天麻破壁粉、凍干粉對戊四唑誘導(dǎo)癲癇大鼠海馬組織Bcl-2、Bax、Caspase-3、GAT-1 mRNA及蛋白表達對比研究＊

劉春艷，柴藝匯，田興中，唐靖雯，盧禮平，謝 宇，5，周 雯，牛建均，陳露露，張麗艷＊＊，茅向軍

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 貴陽 550025；2.貴州威門藥業(yè)股份有限公司 貴陽 550018；3.貴州省食品藥品檢驗所 貴陽 550004；4.張家口市第五醫(yī)院 張家口 075000；5.貴州廣濟堂藥業(yè)有限公司貴陽 550014）

癲癇（epilepsy，EP）是指神經(jīng)元放電異常導(dǎo)致短暫性腦神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂的一種疾病[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2]，癲癇持續(xù)性發(fā)作改變了腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)、酶、氨基酸等物質(zhì)的發(fā)生，導(dǎo)致腦細胞損害，甚至神經(jīng)細胞凋亡。癲癇發(fā)作中有很多基因被誘導(dǎo)表達，其中包括抑制基因Bcl-2和促進基因Bax、Caspase3，這些基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物參與凋亡的調(diào)控[3]。癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)類疾病均與腦內(nèi)γ-氨基丁酸（GABA）濃度有關(guān)，關(guān)于GAT-1主要工作是迅速攝取細胞和突觸間隙外液的GABA，結(jié)束了GABA的突觸傳遞過程。所以GAT的降低能減少GABA的清除，從而增強了GABA的抑制作用，減少驚厥發(fā)生的機率[4]。天麻為蘭科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥塊莖，具有平抑肝陽，息風止痙，祛風通絡(luò)等功效[5]。天麻的加工方式主要以傳統(tǒng)炮制為主，存在保存困難，品質(zhì)不均，有效成分利用率低的缺點。為解決這一問題，提出了中藥破壁粉碎和真空冷凍干燥概念和相關(guān)技術(shù)，破壁粉碎技術(shù)提高了中藥的生物利用度，保留傳統(tǒng)中藥飲片的化學(xué)成分、中藥性能及配伍等傳統(tǒng)屬性[6]。冷凍干燥技術(shù)主要解決了天麻新鮮藥材無法長期保鮮的難題，同時保證藥材生物活性完整、藥劑定量準確、脫水徹底、易復(fù)水再生等優(yōu)點[7]。目前天麻破壁粉和凍干粉現(xiàn)有藥效學(xué)研究基礎(chǔ)還較薄弱，本課題初步探討不同加工方式的天麻對神經(jīng)保護作用的差異，旨在為后期天麻破壁粉和凍干粉安全性隱患和有效劑量的探索提供研究依據(jù)，對保障天麻破壁粉和凍干粉的質(zhì)量及藥用資源的節(jié)約具有重要的意義。

1 材料

1.1 動物

健康SD大鼠72只，體重約（200±20）g，雌雄各半，動物許可證號：SCXK（軍）2012-0011，購自于慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司。

1.2 試劑

戊四唑（美國Alfa公司，批號：#L16185）；丙戊酸鈉（賽諾菲（杭州）制藥有限公司，批號：6HG0478）；TRNzol總RNA提取試劑（天根生化科技（北京）有限公司，批號：DP405-02）；Ultrapure RNA Kit（北京康為世紀生物科技有限公司，批號：CW0581M）；HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit（南京諾唯贊生物科技有限公司，批號：Q221-01）；BCA蛋白定量試劑盒（康為世紀生物科技有限公司，批號：CW0014Slot 40326）；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（康為世紀生物科技 有 限 公 司，批 號：CW0591S lot 30330）；Wester blotting ladder pen（康為世紀生物科技有限公司，批號：CW2502）；ECL高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（康為世紀生物科技有限公司，批號：CW0049mLOT 30330）；抗β-Actin鼠單克隆抗體（康為世紀生物科技有限公司，批號：Cw0096m lot 40241）；抗β-Actin兔多克隆抗體（康為世紀生物科技有限公司，批號：CW0097A）；Bcl-2抗體（艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，批號：RLM 3041）；caspase-3抗體（艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，批號：RLT 0656）；Bax抗體（艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，批號：RLT 0456）。

1.3 儀器

熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，型號：ABI7500）；板式酶標儀（北京新風機電公司，型號：ZS-2）；電泳儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，型號：164-5050）；蛋白電泳槽（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，型號：Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System）；蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，型號：Mini Trans-Blot）；凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，型號：Tanon 1600）。

1.4 藥物

本品來源于貴州大方地區(qū)自采，藥材經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)植物栽培教研室魏升華教授鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥塊莖。普通粉：60℃烘干，粉碎過6號篩；破壁粉：60℃烘干，經(jīng)破壁粉碎加工、干壓制粒而成；凍干粉：新鮮天麻切制，滅菌，再用真空干燥機凍干，過藥典小鋼磨粉碎后過6號篩。

2 方法

2.1 動物分組和給藥

72只健康成年SD大鼠，實驗動物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為12組，每組6只，然后標記、稱重。分組，正常組：給予生理鹽水4 mL·kg-1灌胃，模型組：戊四唑（PTZ）腹腔內(nèi)注射0.08 g·kg-1前給予生理鹽水（4 mL·kg-1）灌胃，連續(xù)10 d。陽性對照組：戊四唑（PTZ）腹腔內(nèi)注射0.08 g·kg-1后，給予丙戊酸鈉（VPA）0.12 g·kg-1灌胃，連續(xù)10 d，給藥組：PTZ腹腔內(nèi)注射0.08 g∕kg后，給予天麻（普通粉、破壁粉、凍干粉）低、中、高劑量組（0.5 g·kg-1、1.0 g·kg-1、2.0 g·kg-1），藥物均勻溶解，連續(xù)灌胃10 d。

2.2 動物模型的建立

造模給藥后，判斷癲癇發(fā)作強度，采用7點評分法：0級：沒有行為上的發(fā)作；Ⅰ級：節(jié)律性點頭或頭部顫搐；Ⅱ級：陣攣性咀嚼；Ⅲ級：頭部顫搐加前肢陣攣性抽搐；Ⅳ級：袋鼠姿勢（上身直立）；Ⅴ級：跌倒；Ⅵ級全身強直陣攣性驚厥。記錄發(fā)作潛伏期（從腹腔注射PTZ到出現(xiàn)上述癥狀的時間，以秒為單位）；發(fā)作持續(xù)時間（從上述癥狀開始發(fā)作到終止的時間，以秒為單位）。

2.3 檢測指標

2.3.1 RT-PCR檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3和GAT-1 mRNA表達水平

把海馬組織研磨成粉末狀后，采用TRNzol總RNA提取試劑提取樣本RNA，按產(chǎn)品說明書進行實驗。然后采用分光光度計測定總的RNA濃度，根據(jù)光度計260 nm∕280 nm 1.80-2.10處的比值測定其純度，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA片段完整性。根據(jù)cRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求，取總RNA 10μL進行逆轉(zhuǎn)錄，采用以下條件進行PCR反應(yīng)：95℃，30 s；40個PCR循環(huán)（95℃，5 s；60℃，40 s（收集熒光））。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴增反應(yīng)結(jié)束后，（95℃，10 s；60℃，60s；95℃，15 s）；并從60℃緩慢加熱到99℃。分別用目的基因引物和以GAPDH作為內(nèi)參基因，引物序列為GAPDH上游引物序列5'-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3'，下游引物序列5'-CCACCCTGTTGCTGTAGCCATA-3'，擴增產(chǎn)物長度270 bp；Bax上游引物序列5'-GGTGGTTGCCCTTTTCTACTTTGC-3'，下游引物序列5'-GCTCCCGGAGGAAGTCCAGTG-3'，擴增產(chǎn)物長度113 bp；Bcl-2上游引物序列5'-GGGCTACGAGTGGGATACTGGAG-3'，下游引物序列5'-CGGGCGTTCGGTTGCTCT-3'，擴增產(chǎn)物長度101 bp，Caspase-3上游引物序列5'-ACTGGAAAGCCGAAACTCTTCATCA-3'，下游引物序列5'-GGAAGTCGGCCTCCACTGGTATC-3'，擴增產(chǎn)物長度127 bp，GAT-1上游引物序列5'-TGGAACACTGACCGCTGCTT-3'，下游引物序列5'-GAATCAGACAGCTTTCGGAAGTTGG，擴增產(chǎn)物長度343 bp。所有反應(yīng)均設(shè)立3個復(fù)孔。記錄每個反應(yīng)管中標本的Ct值，據(jù)RT-PCR原始數(shù)據(jù)Ct值，計算相對定量值。

2.3.2 Western blot法檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3和GAT-1蛋白表達水平

稱取海馬組織加入適量RIPA（細胞裂解液）提取液提取蛋白，10 000 rpm離心20 min，收集上清，再按細胞蛋白提取試劑盒說明進行蛋白提取，檢測蛋白濃度。將制備好的蛋白樣品加入12%的凝膠中電泳，轉(zhuǎn)膜，取膜。一步法快速WB試劑盒將其加入封閉液中，保持20 min，用蒸餾水將一步法試劑盒中的10×洗液稀釋為1×洗液；將二抗HRP放入離心管，使一抗與二抗充分混勻，于室溫條件下孵育5 min，再加入一步法抗體稀釋液（一抗Bcl-2濃度（1:500）、二抗Bcl-2濃度（1:200）、一抗Bax濃度（1:1 000）、二抗Bax濃度（1:200）、一抗caspase3濃度（1:500）、二抗caspase3濃度（1:200）、一抗GAT-1濃度（1:1 000）、二抗GAT-1濃度（1:200）、一抗內(nèi)參β-actin濃度（1:5 000）、二抗內(nèi)參βactin濃度（1:200））。漂洗去掉抗體混合液，洗液清洗3次，每次用5 mL洗液漂洗5 min。在反應(yīng)盒內(nèi)加入高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒A液及B液各1 mL，混勻，放入PVDF膜，使膜表面與試劑充分接觸5 min，放于凝膠成像儀中，選擇化學(xué)發(fā)光，開始曝光。照相并保存，用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)軟件進行圖像分析，采用目的蛋白與內(nèi)參的比值來表示蛋白表達水平。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 天麻普通粉，凍干粉，破壁粉癲癇發(fā)生強度和時間比較

模型組癲癇發(fā)作強度為Ⅵ級，陽性藥對照組癲癇發(fā)作強度為Ⅴ級，天麻普通粉、天麻破壁粉各劑量組驚厥發(fā)作強度介于Ⅴ-Ⅵ級，天麻凍干粉各劑量組癲癇發(fā)作強度介于Ⅳ-Ⅵ級。模型組癲癇潛伏時間短、持續(xù)時間長，發(fā)作強度均為Ⅵ級，表明造模成功。與模型組比較，丙戊酸鈉組及天麻普通粉、破壁粉、凍干粉各劑量組癲癇潛伏時間顯著延長（P＜0.05），癲癇持續(xù)時間顯著縮短（P＜0.05）。與丙戊酸鈉組比較，天麻普通粉高劑量組、天麻破壁粉高劑量組癲癇潛伏時間無顯著差異，天麻凍干粉高劑量組癲癇潛伏時間顯著延長（P＜0.05）；天麻凍干粉高劑量組癲癇持續(xù)時間無顯著性差異（P＞0.05）。

3.2 RT-PCR檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3和GAT-1

mRNA表達水平

表1 天麻（普通粉，凍干粉，破壁粉）抗癲癇發(fā)生時間比較（±s,n=6）

表1 天麻（普通粉，凍干粉，破壁粉）抗癲癇發(fā)生時間比較（±s,n=6）

注：與正常組（Control）比較a P＜0.05；與模型組（Model）比較b P＜0.05；與陽性對照組比較c P＜0.05。天麻普通粉低(A1)、中(A2)、高(A3)劑量組；天麻破壁粉低(B1)、中(B2)、高(B3)劑量；天麻凍干粉低(C1)、中(C2)、高(C3)劑量組；陽性組：VPA丙戊酸鈉組。

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與正常組比較，模型組Bax、Caspase3和GAT-1 mRNA相對表達量顯著升高（P＜0.05），Bcl-2 mRNA相對表達量顯著下降（P＜0.05）；與模型組比較，丙戊酸鈉組和天麻各組可顯著降低Bax、Caspase3和GAT-1 mRNA相對表達量（P＜0.05），顯著升高Bcl-2、mRNA相對表達量（P＜0.05），天麻凍干粉高劑量組調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、Caspase-3和GAT-1 mRNA表達量效果最佳，天麻破壁粉高劑量組次之，最后為天麻普通粉高劑量組。均可在不同程度改善Bax、Caspase-3、Bcl-2和GAT-1 mRNA相對表達量，在一定程度上呈量效關(guān)系。

3.2 Western blot法 檢 測Bcl-2、Bax、Caspase-3和GAT-1蛋白表達水平

與正常組比較，模型組Bax、Caspase3和GAT-1蛋白相對表達量顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白相對表達量顯著下降（P＜0.05）；與模型組比較，丙戊酸鈉組可顯著降低Bax、Caspase3和GAT-1蛋白相對表達量（P＜0.05），顯著升高Bcl-2蛋白相對表達量（P＜0.05）。天麻普通粉、破壁粉及凍干粉各劑量組均可顯著降低Bax、Caspase3和GAT-1蛋白相對表達量（P＜0.05），顯著升高Bcl-2蛋白相對表達量（P＜0.05），且藥效與劑量在一定程度上呈正相關(guān)，其中，凍干粉高劑量組Bax、Caspase3和GAT-1蛋白相對表達量與丙戊酸鈉組無顯著差異（P＞0.05），凍干粉中劑量組Bcl-2蛋白相對表達量與丙戊酸鈉組無顯著差異（P＞0.05），凍干粉高劑量組Bcl-2蛋白相對表達量顯著高于陽性對照組（P＜0.05）。

4 討論

《本草綱目》云：“天麻，為治風之神藥，乃肝經(jīng)氣分之藥[8]。臨床可以用于肢體麻木、頭痛、破傷風、驚厥、癲癇等。研究表明，癲癇的發(fā)作與神經(jīng)細胞的發(fā)生有密切的關(guān)系，導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷主要源于細胞的凋亡和壞死[9]。Bcl-2是最主要的抑制細胞凋亡基因，癲癇可導(dǎo)致Bcl-2家族的表達變化；當細胞增殖活性受到損傷或凋亡時，Bax蛋白表達增加，Bcl-2蛋白表達減少，心肌細胞線粒體膜通透性升高，活化細胞凋亡分子Caspase-3，導(dǎo)致細胞凋亡[10]。研究表明，天麻素能增加大鼠癲癇發(fā)作時大腦皮質(zhì)神經(jīng)元抗凋亡蛋白Bcl-2和降低促凋亡蛋白Caspase-3的表達，抑制癲癇凋亡的發(fā)生，從而發(fā)揮保護神經(jīng)細胞作用[11]。中藥治療癲癇的機制主要是對神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)作用，GAT是一種主要位于神經(jīng)元及膠質(zhì)膜上的糖蛋白，屬于Na+∕Cl-轉(zhuǎn)運蛋白家族，其亞型有GAT-1、GAT-2、GAT-3、GAT-4∕BGT1和TAUT，GAT-1是腦組織內(nèi)最重要GATs，在GABA遞質(zhì)的轉(zhuǎn)運過程中起關(guān)鍵作用[12]。GAT-1表達的異常會導(dǎo)致GABA能神經(jīng)信號傳遞的變化，GAT-1通過影響GABA神經(jīng)元，在神經(jīng)遞質(zhì)的平衡中起重要作用進而導(dǎo)致多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。毛小元[13]等檢測癲癇大鼠海馬GAT-1和GAT-3 mRNA和蛋白的表達，結(jié)果顯示，癲癇大鼠海馬GAT-1和GAT-3 mRNA和蛋白的表達均高于正常組，癲癇大鼠海馬內(nèi)GAT-1和GAT-3表達上調(diào)可能促進了癲癇的發(fā)生。

表2 不同天麻組對戊四唑誘導(dǎo)癲癇海馬組織Bcl-2、Bax、Caspase3和GAT-1 mRNA表達的影響（±s,n=6）

表2 不同天麻組對戊四唑誘導(dǎo)癲癇海馬組織Bcl-2、Bax、Caspase3和GAT-1 mRNA表達的影響（±s,n=6）

注：與正常組（Control）比較a P＜0.05；與模型組（Model）比較b P＜0.05；與陽性對照組比較c P＜0.05

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圖1 不同天麻組對戊四唑誘導(dǎo)癲癇海馬組織Bax蛋白相對表達量

圖2 不同天麻組對戊四唑誘導(dǎo)癲癇海馬組織Bax蛋白相關(guān)表達蛋白水平影響條帶圖

圖3 不同天麻組對戊四唑誘導(dǎo)癲癇海馬組織Bcl-2蛋白相對表達量

圖4 不同天麻組對戊四唑誘導(dǎo)癲癇海馬組織Bcl-2蛋白相關(guān)表達蛋白水平影響條帶圖

中藥產(chǎn)生的藥效不只由藥物特有的化學(xué)成分所決定，還可能與藥物的物理化學(xué)狀態(tài)等因素密切相關(guān)。因此，改變藥物物理狀態(tài)是提高藥物藥效及研發(fā)新型藥物的一種值得探討的方法，中藥破壁粉是運用超微粉碎技術(shù)將傳統(tǒng)飲片進行細胞級微粉碎并制粒成D90＜45μm的粉體的第4代新型中藥飲片[14]。黃藝蓉等[15]以三七破壁飲片及其普通飲片作為研究對象，比較兩者對家兔凝血作用的影響，結(jié)果顯示三七破壁飲片的作用強于普通飲片。冷凍干燥是在低溫下對藥物進行冷凍，在高真空下將藥物水分直接升華而除去的干燥方法[16]。在國內(nèi)中藥的冷凍干燥工藝研究沒有廣泛開展起來，鮮天麻凍干粉的研究報道較少。研究表明[17-18]，采用真空冷凍干燥法加工的天麻中天麻素的含量高于傳統(tǒng)方法的水煮、烘干法。

圖5 不同天麻組對戊四唑誘導(dǎo)癲癇海馬組織Caspase3蛋白相對表達量

圖6 不同天麻組對戊四唑誘導(dǎo)癲癇海馬組織Caspase3蛋白相關(guān)表達蛋白水平影響條帶圖

圖7 不同天麻組對戊四唑誘導(dǎo)癲癇海馬組織GAT-1蛋白相對表達量

圖8 不同天麻組對戊四唑誘導(dǎo)癲癇海馬組織GAT-1蛋白相關(guān)表達蛋白水平影響條帶圖

本課題組前期實驗研究證明，三者的化學(xué)成分有明顯差異，可見天麻不同的干燥方式和不同的粉碎方式對其化學(xué)成分具有一定的影響，但天麻有效成分含量是否有差異，待進一步的研究。因此本實驗從藥理實驗顯示，與正常組比較，模型組Bax、Caspase3和GAT-1 mRNA相對表達量顯著升高（P＜0.05），Bcl-2 mRNA及蛋白相對表達量顯著下降P＜0.05），癲癇發(fā)作后bcl-2基因的表達減少，Bax、Caspase3基因表達增加，可能使鈣超載、神經(jīng)纖維生長因子和氧自由基增加導(dǎo)致了神經(jīng)細胞凋亡。癲癇發(fā)作后GAT-1上調(diào)可攝取胞漿內(nèi)的GABA，起到下調(diào)GABA的作用。本研究表明，天麻各組均可在不同程度改善Bax、Caspase-3、Bcl-2和GAT-1 mRNA及蛋白相對表達量，在一定程度上呈量效關(guān)系，天麻破壁粉和凍干粉都能抗細胞凋亡，下調(diào)GAT-1表達，其中凍干粉高劑量組效果最佳，且作用效果都明顯優(yōu)于普通粉。其藥效的提高可能與不同的干燥方式和不同的粉碎方式造成有效物質(zhì)的溶出率不同有關(guān)，其研究結(jié)果為天麻的破壁粉和凍干粉的臨床應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。綜上所述，本研究表明其作用機制可能是天麻能夠上調(diào)神經(jīng)元Bcl-2表達、下調(diào)Bax、Caspase3和GAT-1 mRNA及蛋白表達水平有關(guān)，但天麻凍干粉和破壁粉如何調(diào)控凋亡因子及其信號通路機制尚未清楚，且癲癇發(fā)病機制復(fù)雜，其他神經(jīng)遞質(zhì)及因素可能也會對其產(chǎn)生影響有待進一步深入研究。