烏索酸體外通過激活Nrf2信號通路抑制人肝星狀細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)＊

白慶云

（宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 宜春 336000）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是各種慢性肝病遷延不愈的結(jié)果。肝纖維化的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)非常復(fù)雜的病理生理過程，涉及炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激，免疫反應(yīng)等[1]，在此過程中，肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）起著關(guān)鍵作用[2-3]。在致病因子的作用下肝臟產(chǎn)生并釋放多種細(xì)胞因子，如脂質(zhì)過氧化物、蛋白酶、生長因子和炎性因子等，這些細(xì)胞因子作用于HSC，使之激活轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞[4]，同時(shí)合成大量膠原等細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM），不斷對損傷進(jìn)行修復(fù)，如此反復(fù)，終致肝纖維化的形成[5-6]。越來越多的研究表明，肝纖維化的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激有關(guān)，氧化應(yīng)激以細(xì)胞內(nèi)過量活性氧（reactive oxygen species，ROS）積累為特征。研究表明ROS參與了肝纖維化的發(fā)展，誘導(dǎo)了HSC的活化是致肝纖維化的潛在因素[7-9]。Nrf2是調(diào)節(jié)機(jī)體氧化還原反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)節(jié)多種抗氧化基因的表達(dá)，如血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）、醌氧化還原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1，NQO1]、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基（glutamate cysteine ligase catalytic，GCLC）、谷氨酸半胱氨酸連接酶（glutamate cysteine ligase modifier subunit，GCLM）等[10]。Nrf2信號通路通過調(diào)控肝臟的氧化損傷在肝纖維化的防治中發(fā)揮重要作用。

肝纖維化屬中醫(yī)“脅痛”、“黃疸”、“積聚”等范疇，主要病機(jī)為血瘀阻絡(luò)、正氣虛損和濕熱內(nèi)蘊(yùn)，治療上常以活血化瘀為其基本治法[11]。烏索酸（UA），又名熊果酸，烏蘇酸，是忍冬科植物蒴藿陸英的主要活性成分。陸英又名接骨草、走馬風(fēng)、七葉麻、蒴藋，為的全草。性溫，味苦。具有活血散瘀，祛風(fēng)活絡(luò)，發(fā)汗利尿之功，用于跌打損傷、風(fēng)濕痛、脫臼、腎炎水腫、腳氣水腫等[12]。研究表明UA具有抗肝纖維化的作用，如Saraswat[13]等報(bào)道UA能治療乙醇所致的慢性肝損傷，減輕肝纖維化程度也明顯強(qiáng)于水飛薊素；Yoshimura[14]和Murakam[15]等發(fā)現(xiàn)UA可以抑制TGF-β1的促細(xì)胞增殖效應(yīng)，減少成纖維細(xì)胞膠原的分泌，但UA抗肝纖維化的機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)UA能夠抑制TGF-β1-Smads、PDGF-ERK信號通路而抑制HSC-LX2的增殖，誘導(dǎo)其凋亡[16-17]。本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察UA對氧化應(yīng)激下LX2的活化和ECM代謝的影響，并探討Nrf2信號通路在其中的作用，為全面闡釋UA的抗肝纖維化和機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株、藥物和試劑

人肝星狀細(xì)胞HSC-LX2細(xì)胞系購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，人肝細(xì)胞L02細(xì)胞系購自上海信裕生物科技有限公司，烏索酸由江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，純度＞95%；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清（FBS）、青鏈霉素均購自美國Gibco公司；抗體α-SMA、Nrf2、HO-1和內(nèi)參β-actin，Lamin B均購自美國Cell Signaling Technology公司；NE-PER?蛋白胞漿胞核提取試劑購自Thermo-Fisher Scientific；BCA（bicinchonininc acid）蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；羊抗兔二抗購自美國Abbkine公司；Trizol RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；PrimeScript Master Mix和SYBR Premix Ex Taq購自日本Takara公司；MDA、GSH試劑盒購自南京建成生物工程研究所；MTT試劑盒購自阿拉丁試劑公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

蛋白垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad）；GBOXCHEMI-XX8凝膠成像系統(tǒng)（美國SYNGENE）；CFX384?熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad）；CO2培養(yǎng)箱（新加坡Esco Micro Pte Ltd）；生物安全柜（美國Thermo）；低溫離心機(jī)8106（美國Thermo）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀ELX808（美國Bio-Tek）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活FBS、10萬U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的培養(yǎng)液中（LX2用DMEM培液，L02用1640培液），細(xì)胞在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 噻唑藍(lán)（MTT）檢測

分別取對數(shù)生長的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞以一定的濃度（LX2為5×104個(gè)∕mL，L02為1×105個(gè)∕mL）接種于96孔板內(nèi)（每孔200μl細(xì)胞懸液，含10%FBS），細(xì)胞貼壁后，將培液換成低血清（0.5%，v∕v）的培液培養(yǎng)24 h，設(shè)溶劑對照孔、H2O2孔（L02不設(shè)）和UA孔。H2O2孔和UA孔加入H2O2和∕或UA，溶劑對照孔加入等體積的含二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）的PBS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入MTT，再培養(yǎng)4 h，加入200μl DMSO，待甲瓚完全溶解后，用酶標(biāo)儀在570 nm和630 nm波長處測定OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。存活率%=給藥孔∕對照孔×100%。

2.3 MDA檢測

取對數(shù)生長的LX2細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞以5×104個(gè)∕mL接種于培養(yǎng)皿內(nèi)（2 mL細(xì)胞懸液，含10%胎牛血清，fetal bovine serum，F(xiàn)BS），設(shè)溶劑對照孔、H2O2孔和UA孔。H2O2孔和UA孔加入H2O2和∕或UA，溶劑對照孔加入等體積的含DMSO的PBS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后吸棄細(xì)胞培液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered salin，PBS）潤洗2次，用細(xì)胞刮將細(xì)胞從培養(yǎng)皿上刮下來，用移液槍將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中。按試劑盒步驟依次加入反應(yīng)液，渦旋混勻，95胞水浴40 min，冷卻后，4000 r·min-1離心10 min，吸取各管上清250μl加入96孔板，用酶標(biāo)儀在530 nm處測OD值，按公式計(jì)算MDA含量。

圖1 UA對LX2和L02細(xì)胞增殖的影響

2.4 GSH檢測

LX2細(xì)胞分組及前期處理同2.3項(xiàng)下，培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞于離心管中，加PBS1 mL，超聲勻漿，取0.1 mL勻漿液加0.1 mL試劑一混勻，3500 r·min-1離心10 min，取100μl上清液按試劑盒步驟加入各反應(yīng)液，混勻，靜置5 min，于405 nm處測OD值，按公式計(jì)算GSH含量。

2.5 總RNA提取

LX2細(xì)胞分組及前期處理同2.3項(xiàng)下，培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞于離心管中，加入1 mL Trizol后超聲勻漿，再加入0.5 mL氯仿萃取，4℃，12000 r·min-1離心15 min，轉(zhuǎn)上清液到新的EP管，加入1 mL異丙醇沉淀RNA，離心，沉淀用75%乙醇洗滌，離心后得到的沉淀用DEPC水溶解既得總RNA。

2.6 QT-PCR

將得到的總RNA用PrimerScript Master Mix試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。然后將cDNA用SYBRgreen premix試劑進(jìn)行混合后，再進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后，根據(jù)溶解曲線來判斷擴(kuò)增反應(yīng)的準(zhǔn)確性。最后目標(biāo)基因的相對表達(dá)量用相應(yīng)內(nèi)參來標(biāo)準(zhǔn)化，采用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。本研究使用的引物序列（人源，由上海捷瑞生物工程有限公司合成）如下：α-SMA，(forward primer)5’GGCAACGCCTTAGCACTGTG3’，(reverse primer)5’CGAATTCATAGACTCG TAA3’；COL1A1，(forward primer)5’GCTAATGAAGCTCGCGCATA，(reverse primer)GCATGGATCCCTCATCGTG A；COL3A1，(forward primer)5’ATGCCG TGTGTTAAGTGCT，(reverse primer)GGGCACCATTTTCTCCCTTA；TIMP1，(forward primer)TTCTGGTCTTGGTC GGATTG，(reverse primer)GGTCTGATT CGGTTGTCTTCC；MMP2，(forward primer)GGAACTTTACTCCGCGACTTG， (reverse primer)GCCGCAATAGAAGTTGGTCAG。

2.7 蛋白濃度測定

采用BCA法，按試劑盒說明操作。

2.8 細(xì)胞總蛋白提取

LX2細(xì)胞分組及前期處理同2.3項(xiàng)下，培養(yǎng)結(jié)束后吸棄細(xì)胞培液，用PBS潤洗細(xì)胞2次，吸棄PBS，加一定量的加樣緩沖液，用刮子將細(xì)胞刮凈，收集到離心管內(nèi)，100℃煮樣5 min，冷卻，置于-20冰箱備用。

2.9 Western blot檢測

將制得的蛋白樣本進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，上樣量為50μg，濕法轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉，加入相應(yīng)一抗，4℃孵育過夜，再加入二抗室溫孵育1 h，加入ECL發(fā)光液，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像、灰度掃描和分析。

2.10 統(tǒng)計(jì)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 UA抑制LX2的增殖

為了觀察H2O2促進(jìn)HSC增殖的作用，建立了體外氧化應(yīng)激誘導(dǎo)HSC活化的體外模型[18]。MTT結(jié)果顯示H2O2可顯著促進(jìn)LX2細(xì)胞增殖，而UA（40μM和60μM）可顯著抑制LX2的增殖（圖1A）。另外，本研究觀察了相同濃度的UA對L02細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)UA對L02細(xì)胞無明顯作用（圖1B）。

圖2 UA減少LX2α-SMA mRNA和蛋白的表達(dá)

圖3 UA減少細(xì)胞外基質(zhì)的基因表達(dá)

3.2 UA減少α-SMA的基因和蛋白表達(dá)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證UA對LX2細(xì)胞的活化作用，本實(shí)驗(yàn)檢測了α-SMA mRNA和蛋白的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，H2O2可使α-SMA mRNA的表達(dá)顯著增加（圖2A）。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測了α-SMA蛋白的表達(dá)，Western blot檢測結(jié)果顯示H2O2也使α-SMA的蛋白表達(dá)增加（圖2B，圖2C）。UA 40μM和60μM兩個(gè)劑量均可以降低H2O2引起的α-SMA mRNA（圖2A）和蛋白表達(dá)的增加（圖2B，圖2C），其中60μM劑量組更為明顯。這說明UA能抑制H2O2誘導(dǎo)的LX2的活化。

3.3 UA減少細(xì)胞外基質(zhì)的基因表達(dá)

HSC被激活后活化為成纖維細(xì)胞，同時(shí)分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)。為了探究UA對LX2細(xì)胞外基質(zhì)的影響，本實(shí)驗(yàn)檢測了Ⅰ型膠原蛋白（Collagen I）、Ⅲ型膠原蛋白（CollagenⅢ）和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）及基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMP）的基因表達(dá)。結(jié)果如圖3所示，LX2經(jīng)H2O2誘導(dǎo)后COL1A1（圖3A）、COL3A1（圖3B）、MMP2（圖3C）和TIMP1（圖3D）mRNA表達(dá)均顯著增加，而UA可顯著降低這些細(xì)胞外基質(zhì)的基因表達(dá)，其中60μM劑量組更為明顯。

圖4 UA減輕H 2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激

圖5 UA增加Nrf2的轉(zhuǎn)核和HO1的蛋白表達(dá)

3.4 UA抵御H2O2引起的氧化應(yīng)激

為了闡明UA抑制LX2活化與抗氧化之間的關(guān)系，我們接下來檢測了脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）和具有抗氧化作用的還原型谷胱甘肽（GSH）的含量。結(jié)果如圖4所示，H2O2可使MDA含量升高，同時(shí)使GSH含量降低，而UA兩個(gè)劑量均可降低H2O2誘導(dǎo)的MDA含量的升高（圖4A），同時(shí)升高GSH（圖4B）。

3.5 UA激活Nrf2信號通路

Nrf2是重要的抗氧化應(yīng)激的核轉(zhuǎn)錄因子，為了驗(yàn)證UA抗氧化作用與Nrf2信號通路之間的關(guān)系，本研究檢測了Nrf2和HO1的蛋白表達(dá)。結(jié)果如圖5所示，H2O2可使核內(nèi)Nrf2蛋白顯著減少，而胞漿內(nèi)的Nrf2蛋白表達(dá)無明顯變化（圖5A，圖5B）；同樣，H2O2可使Nrf2下游的靶基因HO1的蛋白表達(dá)顯著減少（圖5C，圖5D）。而UA兩個(gè)劑量組的Nrf2的轉(zhuǎn)核增加，HO1的蛋白表達(dá)也增加。說明UA可逆轉(zhuǎn)H2O2引起的Nrf2的核內(nèi)蛋白的減少，同時(shí)可增加其下游HO1的蛋白表達(dá)。

4 討論

近年來大量研究表明氧化應(yīng)激與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[19]。肝臟在氧化應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的大量活性氧族（reactive oxygen species，ROS）可直接刺激HSC的激活和增殖[20]并獲得遷移、侵襲的能力，同時(shí)分泌Ⅰ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致肝纖維化的進(jìn)一步發(fā)展[21]，而肝星狀細(xì)胞的活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，活化的星狀細(xì)胞表達(dá)大量的α-SMA。本研究結(jié)果顯示UV可以降低H2O2引起的α-SMA基因和蛋白的表達(dá)增加，并減少細(xì)胞外基質(zhì)的mRNA表達(dá)。說明UA可抑制HSC的活化和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。

MDA和GSH是氧化應(yīng)激的重要監(jiān)測指標(biāo)。MDA是不飽和脂肪酸被氧自由基攻擊后，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物，因此當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激損傷時(shí)MDA含量往往升高[22-23]。GSH是一種重要的自由基清除劑，在氧化應(yīng)激過程中會(huì)被大量消耗[24]。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步結(jié)果顯示UA可降低H2O2引起MDA升高，并逆轉(zhuǎn)降低的GSH，這說明UA可以拮抗H2O2引起氧化應(yīng)激。這與文獻(xiàn)報(bào)道的UA具有抗氧化作用的結(jié)果一致[25-26]。

Nrf2信號通路在機(jī)體抗氧化過程中具有重要作用并與肝纖維化密切相關(guān)[27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明UA可以增加Nrf2的轉(zhuǎn)核，并使其下游靶蛋白HO1表達(dá)增加，說明UA能激活Nrf2信號通路，從而發(fā)揮抗氧化的作用。

綜上所述，UA通過激活Nrf2信號通路抵御H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生和HSC的活化，減少細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗纖維化的作用。本研究結(jié)果將為中藥陸英及其主要活性成分UA抗肝纖維化機(jī)制的闡明提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為中藥防治肝纖維化提供理論基礎(chǔ)。