銀環(huán)蛇蛇毒中具有鎮(zhèn)痛活性的多肽成分的生化分離和活性鑒定＊

劉金滿，盧悟廣，陳永根，王明遠，王 奇＊＊，曹 鵬

（1.廣州中醫(yī)藥大學臨床藥理研究所 廣州 510080；2.南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 南京 210028）

全世界的蛇類共有3000多種，據(jù)相關(guān)統(tǒng)計毒蛇就占其中600多種。而我國大部分地處亞熱帶氣候區(qū)，因此蛇類資源也是相當豐富，約有200多各種蛇類，毒蛇種類約占其中的四分之一，而其中劇毒的蛇約有l(wèi)0多種[1]。蛇毒是從毒蛇的腺體中分泌出來的，屬于一種生物毒素液體，毒蛇在其捕獲獵物或攻擊咬傷我們?nèi)祟悤r，毒腺中的毒液經(jīng)腺體的導管分泌到牙鞘內(nèi)，再經(jīng)牙槽擠壓到人或其他動物體內(nèi)，隨血液或者淋巴組織擴散而引起獵物出現(xiàn)中毒癥狀如：凝血功能障礙、部分組織壞死、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等[1-2]。蛇毒的成分非常復(fù)雜，主要包含了一些蛋白質(zhì)、活性酶類及多肽，這些成分約占毒液干重的90%-95%[3]。同時蛇毒中含有一些碳水化合物、脂肪、核苷、胺類以及游離氨基酸等，其中發(fā)揮毒性及藥理作用的主要活性物質(zhì)是蛋白及多肽組分[3]。根據(jù)其產(chǎn)生毒性機制不同，蛇毒可分為血液毒性、細胞毒性和神經(jīng)毒性毒液，其中神經(jīng)毒素主要是針對外周血神經(jīng)系統(tǒng)作用并可導致神經(jīng)肌肉無力和麻痹[4]。

蛇毒蛋白多肽組分也是藥物研究和發(fā)現(xiàn)的重要資源，具有抗炎，抗腫瘤，抗血栓形成，鎮(zhèn)痛等藥理活性[4-8]。許多源自蛇毒的藥物臨床療效顯著，如來自馬來西亞紅口蝮蛇（Calloselasma rhodostoma）的Ancrod[9]，來自矛頭蝮（Bothrops atrox）的巴曲酶（Batroxobin）[10]以及來自尖吻蝮（Deinagkistrodon acutus）的去纖維化蛋白酶[11]，它們都具有顯著的抗血栓形成作用，廣泛用于治療腦梗塞，心肌梗塞，缺血性中風和心絞痛。而蛇毒中膜毒素、去整和素、出血毒素、血管凋亡誘導蛋白、氨基酸氧化酶等成分具有治療癌癥作用。從眼鏡蛇毒（Naja naja atra）中分離的Cardiotoxin-3毒素、南美響尾蛇恐怖亞種(Crotalus durissus terrifucus)分離的磷脂酶A2 crotoxin毒素以及我們課題組前期從銀環(huán)蛇毒中分離的L-氨基酸氧化酶BM-Apotxin都具有顯著的抗腫瘤活性。來自于太攀蛇（Oxyuranus Scutellatus）的Taipoxin則具有促進創(chuàng)傷修復(fù)的療效。來自南美銅頭 蝮 蛇（Agkistrodon contortrix contortrix）的 解 離 素contortrostatin有顯著的抗血小板凝聚的功效。

在20世紀早期，人們就開始運用蛇毒來緩解神經(jīng)痛、惡性腫瘤疼痛和關(guān)節(jié)痛等。我國自1950年左右就開展了蛇毒的鎮(zhèn)痛作用研究，并研制出蛇毒神經(jīng)毒素制劑和粗毒制劑，用于疼痛的治療。蛇毒的鎮(zhèn)痛作用具有起效慢、持續(xù)時間長、效果好、無耐受性和成癮性等特點[12]。中科院昆明動物研究所于1976年研制的眼鏡蛇毒神經(jīng)毒索制劑——克痛靈，主要治療神經(jīng)血管性頭痛、坐骨神經(jīng)痛、三叉神經(jīng)痛以及風濕痛等頑固性疼痛，臨床療效顯著[13]。但迄今為止其鎮(zhèn)痛機理仍不明確。1995年，P.Gopalakrishnakone等人從眼鏡王蛇（king cobra,Ophiophagushannah）毒中發(fā)現(xiàn)了一種鎮(zhèn)痛多肽hannalgesin有顯著的鎮(zhèn)熱痛活性[14]。hannalgesin是一種神經(jīng)毒素肽，其鎮(zhèn)痛活性可被納洛酮所阻斷，提示其可能作用于阿片受體[14]。2009年，Liu等人發(fā)現(xiàn)眼鏡蛇毒素cobratoxin（CTX）能夠顯著抑制福爾馬林誘導的炎性痛以及弗氏佐劑誘導的慢性炎性痛[15]。CTX是一種三指肽，可作用于乙酰膽堿受體特別是與疼痛密切相關(guān)的α7受體。但是CTX的鎮(zhèn)痛效果可被被阿托品拮抗，而不是不是納洛酮。這表明CTX產(chǎn)生獨立于阿片受體系統(tǒng)之外的鎮(zhèn)痛效果。上述結(jié)果表明，眼鏡蛇毒中的神經(jīng)毒素可能是其產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果的主要藥效成分。

銀環(huán)蛇（Bungarus multicinctus）俗稱金錢白花蛇，為眼鏡蛇科劇毒蛇，廣泛分布于中國南部地區(qū)，如江西，福建，臺灣等地。銀環(huán)蛇中醫(yī)入藥有祛風通絡(luò)、定驚止痙之功效，主風濕痹痛[16-17]。銀環(huán)蛇毒素的主要成分為蛋白質(zhì)和多肽，主要包括三指毒素（3-FTx），磷脂酶A2（PLA2s），凝集素，金屬蛋白酶，絲氨酸蛋白酶和蛋白酶抑制劑[18]。其中神經(jīng)毒素是銀環(huán)蛇毒液中含量最豐富的成分，占毒素總蛋白的近50%，比眼鏡蛇毒中神經(jīng)毒素含量更高[19-20]。銀環(huán)蛇神經(jīng)毒素包括α-銀環(huán)蛇毒素（α-BGT）、β-銀環(huán)蛇毒素（β-BGT）、κ-銀環(huán)蛇毒素（κ-BGT）等[18]。α-BGT屬于突觸后神經(jīng)毒素，它們可以競爭性的與處在神經(jīng)肌肉接頭處的乙酰膽堿受體相結(jié)合，從而神經(jīng)遞質(zhì)的傳導被阻斷[21]。α-BGT由74個氨基酸組成含有10個半胱氨酸形成5對二硫鍵，其相對分子質(zhì)量為8 KD左右[21]。α-BGT結(jié)構(gòu)形如三指，致密的內(nèi)核由4個二硫鍵聚集在一起形成，3個肽鏈環(huán)由此內(nèi)核伸展而出仿佛3個手指的形狀，所以又稱之為三指肽[21]。三指型毒素折疊的可塑性已經(jīng)歷了最佳的進化，短鏈與長鏈的蛇毒突觸后神經(jīng)毒素均屬于這類結(jié)構(gòu)，nAChR亞型間的細微差別可利用功能基團的不同組合特異性識別出來[22]。β-BGT為突觸前神經(jīng)毒素，其表現(xiàn)出Ca2+的依賴性磷脂酶A2（Phospholipase A2，PLA2）活性，其直接作用于運動神經(jīng)的突觸前膜部位，可以阻斷乙酰膽堿的釋放，從而導致骨骼肌喪失收縮功能而處于麻痹狀態(tài)。β-BGT同樣屬于高堿性多肽，分子量為20-22 KD，等電點為8.8-9.7。β-BGT由中間以一對二硫鍵相連的A、B兩條鏈構(gòu)成，A鏈包含有120個氨基酸殘基，分子量為13500 D，具備磷脂酶A2的活性，與哺乳動物胰腺分泌的磷脂酶A2及其它蛇毒中的磷脂酶A2在結(jié)構(gòu)上有同源性[23]。B鏈含有60個氨基酸，分子量為7 KD左右，與蝸牛毒液及蛇毒中的kunitz型蛋白酶抑制劑、樹眼蛇毒素及毒素Ⅰ具有序列同源性[24]。

當前已經(jīng)從銀環(huán)蛇毒中分離鑒定了多種神經(jīng)毒素多肽并解析了序列結(jié)構(gòu)，如BM10-1，BM10-2[25]，P15[26]，Gamma-bungarotoxin[27]，α-bungarotoxin[28]等。但是這些毒素的藥效作用及其藥理機制尚不明確。本課題組前期工作發(fā)現(xiàn)銀環(huán)蛇蛇毒具有顯著的抗腫瘤作用，并且分離鑒定出其中最關(guān)鍵的抗腫瘤活性成分BM-Apotxin[29]。

本研究在前期工作基礎(chǔ)上進一步深入挖掘，首次發(fā)現(xiàn)銀環(huán)蛇毒對小鼠熱痛、醋酸炎性痛具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，并且與嗎啡相比，其鎮(zhèn)痛作用更持久。進一步通過分子篩、離子交換、HPLC從銀環(huán)蛇毒中分離出活性較強的多肽分子，通過肽譜鑒定，氨基酸測序及序列比對我們發(fā)現(xiàn)，該鎮(zhèn)痛單體為一種含有74個氨基酸、5對二硫鍵的多肽α-bungarotoxin。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

健康清潔級雌性C57BL∕6小鼠320只，購買自北京維通利華實驗動物技術(shù)公司，合格證號SYXK（蘇）2016-0018。于12小時光∕暗循環(huán)無病原體的環(huán)境中喂養(yǎng)。根據(jù)中華人民共和國評估與認證實驗動物護理國際協(xié)會指南，所有體內(nèi)研究都是在經(jīng)過批準的機構(gòu)實驗動物護理和協(xié)議下進行的。

1.1.2 實驗材料及試劑

銀環(huán)蛇粗毒凍干粉（購自江西省景德鎮(zhèn)野生特種動物科技開發(fā)有限公司，于-20℃保存）、鹽酸嗎啡注射液、冰醋酸等常規(guī)生化試劑均購自國藥集團。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.3 儀器設(shè)備

AKTA Purifier、Sephadex G-50葡 聚 糖 填 料、XK26-1000層析柱購自于美國GE Healthcare Life Sciences公司；臺式冷凍離心機（5417R）購自于德國Eppendorf公司；蛋白電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc XR購自于BIO-RAD公司；高效液相色譜儀（2695）、HPLCC18反相高效液相色譜柱規(guī)格為SinoChrom5μm均購自于美國Waters公司；熱板儀（IITCLife Science,Woodland Hills,CA,USA）

1.2 實驗方法

1.2.1 銀環(huán)蛇毒的G50分子篩分離與收集

取1 g凍干的銀環(huán)蛇粗毒凍干粉溶于5 mL PBS pH7.4中，4℃，12000 rpm離心30 min除去不溶物質(zhì)。然后將上清液用AKTA（GE Healthcare，Sweden）控制上樣到用相同的緩沖液預(yù)平衡好的Sephadex G-50凝膠過濾柱上（26 mm×1000 mm），流速為1 mL·min-1。上樣后使用相同的磷酸鹽緩沖液以1 mL·min-1的流速進行洗脫，在215 nm和280 nm波長下監(jiān)測洗脫液的出峰。所有的餾分通過AKTA自動收集器收集，每管收集3 mL。將收集的組分取樣溶解在5×SDS-PAGE Loading buffer中，15%SDS-PAGE分析蛋白分子量分布。根據(jù)215 nm和280 nm吸收峰及電泳結(jié)果分別合并各組分樣品并編號。

1.2.2 銀環(huán)蛇鎮(zhèn)痛活性組分的HPLC分離與序列鑒定

將銀環(huán)蛇G50分子篩各組分加入凍干保護劑凍干保存于-80℃。根據(jù)各組分的熱板鎮(zhèn)痛活性，取活性最強的P4組分采用HPLC進一步分離純化。凍干粉加入去離子水重新溶解至終濃度為5 mg·mL-1。使用Waters E2695 HPLC系統(tǒng)（Waters，USA）將銀環(huán)蛇G50組分上樣到C18反相HPLC柱（SunFireTMC18，5μm，4.6×250 mm，Waters，USA）上。在215 nm波長處監(jiān)測吸光度。用0.1%TFA水溶液（溶液A）和0.1%TFA的乙腈（溶液B）的流動相分離小肽，流速設(shè)定為1.0 mL·min-1，洗脫流程為：0-10 min，95%的A等梯度洗脫；5-60 min，線性梯度洗脫，梯度如下：5-15%B 10 min,15%-40%B 50 min，40%-60%B 60 min。HPLC樣品直接凍干后用于后續(xù)的活性檢測、質(zhì)譜分析和N末端測序。

1.2.3 銀環(huán)蛇毒熱板鎮(zhèn)痛實驗

全雌C57BL∕6小鼠20 g±2 g（雄性睪丸接觸熱板會影響觀察結(jié)果）3個批次合計220只；所有藥物分組均為每組10只。銀環(huán)蛇粗毒、G50分子篩各組分及G50-P4的HPLC各組分凍干粉用200μl生理鹽水溶解后BCA定量，并用生理鹽水稀釋到所需濃度；采用腹腔注射，注射體積為200μl∕只。采用步階升溫法（37℃-52℃）△T=5℃，即熱板到達起點溫度后將小鼠放入熱板儀靜置5 min待小鼠平靜，啟動升溫程序，觀察小鼠行為，以小鼠第1次舔后足的溫度作為小鼠熱痛閾值。給藥前1 d進行入排測試，取熱痛閾值45℃-50℃之間的小鼠進行正式實驗。小鼠經(jīng)腹腔注射給藥后1 h、3 h、5 h、7 h，分別測試各給藥組的熱痛閾值，以生理鹽水作為陰性對照，以嗎啡（5 mg·kg-1）作為陽性對照。

1.2.4 銀環(huán)蛇毒醋酸扭體鎮(zhèn)痛實驗

實驗材料：C57BL∕6小鼠90只（體重20 g±2 g）隨機分為30只∕組，共3組（生理鹽水、10 mg·mL-1嗎啡、YHS-G50-P4-HPLC-P6）。實驗開始前小鼠禁食12-16 h（自由進水），90只小鼠全部腹腔注射給藥（100μl∕10 g），給藥后第1 h、4 h、7 h 3個時間點每個時間點每組各取10只用1%醋酸腹腔注射（100μl∕只），然后記錄20 min內(nèi)總扭體次數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀環(huán)蛇粗毒具有顯著的鎮(zhèn)熱痛效應(yīng)

如圖1所示，小鼠經(jīng)腹腔注射給藥后1 h、4 h、7 h，分別測試各給藥組的熱痛閾值，以生理鹽水作為陰性對照，以嗎啡（5 mg·kg-1）作為陽性對照，銀環(huán)蛇粗毒具有十分顯著的鎮(zhèn)熱痛效應(yīng)，與生理鹽水組相比，銀環(huán)蛇粗毒在10μg·kg-1作用濃度下提高熱痛閾近2℃，作用濃度與嗎啡（5 mg·kg-1）相比僅需嗎啡的1∕500。此外，嗎啡在腹腔注射后半小時起效，大約4 h后已經(jīng)逐漸失效，而銀環(huán)蛇毒鎮(zhèn)痛效果在我們監(jiān)測的幾個時間點內(nèi)呈逐漸上升的趨勢，且持續(xù)時間比嗎啡更長，給藥7 h后仍然具有顯著鎮(zhèn)痛效果。

采用ITC-P134熱板儀，設(shè)置條件為37℃-52℃，上升步階溫度為5℃·min-1，以小鼠第1次舔后足（hinddraw lick）時的溫度作為該小鼠痛閾。圖中每組10只小鼠，入組標準為熱痛閾值在45-47℃之間。統(tǒng)計為其他各組分別與生理鹽水組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2 銀環(huán)蛇粗毒G50分子篩各組分鎮(zhèn)痛效應(yīng)

如圖2所示，1 g銀環(huán)蛇粗毒經(jīng)Sephadex G-50凝膠過濾分離為4個主要的大峰P1-P4（圖2A）。SDSPAGE結(jié)果提示，銀環(huán)蛇粗毒主要由分子量小于25 KD的小蛋白組成，其中P4主要含分子量小于15 KD的多肽（圖2B）。進一步對4個峰的熱板鎮(zhèn)痛活性進行分析，以生理鹽水作為陰性對照，以嗎啡（5 mg·kg-1）作為陽性對照，嗎啡組（5 mg·kg-1）在給藥后1 h左右鎮(zhèn)痛活性達到峰值，提高了小鼠近2℃的熱痛閾值，此后便緩慢降低，給藥4 h后，熱鎮(zhèn)痛活性幾乎喪失（圖2C）。而銀環(huán)蛇毒G50分子篩分成的4個組分（10μg·kg-1），在我們給藥后監(jiān)測的1 h、4 h、7 h 3個時間點內(nèi)，只有P4有顯著的鎮(zhèn)痛活性且能夠?qū)⑿∈蟮臒嵬撮撝堤岣?-2℃，且P4的熱鎮(zhèn)痛活性隨著給藥時間的延長逐漸增強，在給藥7 h后仍然有顯著的鎮(zhèn)痛活性（圖2C）。

圖1 銀環(huán)蛇蛇毒熱板鎮(zhèn)痛活性分析

2.3 銀環(huán)蛇毒鎮(zhèn)痛多肽的分離純化與活性檢測

通過對G50分子篩各組分進行熱板鎮(zhèn)痛活性分析發(fā)現(xiàn)，銀環(huán)蛇毒的鎮(zhèn)痛活性組分主要是小分子多肽，因此我們將鎮(zhèn)痛活性最高的G50-P4組分進行了HPLC分離。HPLC分離結(jié)果提示，G50-P4組分共分成了7個辨識度較高的215∕280 nm吸收峰。其中P1，P2，P3，P6（BGT-6），P7可能為單體（圖3A）。而P2，P4，P5較寬可能為混合物（圖3A）。進一步對7個峰的熱板鎮(zhèn)痛活性分析比較發(fā)現(xiàn)，P3和P6均表現(xiàn)出一定的鎮(zhèn)痛活性，其中P6（BGT-6）具有顯著鎮(zhèn)痛活性，提高了小鼠近2℃的熱痛閾值且鎮(zhèn)痛效果持續(xù)時間最長，在給藥后7 h內(nèi)我們監(jiān)測了第1 h、3 h、5 h、7 h各組的鎮(zhèn)熱痛作用，P6呈現(xiàn)出逐漸遞增的鎮(zhèn)痛作用（圖3B，圖3C）。我們進一步檢測了P6組分對醋酸扭體小鼠模型的鎮(zhèn)痛活性，以生理鹽水作為陰性對照，以嗎啡（5 mg·kg-1）作為陽性對照，嗎啡組（5 mg·kg-1）在給藥后1 h左右對醋酸致內(nèi)臟痛的抑制率達到了100%，并隨著時間的延長遞減，到給藥后7 h，抑制率降到了76.1%。我們發(fā)現(xiàn)P6同樣具有顯著的鎮(zhèn)痛活性，而且P6對醋酸致內(nèi)臟痛的鎮(zhèn)痛活性特征與鎮(zhèn)熱痛特征有顯著不同，P6在給藥后1 h很大程度上抑制了醋酸導致的小鼠扭體反應(yīng)，抑制率達到了90.8%，同樣隨給藥時間的延長，其鎮(zhèn)痛活性逐漸下降，到給藥后7 h，抑制率降到了35.8%（圖4），這與其鎮(zhèn)熱痛的時間依賴性相反。這有可能是這兩種疼痛模型的致痛機制差異導致。

圖2 銀環(huán)蛇毒G50分子篩組分熱板鎮(zhèn)痛活性分析

圖3 銀環(huán)蛇鎮(zhèn)痛活性多肽的HPLC純化及各組分熱鎮(zhèn)痛活性分析

圖4 銀環(huán)蛇鎮(zhèn)痛活性多肽對小鼠醋酸扭體疼痛模型的鎮(zhèn)痛活性分析

2.4 銀環(huán)蛇毒鎮(zhèn)痛活性多肽的序列鑒定與結(jié)構(gòu)分析

通過多肽指紋圖譜和N端氨基酸測序分析發(fā)現(xiàn)，銀環(huán)蛇鎮(zhèn)痛活性多肽G50-P4-HPLC-P6的氨基酸序列與α-bungarotoxin（UniProtKB-P60616）相匹配（圖6A，圖6B），α-bungarotoxin成熟肽由74個氨基酸組成，含有5對二硫鍵（圖6C），PDB構(gòu)象提示，αbungarotoxin是一種典型的蛇毒三指肽（圖5D），αbungarotoxin的分子表面負電荷（藍色）主要分布于手指構(gòu)象區(qū)域（圖5E）。

3 討論

圖5 銀環(huán)蛇鎮(zhèn)痛活性多肽的序列及結(jié)構(gòu)分析

銀環(huán)蛇用于傳統(tǒng)中醫(yī)藥已經(jīng)有幾千年的歷史。然而當前圍繞銀環(huán)蛇開展的研究主要集中在毒腺的組學分析和新毒素的發(fā)現(xiàn)與鑒定，其傳統(tǒng)藥用功效的物質(zhì)基礎(chǔ)研究則十分有限。盡管我們的前期研究表明銀環(huán)蛇毒有顯著的廣譜抗腫瘤活性，但是其體內(nèi)抗腫瘤活性仍有待進一步研究。在本研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)銀環(huán)蛇毒具有顯著的熱鎮(zhèn)痛活性，并且其鎮(zhèn)痛活性與嗎啡相比持續(xù)時間更長，這與已報道的眼鏡蛇科另一種毒蛇眼鏡蛇毒鎮(zhèn)痛活性特征十分相似。通過比較銀環(huán)蛇毒G75分子篩和G50分子篩結(jié)果發(fā)現(xiàn)，銀環(huán)蛇毒中的蛋白組分主要分布于兩個范圍：大于35 KD的大分子蛋白如Bm-Apotxin和小于25 KD的小分子多肽，如PLA2級神經(jīng)毒素。而鎮(zhèn)痛活性主要來自于小分子多肽，這與眼鏡蛇毒的鎮(zhèn)痛活性組分類似[15,30]。通過進一步的HPLC分離及多肽鑒定我們發(fā)現(xiàn)，銀環(huán)蛇鎮(zhèn)痛活性最強的組分是一種已發(fā)現(xiàn)的毒素α-bungarotoxin。α-bungarotoxin是一種乙酰膽堿受體拮抗劑，能夠以相對不可逆的方式與神經(jīng)肌肉接頭處發(fā)現(xiàn)的煙堿乙酰膽堿受體結(jié)合，導致受害者癱瘓，呼吸衰竭和死亡。它還被證明在腦中拮抗α7煙堿乙酰膽堿受體[31]。其構(gòu)象是典型的三指肽結(jié)構(gòu)[28]，而乙酰膽堿受體拮抗劑通常可作為解痙藥用于痙攣和多種疼痛的治療[32-33]。令人遺憾的是當前圍繞α-bungarotoxin的研究主要是其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系且年代久遠，其鎮(zhèn)痛分子機制及其鎮(zhèn)痛作用靶點尚不明確。

本研究首次證實了銀環(huán)蛇具有顯著的鎮(zhèn)痛活性，并且分離鑒定了其關(guān)鍵活性組分為一種乙酰膽堿拮抗劑α-bungarotoxin，闡明了銀環(huán)蛇鎮(zhèn)痛的物質(zhì)基礎(chǔ)。在接下來的工作中，我們將建立不同的疼痛模型深入研究α-bungarotoxin的鎮(zhèn)痛活性，并進一步通過電生理、計算機模擬等技術(shù)深入研究其與靶點的相互作用，從而闡明銀環(huán)蛇毒的鎮(zhèn)痛分子機制。