B10細(xì)胞在益氣升提法治療EAMG大鼠中的作用＊

許夢賢，尚衛(wèi)兵，魏亞男，姬夢姣，吳顥昕

（南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 南京 210023）

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是神經(jīng)—肌肉接頭處的自身免疫性疾病，在細(xì)胞免疫依賴性和補(bǔ)體參與下由乙酰膽堿受體抗體（acetylcholine receptor anti-body，AchR-Ab）介導(dǎo)[1]。其病理特征是對大多數(shù)患者的乙酰膽堿受體（AChR）產(chǎn)生自身抗體，或?qū)ζ渌颊叩募∪馓禺愋岳野彼峒っ福∕USK）產(chǎn)生自身抗體，以及對較小亞群中越來越多的其他蛋白產(chǎn)生自身抗體。致病原因是自身抗體引起神經(jīng)肌肉接頭內(nèi)乙酰膽堿受體（AChR）數(shù)量減少或AChR功能受損。其中B淋巴細(xì)胞主要參與AchR-ab的生成，在MG發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮發(fā)揮著重要的作用[2]。

MG的治療目前是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一個(gè)難題，治療方法一般有：使用膽堿酯酶抑制劑；免疫抑制劑；免疫吸附法；靜脈注射免疫球蛋白；胸腺摘除手術(shù)等方法，近年來關(guān)于MG治療的研究主要在分子靶向治療上。這些方法存在易復(fù)發(fā)或者副作用大等缺點(diǎn)。

中醫(yī)里沒有重癥肌無力這個(gè)病名，根據(jù)其全身無力，呼吸困難，勞累后加重，休息后減輕，眼瞼下垂等這些臨床癥狀，中醫(yī)把它歸納為痿癥?！吨匕Y肌無力中醫(yī)實(shí)踐錄》（人民衛(wèi)生出版社）中將MG分為7種證型：脾胃氣虛、氣陰兩虛、氣血虧虛、脾腎陽虛、氣虛痰阻、氣虛血瘀及肝腎陰虛[3]。根據(jù)李廣文等對全國274例MG病人的統(tǒng)計(jì)，其中“脾胃氣虛”型病人所占比例最大[4]。中醫(yī)里對痿癥的治法主要包括從肝論治，從脾腎論治，從宗氣論治，從濕論治，從淤血論治，及分經(jīng)論治等。

其中益氣升提法是臨床上中醫(yī)治療MG眾多方法中的代表方法之一。最早可以追溯于《黃帝內(nèi)經(jīng)》中《素問·至真要大論》這一篇中：“下者舉之”、“衰者補(bǔ)之”[5]。近代醫(yī)家張錫純認(rèn)為“大氣下陷”是MG的基本病機(jī)，而脾胃是氣機(jī)升降之本，所以提出用升陷湯和補(bǔ)中益氣湯來治療MG。而黃芪、升麻、柴胡為補(bǔ)中益氣湯和升陷湯的共同藥物。一般在臨床中用益氣升提法配伍時(shí)柴胡和升麻用藥的劑量比較固定為10 g，但黃芪的用藥劑量差異較大，從20-150 g不等。而漢代名醫(yī)張仲景在《金匱要略》里記載的含有黃芪的方劑中，其中用量為19-75 g。本課題組前期研究也證明了，以黃芪、柴胡、升麻為代表配伍的益氣升提法對治療MG有顯著的療效，并探討不同劑量的黃芪和柴胡、升麻配伍的益氣升提法了對T細(xì)胞的影響機(jī)制[6]。于是本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究B淋巴細(xì)胞在益氣升提法治療MG時(shí)的影響機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 動(dòng)物材料

1.1.1 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，年齡：4-6周齡；體重：130-150 g；性別：雌性；品系：Lewis大鼠；數(shù)量：48只；許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)在南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)腦病實(shí)驗(yàn)室，其為SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 藥物

選用強(qiáng)的松（5 mg∕片）為陽性藥物，其生產(chǎn)批號(hào)為018150501，購買于上海信誼藥廠有限公司；中藥購于北京同仁堂股份有限公司，各組藥物劑量如下——益氣升提黃芪低劑量組（以下簡稱“低劑量組”）：黃芪20 g，柴胡10 g，升麻10 g，益氣升提黃芪中劑量組（以下簡稱“中劑量組”）：黃芪40 g，柴胡10 g，升麻10 g，益氣升提黃芪高劑量組（以下簡稱“高劑量組”）：黃芪80 g，柴胡10 g，升麻10 g。黃芪（Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge）、柴 胡（Bupleurum chinense）、升 麻（Cimicifuga heracleifolia Komar），藥材品質(zhì)的鑒定由南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院腦病實(shí)驗(yàn)室陶偉偉副教授完成。

1.1.3 試劑和儀器

鼠源AchR-c亞基97-116肽（R（-116定由），序列號(hào)為：DGDFAIVKFTKVLLDYTGHI。完全福氏佐劑（CFA）和不完全福氏佐劑（IFA）購買于美國Sigma公司。結(jié)核桿菌H37Ra干粉購買于美國Difco Bacto公司。CD19，GAPDH抗體：美國Abcam公司。大鼠CD19，白細(xì)胞介素10（interleukin-10）引物由上海生工生物合成。大鼠AchR-Ab、白細(xì)胞介素10 interleukin-10ELISA試劑盒夠購買于南京金益柏生物科技有限公司。電泳轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad Laboratories，Inc，Hercules,CA，USA）；Tannon-5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立動(dòng)物模型

參考Na L[7]和Baggi F等[8]，通過皮下注射人工合成的Ach多肽的方法，建立EAMG模型[9]。第1 d將等量的PBS含（Rα97-116 100μg、H37Ra1干粉1 mg）溶液與CFA充分混勻的200μL乳劑注射在造模大鼠的肩背部和尾基部；將PBS與CFA等量混勻后的200 mL乳劑注射于佐劑對照組。第30 d和45 d，用IFA替換CFA，其余步驟與上次相同，使其強(qiáng)化免疫。造模周期總共為60 d。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

模型大鼠癥狀的評判方法采用Lennon VA分級法[10]，按照癥狀的表現(xiàn)一共將造模大鼠分為4級。0級：大鼠沒有明顯的肌無力表現(xiàn)；1級：大鼠的活動(dòng)減少并且表現(xiàn)出易疲勞的狀態(tài)，四肢的力量較差，抓握力減小，撕咬無力，牙齒明顯變長；2級：大鼠的無力表現(xiàn)更加明顯，隆背，大腿外展，偶爾會(huì)震顫，行動(dòng)不穩(wěn)；3級：大鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的肌無力癥狀，撕咬動(dòng)作和叫聲均已消失，呼吸也開始變得困難，處于瀕死狀態(tài)或者死亡。

1.2.3 分組和給藥

在造模之前，將8只大鼠隨機(jī)選出，作為佐劑對照組。對剩下的40只大鼠進(jìn)行造模，在第60天造模結(jié)束后對造模的大鼠進(jìn)行模型評估，將造模后的大鼠隨機(jī)分為模型對照組，低劑量組，中劑量組，高劑量組，陽性對照組，每組8只。實(shí)際的給藥劑量以人和大鼠1∶8的比例根據(jù)體重折算。低劑量組：5.3 g∕（kg·d），中劑量組：8 g∕（kg·d），中劑量組：13.3 g∕（kg·d），陽性對照組：強(qiáng)的松5.4 mg∕（kg·d）（純水溶解），模型對照組給與生理鹽水灌胃30 d。

1.2.4 檢測指標(biāo)和方法

（1）體重

實(shí)驗(yàn)期間每周進(jìn)行兩次大鼠體質(zhì)重測量并記錄。

（2）低頻重復(fù)神經(jīng)電刺激（repetitive nerve stimulation，RNS）衰減率（D）

參照許文華等[11]方法，將10%水合氯醛作為麻醉劑，按照30 mg∕kg的劑量腹腔注射大鼠，選4根針灸針作為電極，在坐骨神經(jīng)附近肌肉內(nèi)和腹部皮插入兩根針作為刺激電極和參考電極，在同側(cè)的腓腸肌內(nèi)、跟腱附著處刺入兩根針作為兩個(gè)記錄電極，電刺激的頻率分別是3Hz、5Hz、10Hz，每個(gè)頻率都連續(xù)電刺激10次，檢測系統(tǒng)為BL-420S生物機(jī)能系統(tǒng)。RNS衰減率（D）的計(jì)算公式為：D（%）=（動(dòng)作電位1-動(dòng)作電位5）∕動(dòng)作電位1作電位位為。

（3）ELISA檢測大鼠外周血中AChR-Ab，IL-10水平

在造模結(jié)束之后眼眶取血，靜置30 min后離心15 min，離心條件為3 000 r·min-1、4℃，提取上層血清后置于-20℃冰箱保存用于AchR-Ab水平的檢測。用同樣的方法在給藥結(jié)束后取血及提取血清，保存條件相同，根據(jù)ELISA試劑盒的說明檢測Achr-ab和IL-10水平。

（4）WB檢測胸腺中CD19蛋白表達(dá)

每組大鼠取胸腺30 mg進(jìn)行檢測，提取蛋白并用BCA法測細(xì)胞蛋白濃度。每孔加5μl樣品，Gapdh作為內(nèi)參?？贵w稀釋比例分別為：1∶1 000兔抗鼠CD19抗體及1∶10 000兔抗鼠Gapdh抗體。4℃孵育過夜后用稀釋比例1∶5 000HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體37℃孵育1 h。采用Tanon-5200全自動(dòng)化發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行顯影分析。采集目的蛋白和內(nèi)參GAPDH的灰度值，計(jì)算各樣本蛋白的灰度比值。

（5）RT-PCR檢測胸腺中CD19，IL-10基因表達(dá)

每組大鼠取胸腺30 mg進(jìn)行檢測，使用Trizol試劑提取組織總RNA。加入RNA和其他反應(yīng)物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，合成條件為42℃孵育1 h，90℃孵育5 min后置于冰上冷卻。然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。大鼠CD19，IL-10引物由上海生工生物公司設(shè)計(jì)及合成，CD19引物：上游5'-TGAAGAGCCAGACAGCGAGGAG-3'，下游5'GTTCTCATAGCCACTGCCATCCTG-3'；IL-10引物：上游5'-AAAGCAAGGCAGTGGAGCAG-3'，下游5'-TCAAACTCATTCATGGCCTTGT-3'；目標(biāo)條帶β-action引物：上游5'-AGAACATCATCCCTGCATCC-3'，下 游5'-TG-GATACATTGGGGGTAGGA-3'。以目的條帶與β-action灰度值比值反映CD19和IL-10的RNA相對表達(dá)水平。

圖1 各組大鼠體重情況（n=8，g）

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS24.0軟件，結(jié)果用x±s表示，兩組組間比較采用T-test，多組組間比較采用one-way ANOVA，P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的體重在給藥前后的變化

第1 d，各組大鼠的體重基本相同。在進(jìn)行造模后，同佐劑組比較，各模型組大鼠的體重增長明顯緩慢，均存在顯著性差異（P＜0.001）。給藥后，模型對照組體重開始下降，與佐劑組比較有顯著性差異（P＜0.001）；陽性藥組和低中高劑量組體重有明顯上升趨勢，與模型對照組相比，有顯著性差異（P＜0.001）（圖1）。

2.2 給藥前后RNS衰減變化

給藥后，在不同頻率的電刺激下，各模型組RNS衰減率有不同程度的衰減，其中衰減率最高的是模型對照組，佐劑組與其相比有顯著性差異（P＜0.01，P＜0.001）。各給藥組與模型對照組相比，在3 hz刺激下，陽性藥物組和低中高劑量組RNS衰減率均明顯下降，存在顯著性差異（P＜0.01，P＜0.001）；在5 hz刺激下，陽性藥組和中高劑量組RNS衰減率均明顯下降，存在顯著性差異（P＜0.05，P＜0.001），低劑量組沒有顯著性，但是RNS衰減率呈下降趨勢；在10hz刺激下，陽性藥物組和低中高劑量RNS衰減率明顯下降，存在顯著性差異（P＜0.01，P＜0.001）（圖2）。

圖2 給藥后大鼠RNS衰減率變化（n=8）

表2 給藥后大鼠血清中Achr-ab和IL-10含量變化

2.3 給藥后大鼠血清Achr-ab，IL-10含量變化

給藥后，模型對照組大鼠與佐劑組相比，血清中Achr-ab含量明顯升高，有顯著性差異（P＜0.001）。各給藥組與模型對照組比較，AChR-Ab含量均明顯下降，有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）其中陽性藥物組和高劑量組血清中Achr-ab濃度下降最顯著；模型對照組與佐劑對照組相比，血清中IL-10含量明顯降低，有顯著性差異（P＜0.001）；與模型對照組比，中高劑量組明顯上升，有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01），陽性藥物組和低劑量組雖然IL-10濃度升高沒有顯著性，但是也處于上升趨勢（表2）。

2.4 給藥后大鼠胸腺組織中CD19蛋白表達(dá)情況

給藥后，模型對照組與佐劑組相比，CD19蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，具有顯著性（P＜0.001）；陽性藥組和低中高劑量組與模型對照組相比，CD19蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），其中低劑量組與模型組相比，蛋白表達(dá)下調(diào)最顯著,其顯著性為P＜0.001。陽性藥物組和黃芪中劑量組對CD19蛋白表達(dá)下調(diào)次之（P＜0.01）。黃芪高劑量組對CD19蛋白表達(dá)下調(diào)的影響相較于陽性藥物組和黃芪低中高劑量組較差，但與模型組比較也有顯著性（P＜0.05）（圖3）。

2.5 給藥后大鼠胸腺組織中CD19基因表達(dá)情況

給藥后，模型對照組與佐劑組相比較，CD19基因表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；陽性藥和低中高劑量組與模型對照組相比，CD19基因均表達(dá)下調(diào)，有顯著性差異（P＜0.01，P＜0.001）。黃芪低中高三個(gè)劑量組與陽性藥物組相比下調(diào)更加顯著，其中黃芪低劑量組下調(diào)結(jié)果最好（圖4）。

2.6 給藥后大鼠胸腺組織中IL-10基因表達(dá)情況

給藥后，模型對照組與佐劑組相比，IL-10基因表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.001）；陽性藥和低中高劑量組與模型對照組相比，IL-10基因表達(dá)均下調(diào)，有顯著性差異（P＜0.001）。其中陽性藥物組下調(diào)最明顯，但與黃芪低中高劑量組沒有明顯差異。

3 討論

圖3 給藥后大鼠CD19蛋白表達(dá)水平

圖4 CD19基因表達(dá)水平

MG的病變主要累及神經(jīng)肌肉接頭（neuromuscularjunction，NMJ）處的AchR，其機(jī)制是在T細(xì)胞介導(dǎo)下，由B細(xì)胞產(chǎn)生AchR-Ab，與AchR結(jié)合并產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，一方面通過引起肌肉正常細(xì)胞膜溶解而受到大量破壞；一方面可以使膜表面的交聯(lián)而增加退化速度[12]。B細(xì)胞通常聚集在淋巴器官的增生性胸腺中，這些結(jié)構(gòu)的存在和頻率與AChR自身抗體呈正相關(guān)，反映了它們在AChR-Ab生成中的作用[13]。在免疫反應(yīng)中，B細(xì)胞既可以起到正調(diào)節(jié)作用，又可以起到負(fù)調(diào)節(jié)作用[14]。

圖5 IL-10基因表達(dá)水平

一種B細(xì)胞的亞群分泌IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）等免疫抑制因子，進(jìn)而抑制免疫應(yīng)答;這些細(xì)胞稱為調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（regulatory B cell，Breg），Breg和B10細(xì)胞在各種疾病中發(fā)揮重要作用，參與疾病的發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后，并參與的其他生理過程[15]。Breg除了產(chǎn)生自身的抗體外，還會(huì)分泌CK從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[16]?；A(chǔ)研究目前已確認(rèn)Breg表型有：CD19+CD24+CD38+、CD19+CD5+CD1d+、CD19+CD24+CD27+、CD19+CD38+CD1d+IgM+CD147+、CD25hiCD71-hiCD73lo和CD27intCD38hi，而其中普遍認(rèn)為最常見的表型是CD19+CD24+CD38+表型[17-18]。在MG患者中，總體的B細(xì)胞降低，但CD19+的B細(xì)胞亞群數(shù)量卻是升高的[12]。研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，MG患者CD19+B細(xì)胞上BAFF-R的表達(dá)頻率明顯增加，Xiang Li等[19]認(rèn)為B細(xì)胞成熟活化障礙是MG患者的表現(xiàn)。在本實(shí)驗(yàn)中，胸腺中給藥后模型對照組CD19蛋白和基因的表達(dá)相較于佐劑組顯著上調(diào)，通過治療后，各給藥組基因和蛋白表達(dá)下調(diào)。

IL-10在自身免疫中的生理作用尚不完全清楚，最初被認(rèn)為是一種小鼠的Th2細(xì)胞因子，抑制Th1細(xì)胞合成細(xì)胞因子[15]。后來的研究表明，IL-10在小鼠和人類中介導(dǎo)一系列免疫抑制和免疫刺激作用。同時(shí)IL-10也是B細(xì)胞重要的生長因子，促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化為抗體產(chǎn)生細(xì)胞，誘導(dǎo)B細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[20]。人IL-10的產(chǎn)生并不局限于Th2細(xì)胞，因?yàn)門h0和Th1細(xì)胞，B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也被證明表達(dá)IL-10，且是B10細(xì)胞的特異標(biāo)記。IL-10由B細(xì)胞產(chǎn)生，產(chǎn)生IL-10的B10是Breg細(xì)胞的一個(gè)子集，可以抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞的炎癥免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)B10細(xì)胞的生產(chǎn)伴隨著IL-10的mRNA轉(zhuǎn)錄，且證明了在AChR型MG患者中，CD4 T細(xì)胞增殖的B10細(xì)胞抑制能力與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)，提示B10細(xì)胞抑制T細(xì)胞不需要細(xì)胞間的接觸然而，當(dāng)MG患者按疾病嚴(yán)重程度（眼∕輕度或中度∕重度）進(jìn)行分類時(shí)，與輕度組相比，中度至重度組抑制CD4 T細(xì)胞增殖的能力較弱[21]。通常Breg細(xì)胞的抑制功能也是通過IL-10來測定[22]。B10細(xì)胞與自身免疫性疾病包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、原發(fā)性干燥性syn-drome、自身免疫性大皰性疾病、多發(fā)性硬化癥等相關(guān)，在部分疾病中，病人B10細(xì)胞頻率升高，雖不是在所有病例中都是這樣，但自身免疫性疾病患者的B10細(xì)胞頻率平均值明顯高于年齡匹配的健康對照組[14]。給藥后模型組血清中IL-10的含量顯著低于佐劑組，各中藥組和陽性對照組相較于模型對照組IL-10的含量增加。而胸腺中模型對照組基因的表達(dá)相較于佐劑組上調(diào)，在治理后各中藥組和陽性藥組相較于模型對照組下調(diào)。雖然對于模型對照組來說，血清中IL-10含量下降，胸腺中IL-10的表達(dá)增強(qiáng)，這樣看似矛盾，但這與最近國外在人體身上的研究結(jié)果是相同的[18,23]，研究表明在MG患者，IL-10的分泌下降，但基因表達(dá)上調(diào)。

益氣升提法是治療MG的重要方法，主要思路參考于張錫純的升陷湯和李東垣的補(bǔ)中益氣湯。黃芪，柴胡，升麻為代表的配伍是益氣升提法的主要配伍。黃芪為補(bǔ)氣之要藥。現(xiàn)代研究表明，黃芪有增強(qiáng)免疫力的作用[24]。黃芪多糖可以減少小鼠中CD4+T細(xì)胞，促進(jìn)IL-10的分泌[25]。柴胡為少陽之藥，有升陽舉陷的作用。柴胡多糖對血漿中l(wèi)gA、lgG、lgM的水平會(huì)起到增強(qiáng)作用，可以增強(qiáng)免疫力，治療自身免疫性疾病[26-27]。升麻具有升舉陽氣，清熱解毒的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明升麻具有抗炎，抗血小板凝聚，抑制淋巴細(xì)胞增殖的作用[28-29]。

在本實(shí)驗(yàn)中，各給藥組對MG均有良好的治療效果。其中黃芪中劑量組對血清中IL-10的改善最好，黃芪低劑量對CD19蛋白表達(dá)上調(diào)最佳。其它各組對各指標(biāo)均有顯著改善，其中多組改善情況均強(qiáng)于西藥強(qiáng)的松。證明了益氣升提法通過調(diào)控B10細(xì)胞治療MG，加強(qiáng)自身免疫抑制，減輕其機(jī)體的免疫應(yīng)答，調(diào)控淋巴細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)因子，使機(jī)體恢復(fù)免疫平衡穩(wěn)態(tài)，降低血清中Ach R-Ab水平，減輕NMJ處Ach R損傷，緩解臨床癥狀，從而達(dá)到治療效果。