(jīng)生理鹽水稀釋的金針菇黃酮溶液加入杯中，以生理鹽水作為對(duì)照，置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察統(tǒng)計(jì)抑菌圈大小，并評(píng)價(jià)其抑菌效果。所有試驗(yàn)均設(shè)3組平行。

1.3.7 金針菇黃酮的抗氧化性研究 根據(jù)楊文建等（2017）和弓威等（2015）的方法進(jìn)行金針菇黃酮的抗氧化研究。

1.3.7.1 對(duì)DPPH·清除能力的測定 在具塞試管中加入濃度為1.0×10-4mol/L的DPPH溶液3.5 mL和無水乙醇0.5 mL，閉光靜置30 min，測定其在517 nm下吸光度A0；以0.5 mL樣品液代替0.5 mL無水乙醇，其余同上，測出吸光度A1；取 3.5 mL無水乙醇與0.5 mL樣品液，相同波長下測得吸光度A2。以3.5 mL無水乙醇和0.5 mL蒸餾水的混合液作為空白對(duì)照。平行測定3次，取平均值。同時(shí)以Vc為對(duì)照。

1.3.7.2 對(duì)O2-·清除能力的測定 向試管中加入2.8 mL pH 8.2的Tris-HCl緩沖液 （50 mmol/L)及0.1 mL不同濃度的黃酮提取液，放入25℃恒溫水浴鍋中，保溫10 min，加入0.1 mL同樣條件下預(yù)溫的60 mmol/L鄰苯三酚 （以60 mmol/L鹽酸配制)，立即搖勻，倒入比色杯中，在420 nm處每隔0.5 min測一次吸光值，此吸光值記為A1。

用0.1 mL同樣條件下預(yù)溫的HCl溶液（60 mmol/L）代替鄰苯三酚，其余步驟同上，測得吸光值A(chǔ)2；保留鄰苯三酚，但用0.1 mL蒸餾水替代黃酮提取液，其余操作同上，測得吸光值A(chǔ)0。平行測定3次，取平均值。同時(shí)以Vc作為對(duì)照。

1.3.7.3 對(duì)OH·清除能力的測定 在試管中加入1.0 mL不同濃度的黃酮提取液，然后依次加入2.00 mL的 1.8 mmoL/mL FeS04溶液、1.5 mL的1.8 mmoL/mL水楊酸-乙醇、0.10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%的H2O2溶液，振蕩混合，放入37℃恒溫水浴鍋中保溫30 min，然后在510 nm下測定吸光度值 A1；用 0.10 mL蒸餾水代替 H2O2，重復(fù)上述操作，測得吸光度值A(chǔ)2；保留過氧化氫，但用蒸餾水代替黃酮提取液，重復(fù)上述操作，測得吸光值A(chǔ)0。以Vc作為對(duì)照。

1.3.7.4 對(duì)ABTS·清除能力的測定 精密稱取ABTS 40.00 mg，依次加入10 mL蒸餾水，8.00 mL的1.0 mg/mL過硫酸鉀，在室溫避光條件下靜置16 h，然后轉(zhuǎn)移到250 mL容量瓶中，加32 mL蒸餾水，用無水乙醇定容至刻度，放置10 h備用。

在5只試管中依次加入0.5 mL不同濃度的黃酮提取液、1.5 mL 95%乙醇、2 mL配好的ABTS溶液，混合，靜置30 min，在734 nm波長下測出吸光度值A(chǔ)1；用2 mL蒸餾水代替ABTS溶液，其他步驟同上，測得吸光度A2；保留ABTS溶液，但以95%乙醇代替黃酮提取液，其他步驟同上，測出吸光度值A(chǔ)0。同時(shí)以Vc作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性回歸方程 按照王廣慧（2016）所述方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y=0.0949x+0.0024，R2=0.9992，其中 y 為吸光度值，x為蘆丁濃度（mg/mL）。

2.2 X-5型大孔樹脂純化金針菇黃酮工藝的優(yōu)化

2.2.1 樣品液pH對(duì)飽和吸附率的影響 用5%鹽酸溶液和2%的NaOH溶液調(diào)節(jié)樣品液pH，分別設(shè)定為 4、5、6、7、8，上樣流速為 0.35 mL/min，上樣濃度為1.2 mg/mL，進(jìn)行吸附試驗(yàn)并計(jì)算飽和吸附率（即當(dāng)流出液的濃度達(dá)到初始濃度的1/10時(shí)，即可認(rèn)為樹脂已吸附飽和）。每個(gè)樣品做三組平行試驗(yàn)，取平均值，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

由圖1可知，樣品液pH太大和太小都不利于黃酮的吸附，原因可能是在弱酸狀態(tài)下，黃酮類化合物以分子形式存在，容易被大孔樹脂吸附，但酸性較強(qiáng)時(shí)，黃酮分子中的氧原子易形成鹽而帶上正電荷，不易被吸附；在偏堿性的狀態(tài)下，黃酮分子羥基中的氫易解離，所以不容易被大孔樹脂吸附。因此選擇pH 5作為X-5大孔吸附樹脂吸附金針菇黃酮的最佳pH。

2.2.2 樣品液濃度對(duì)飽和吸附率的影響 調(diào)節(jié)樣品液pH為5，設(shè)定樣品液濃度分別為0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mg/mL， 上樣流速為 0.35 mL/min，進(jìn)行吸附試驗(yàn)并計(jì)算飽和吸附率。試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

由圖2可知，當(dāng)樣品液濃度為1.4 mg/mL時(shí)，金針菇黃酮的吸附率最大，原因可能是樣品液濃度太大，超過了樹脂吸附的極限，黃酮就會(huì)過早流出，不易被吸附，導(dǎo)致吸附率降低；樣品液濃度太小，不足以被大孔樹脂吸附。因此選擇1.4 mg/mL濃度作為X-5大孔吸附樹脂吸附金針菇黃酮的最適濃度。

2.2.3 樣品液流速對(duì)飽和吸附率的影響 在樣品液濃度為1.4 mg/mL，pH為5的條件下，設(shè)定樣品液流速分別為 0.20、0.35、0.5、0.65、0.80 mL/min，進(jìn)行吸附試驗(yàn)并計(jì)算飽和吸附率。試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

由圖3可知，樣品液流速為0.2 mL/min時(shí)吸附率最高，原因可能是流速較慢時(shí)提取液與樹脂接觸的時(shí)間較長，有利于黃酮類物質(zhì)擴(kuò)散到樹脂內(nèi)部，從而提高了吸附率。

2.2.4 洗脫劑濃度對(duì)解析率的影響 在最佳條件下吸附飽和的樹脂用蒸餾水清洗至無色，然后用乙醇洗脫。乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%，洗脫流速為2 mL/min，乙醇用量為50 mL，計(jì)算總黃酮解析率。試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

由圖4可知，當(dāng)洗脫劑體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，洗脫效果最好，原因可能是由于70%乙醇溶液與黃酮的極性最接近。根據(jù)“相似者相溶”的原理，此乙醇濃度下最有利于黃酮的洗脫。

2.2.5 洗脫劑流速對(duì)解析率的影響 采用70%乙醇溶液50 mL進(jìn)行洗脫，設(shè)定洗脫劑流速分別為 1、2、3、4、5 mL/min，計(jì)算總黃酮解析率。 試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

由圖5可知，洗脫速率越慢解析率越高，洗脫速率太快不宜于金針菇黃酮的洗脫，原因可能是流速越慢洗脫劑與樹脂的接觸越充分，洗脫的也更徹底，因此選擇1 mL/min為金針菇黃酮的最佳洗脫速率。

2.2.6 洗脫劑用量對(duì)解析率的影響 采用70%乙醇溶液以1 mL/min的速率進(jìn)行洗脫，設(shè)定洗脫劑用量為 10、20、30、40、50、60 mL，計(jì)算總黃酮解析率。試驗(yàn)結(jié)果見圖6。

由圖6可知，在洗脫劑用量為60 mL時(shí)，樹脂上吸附的黃酮類化合物完全被洗出，因此選洗脫液的最佳用量為60 mL。

2.3 純化前后金針菇黃酮純度的對(duì)比 由表1可知，三組平行試驗(yàn)中純化后金針菇黃酮的純度平均是純化前的1.83倍，可見用此工藝條件純化金針菇黃酮效果較好。

表1 純化前和純化后的黃酮純度

2.4 純化后金針菇黃酮的抑菌性研究結(jié)果 由表2可知，在測試濃度范圍內(nèi)，幾個(gè)菌種的培養(yǎng)基上均有抑菌圈形成，可見金針菇黃酮對(duì)4種菌體均有不同程度的抑制作用，其抑菌效果隨著金針菇黃酮濃度的增大而增強(qiáng)。抑菌程度大小的順序?yàn)椋捍竽c桿菌＞沙門氏菌＞金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌。

表2 黃酮濃度對(duì)菌種抑菌圈直徑的影響

2.5 金針菇黃酮的抗氧化性研究結(jié)果

2.5.1 對(duì)DPPH·清除能力的測定結(jié)果 由圖7可知，當(dāng)濃度為0.25～0.85 mg/mL時(shí)，金針菇黃酮和Vc對(duì)DPPH·的清除率都隨著濃度的加大而升高，但在同濃度下金針菇黃酮的清除率明顯低于Vc。

2.5.2 對(duì)O2-·清除能力的測定結(jié)果 由表3可知，在一定濃度下，隨著時(shí)間的延長，金針菇黃酮和VC對(duì)O2-·的清除率都呈下降趨勢。當(dāng)濃度為0.25～0.85 mg/mL時(shí)，二者對(duì)O2-·的清除率都隨著濃度的加大而提高，但金針菇黃酮的清除率總體上來看比相同濃度時(shí)的Vc低。

2.5.3 對(duì)OH·清除能力的測定結(jié)果 由圖8可知，當(dāng)濃度為0.25～0.85 mg/mL時(shí)，金針菇黃酮和VC對(duì)OH·的清除率都隨濃度的增加而增加，但在同濃度下，金針菇黃酮對(duì)OH·的清除能力比Vc弱。

2.5.4 對(duì)ABTS·清除能力的測定結(jié)果 由圖9可知，當(dāng)濃度為0.25～0.85 mg/mL時(shí)，金針菇黃酮和Vc對(duì)ABTS·的清除率均隨二者濃度的增加而升高，但當(dāng)濃度相同時(shí)，前者的清除率明顯弱于后者。

3 結(jié)論

本文主要是對(duì)采用復(fù)合酶輔助高壓法提取的金針菇黃酮經(jīng)X-5型大孔樹脂純化后的抑菌和抗氧化能力進(jìn)行檢測，同時(shí)對(duì)X-5型大孔樹脂純化金針菇黃酮的條件進(jìn)行了優(yōu)化研究。根據(jù)研究結(jié)果得出如下結(jié)論：

表3 黃酮與Vc清除超氧陰離子自由基能力比較

3.1 X-5型大孔樹脂可以作為純化金針菇黃酮的介質(zhì)，其最佳吸附條件為：濃度1.4 mg/mL，pH 5，上樣流速為0.2 mL/min；最佳洗脫條件為：濃度70%的乙醇60 mL，洗脫速率1 mL/min。在此條件下得到的黃酮純度是純化前的1.83倍。

3.2 抑菌試驗(yàn)表明：金針菇黃酮對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用，其抑菌效果隨著金針菇黃酮濃度的增大而增強(qiáng)。抑菌程度大小的順序?yàn)?大腸桿菌＞沙門氏菌＞金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌。

3.3 抗氧化試驗(yàn)表明：Vc和金針菇黃酮溶液均具有抗氧化作用，金針菇黃酮和Vc溶液對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基和ABTS自由基的清除能力均隨著濃度的增加而增大；金針菇黃酮對(duì)這四種自由基的清除能力均要弱于Vc。

由以上研究結(jié)果可知，利用復(fù)合酶輔助高壓法提取金針菇黃酮后采用X-5型大孔樹脂進(jìn)行純化處理，此工藝流程可行。