高粱自毒物質(zhì)降解細(xì)菌的篩選

石 瑞，張亞琪，馮玉萍，吳 丹

（忻州師范學(xué)院 生物系，山西忻州 034000）

山西是我國高粱生產(chǎn)的主要省區(qū)之一，連年種植高粱，導(dǎo)致高粱連作障礙嚴(yán)重，影響高粱的可持續(xù)發(fā)展。高粱連作障礙的原因之一是根系分泌自毒物質(zhì)的累積。而根系分泌的自毒物質(zhì)大多是酚酸類物質(zhì)（李雪利，2009），為此篩選高粱自毒物質(zhì)的降解菌對解決高梁連作障礙至關(guān)重要。

目前已經(jīng)篩選出了降解草莓（杜霄霞，2009）、人參（趙東岳，2013）、蘋果（祁國振，2018）、花生（何志剛，2014）、番茄（何志剛，2017）、黃瓜（郭麗園，2015；孫秀，2014）等多種植物根系分泌酚酸類自毒物質(zhì)的細(xì)菌、真菌或放線菌，郭麗園（2015）以外源對羥基苯甲酸為唯一碳源篩選出了黃瓜自毒物質(zhì)降解菌株，細(xì)菌GLY-P3和放線菌株GLYP1、GLY-P2。 孫秀（2014）以外源肉桂酸為唯一碳源篩選出了黃瓜自毒物質(zhì)降解細(xì)菌42-3和降解真菌2-4。樊芳芳等（2016）在高粱連作試驗中發(fā)現(xiàn)，與玉米高粱輪作比較，高粱連作會降低長勢和產(chǎn)量。吳蕾等（2009）進(jìn)一步研究證實了酚酸類化合物鄰苯二甲酸、沒食子酸對高粱的化感作用。

目前對高粱自毒物質(zhì)降解菌的篩選鮮有報道，測定降解率的方法也較單一，多用紫外分光光度法測定。所以本試驗以此為出發(fā)點，以外源鄰苯二甲酸及沒食子酸為唯一碳源篩選高粱自毒物質(zhì)降解菌株，旨在提高自毒物質(zhì)降解率，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 連作高粱根際土壤，晉雜16號高粱種子，福林酚試劑，鄰苯二甲酸，沒食子酸。初篩固體選擇性培養(yǎng)基（孫秀，2014）：硝酸銨1 g，硫酸銨0.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，磷酸氫二鉀1 g，氯化鈉0.5 g，硫酸鎂0.5 g，鄰苯二甲酸或沒食子酸0.5 g，瓊脂條 15 ～ 20 g，蒸餾水 1000 mL，pH 7.2。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉 5 g，瓊脂 20 g，pH 7.4 ～ 7.6，蒸餾水 1000 mL。種子發(fā)酵液培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉10 g，pH自然。降解率測定培養(yǎng)基：同初篩固體選擇性培養(yǎng)基。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g。方法：去皮的馬鈴薯切塊兒，放入蒸餾水中煮到用玻璃棒可以戳破為止，然后用紗布過濾，再加入稱好的糖和瓊脂，加熱融化后補(bǔ)水至1000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤樣品的制備 取高粱重茬地根際土壤用于沒食子酸、鄰苯二甲酸降解細(xì)菌篩選，并于4℃冰箱中保存土壤。

1.2.2 鄰苯二甲酸、沒食子酸篩選濃度的確定分別制備梯度鄰苯二甲酸溶液與沒食子酸溶液，濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L。 121 ℃滅菌 20 min，冷卻后倒平板，每個濃度三個重復(fù)。將高粱種子用3%過氧化氫消毒15 min，用蒸餾水沖洗數(shù)次，于凈化工作臺接入不同處理培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿20粒高粱種子，28℃避光萌發(fā)數(shù)天，觀察種子的生長情況。

1.2.3 降解菌的初篩

1.2.3.1 土壤懸液制備 采用稀釋法處理采集的高粱根際土壤。稱取高粱根際土10 g，加入裝有90 mL無菌水的錐形瓶中，即制成10-1土壤懸液，于28℃富集培養(yǎng)30 min后充分振蕩。土粒沉淀后，吸取1 mL上清液，移入裝有9 mL蒸餾水的試管中，制成10-2土壤懸液，依此類推按10倍稀釋法依次稀釋成 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8土壤懸液。

1.2.3.2 菌涂布 用75%酒精棉清潔凈化工作臺，將滅菌后的平板、初篩固體選擇性培養(yǎng)基、酒精燈、火柴、封口膜等放入無菌操作臺中，紫外滅菌30 min。將手進(jìn)行消毒后進(jìn)入凈化工作臺進(jìn)行操作，點燃酒精燈將裝有培養(yǎng)基的三角瓶的瓶口在酒精燈上過火滅菌，倒平板時將培養(yǎng)基向平板的中部倒。平板中的培養(yǎng)基冷卻后，取10-5、10-6、10-7、10-8四個濃度的土壤懸液，每個梯度重復(fù)三個培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿100μL土壤懸液，用涂布器從中間向四周涂抹均勻，用記號筆標(biāo)注清楚后過火。用封口膜密封，放入恒溫培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)。待涂布平板長出菌落后，肉眼觀察其生長情況，并將所有具有不同形態(tài)的菌在新的相應(yīng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線分離。劃線后，細(xì)菌置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，真菌置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每24 h觀察是否出現(xiàn)明顯的單菌落，若出現(xiàn)特征相同的單菌落，則該分離物種為純種并將其進(jìn)行保存。若不為純種，則可以根據(jù)單菌落的不同特征區(qū)分幾種不同的微生物，分別挑取分離并保存。

1.2.4 降解菌的復(fù)篩

1.2.4.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 根據(jù)王曉敏（2018）報道的方法稱取沒食子酸5 mg置于100 mL容量瓶中，蒸餾水溶解，搖勻定容至刻度制成50 μg/mL 的沒食子酸溶液。 分別取 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL 沒食子酸溶液于 50 mL 容量瓶中，各加入蒸餾水30 mL，福林酚試劑2 mL，搖勻，1 min后加入6 mL 20%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至刻度，75℃水浴10 min后冷卻至室溫并于760 nm處測吸光值。調(diào)零溶液除不加沒食子酸對照液外，其他試劑條件都相同。將可見分光光度計開機(jī)預(yù)熱20 min后，向比色皿中加入3/4的調(diào)零溶液調(diào)零，然后分別加入待測液，重復(fù)測定三次吸光值。

1.2.4.2 細(xì)菌種子培養(yǎng) 將初篩得到的所有細(xì)菌，每種細(xì)菌挑取三個單菌落，于凈化工作臺分別用接種環(huán)接種到250 mL三角瓶中 （裝有種子發(fā)酵液培養(yǎng)基20 mL），每株一瓶，用記號筆做好標(biāo)記，37℃、160 r/min恒溫?fù)u床搖瓶活化30 h左右。

1.2.4.3 調(diào)整OD值 600 nm處調(diào)整種子液OD值在1左右，用滅菌后的發(fā)酵種子培養(yǎng)液調(diào)整稀釋。

1.2.4.4 降解率的測定 在250 mL三角瓶中裝入50 mL降解率測定培養(yǎng)基，加1 mL細(xì)菌種子液，于37℃、160 r/min恒溫?fù)u床搖瓶培養(yǎng)4、8、12 h后，分別取發(fā)酵液5 mL于10 mL離心管中，4000 r/min離心10 min，取離心后的上清發(fā)酵液即降解液3 mL于10 mL試管中，添加0.4 mL福林酚試劑，1 min后加入20%碳酸鈉溶液1.2 mL，于75℃恒溫水浴加熱10 min，待冷卻至室溫后，測760 nm處的吸光值。沒食子酸降解液稀釋5倍后測定。

降解率/%=（空白酚酸剩余量-處理酚酸剩余量）/空白酚酸剩余量。（空白：由降解率測定培養(yǎng)基和不加菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組成；處理：由降解率測定培養(yǎng)基和降解菌種子液組成）。

1.2.4.5 真菌種子液制備及降解率測定 將分離得到的真菌挑取單菌落劃線分離，待PDA平板上長出菌落后輕輕將菌株孢子刮起，向篩選到的鄰苯二甲酸與沒食子酸降解真菌的PDA平板中加入少量滅菌后的0.85%生理鹽水沖洗，洗液倒入滅菌后的錐形瓶中，搖床振蕩，制得單孢子懸液，控制孢子濃度為1×107cfu/mL。測降解率方法同1.2.4.4。

1.2.5 降解菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 將降解細(xì)菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上劃線分離，30℃培養(yǎng)；降解真菌在PDA培養(yǎng)基平板上三區(qū)劃線，28℃培養(yǎng)，待長出單菌落后，觀察菌落的大小、形態(tài)、顏色、透明度、邊緣、表面形狀及菌體的濕潤度。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 由圖1可知，沒食子酸含量x與吸光度y的回歸方程為：y=0.0665x-0.0439，R2=0.9985，線性范圍為1～10μg/mL。

2.2 降解菌篩選濃度的確定結(jié)果 由圖2可得出，當(dāng)自毒物質(zhì)濃度逐漸增高時，抑制作用也逐漸增強(qiáng)，發(fā)芽勢逐漸降低，在濃度為0.5 g/L時抑制作用更明顯，不發(fā)芽。所以選擇濃度0.5 g/L為高粱自毒物質(zhì)降解菌的篩選濃度。

2.3 降解菌的初篩結(jié)果 經(jīng)過降解菌的初篩，初步得到兩株降解沒食子酸的細(xì)菌M-1、M-2以及兩株降解沒食子酸的真菌M-3、M-4。以鄰苯二甲酸為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基篩選出三株降解鄰苯二甲酸的細(xì)菌L-1、L-2、L-3以及一株降解鄰苯二甲酸的真菌L-4。

2.4 降解菌的復(fù)篩結(jié)果 由圖3可看出，在12 h以內(nèi)降解液中自毒物質(zhì)含量隨著時間延長而降低，表明所篩選的M-1、M-2兩種菌有降解沒食子酸的能力，空白在12 h內(nèi)變化不明顯；菌M-1在12 h內(nèi)，隨著時間延長，自毒物先升后降，12 h時降解效果最顯著 （P＜0.01）。菌M-2在12 h內(nèi)，自毒物質(zhì)隨著時間延長逐漸降低，12 h時降解效果最顯著（P＜0.01）。菌M-1降解率為30%，菌M-2降解率為36%。

由圖4可以看出，空白和處理均在4 h時升高，4 h后經(jīng)過三株菌處理后的降解液中自毒物都逐漸降低，表明篩選得到的L-1、L-2、L-3三株菌對鄰苯二甲酸均具有一定的降解能力。其中菌L-2的降解效果最好，12 h時降解率為41%。菌L-3降解效果好于菌L-1。菌L-1的降解率為32%，菌L-3的降解率為33%。

2.5 降解菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 降解真菌和降解細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征見表1和表2。

3 結(jié)論

本試驗采用福林酚法在高梁自毒物質(zhì)降解菌的篩選中取得了較好的效果，在連作多年的高粱根際土壤中篩選到了降解沒食子酸的2株細(xì)菌菌株M-1、M-2以及降解鄰苯二甲酸的三株細(xì)菌 L-1、L-2、L-3， 降解率分別為 30%、36%、32%、41%、33%。其中菌株M-2與L-2降解效果相對較好。

表1 降解真菌形態(tài)學(xué)特征

表2 降解細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征