益胃飲中藥血清藥物化學(xué)研究＊

董 宇，趙麗沙，吳人照，陳 偉，柴可群＊＊

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053；2.浙江省中醫(yī)藥研究院 杭州 310007）

中藥血清藥物化學(xué)是采用藥物化學(xué)的研究手段和方法，利用現(xiàn)代分析技術(shù)鑒定口服中藥及中藥復(fù)方后血清中的移行成分，研究其藥效相關(guān)性，確定中藥體內(nèi)直接作用物質(zhì)，為中藥及中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供科學(xué)依據(jù)[1-3]。臨床驗(yàn)方益胃飲是浙江省名中醫(yī)柴可群主任醫(yī)師長(zhǎng)期防治胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的經(jīng)驗(yàn)方[4]。方取健脾益氣、袪瘀化痰、清熱解毒三法，以黃芪、太子參、清半夏、鬼球、藤梨根等藥組成，扶助正氣，調(diào)和胃氣，清毒抗邪，臨床應(yīng)用多年，效果良好，可延長(zhǎng)胃癌患者生存期，提高患者生活質(zhì)量。前期藥理學(xué)研究表明益胃飲含藥血清可抑制人胃癌細(xì)胞MFC增殖、遷移和侵襲能力[5]，誘導(dǎo)MFC細(xì)胞凋亡[6]；同時(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示益胃飲可抑制小鼠移植性前胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移能力[7]，初步對(duì)其藥效作用機(jī)制進(jìn)行了探討。為深入研究益胃飲防治胃癌前病變及胃癌的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究采用中藥血清藥物化學(xué)的方法，通過(guò)超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UHPLCQ∕TOF-MS），將益胃飲水提物、益胃飲水提物灌胃給藥大鼠后的含藥血清以及空白大鼠血清進(jìn)行分析比較，對(duì)益胃飲水提物及其主要入血成分進(jìn)行分析，旨在揭示益胃飲體內(nèi)作用物質(zhì)基礎(chǔ)，為益胃飲的藥物開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備與材料

SCIEX X-500R四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司），TurboIonSpray離子源（美國(guó)AB SCIEX公司）；ExionLCAD高效液相色譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司）；Beckman 20R低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；IKA微型渦旋混合儀（德國(guó)艾卡公司）；AUW220D電子天平（日本島津公司）。

圖1 益胃飲水提物UHPLC-Q/TOF-MS總離子流圖（A：正離子模式；B：負(fù)離子模式）

黃芪、浙麥冬、三葉青、姜半夏、蒲公英、麩白芍、藤梨根、薏苡仁和香茶菜購(gòu)自杭州華東中藥飲片有限公司，批號(hào)分別為170824、170818、170830、170804、170901、170715、170819、170723和170823。對(duì)照品精氨酸140624-201506、原兒茶酸110809-201205、原兒茶醛110810-201608、咖啡酸110885-200102、芍藥苷110885-200102、毛蕊異黃酮苷111920-201606、甘草苷110610-200604、黃芪甲苷110781-201616和甘草酸15080510購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈與甲酸（德國(guó)Merck公司）、Milli-Q超純水（美國(guó)Millipore公司），其余試劑均為分析純。

健康SPF級(jí)雄性Wistar大鼠12只，10-12周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（浙）2018-0001，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，每天自由進(jìn)食飲水。

1.2 方法

1.2.1 益胃飲水提物制備

取各藥材適量，按比例配置，加入10倍量純水浸泡30 min，加熱回流提取3次，每次提取2 h，合并濾液濃縮，制得1.09 g·mL-1的益胃飲提取液。

1.2.2 益胃飲提取物供試品溶液和對(duì)照品溶液配制

取1.0 mL益胃飲提取液，置100 mL容量瓶中，加去離子水超聲30 min，至濃縮液完全溶解，加去離子水補(bǔ)足，以13 000 rpm離心15 min，取上清液即為益胃飲供試品溶液；分別精密稱取各對(duì)照品，用甲醇稀釋近似1.0 mg·mL-1的對(duì)照品母液，分別取適量對(duì)照品母液，制備得混合對(duì)照品溶液，供UHPLC-Q-TOF-MS定性比較。

1.2.3 空白血清及含藥血清樣品的制備

圖2 TCM MS/MSLibrary中藥二級(jí)譜庫(kù)比對(duì)示意圖（A：咖啡酸；B：芍藥苷；C：黃芪甲苷；D：甘草酸）

雄性SPF級(jí)Wistar大鼠12只，隨機(jī)分成2組，一組按3.6 g·kg-1劑量灌胃益胃飲提取液，另一組空白組灌胃等體積的生理鹽水。連續(xù)給藥3 d，每天1次，分別于第3 d末次給藥后1 h取樣。戊巴比妥鈉麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，離心分離制得益胃飲含藥及空白血清，-80℃存放備用。

1.2.4 血清樣品處理

血清置于室溫下融化，取1.0 mL至離心管中，精密加入20μL磷酸，超聲處理1 min，渦旋混勻30 s后上樣到預(yù)先用3 mL甲醇和3 mL水活化平衡好的SPE柱上，以3 mL水淋洗，棄去，再以3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，室溫下氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00μL甲醇復(fù)溶，4℃13 000 rpm離心15 min，取上清液即為血清供試品溶液。

1.2.5 色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：ACQUITY UPLCHSST3（100×2.1 mm，1.8μm）色譜柱，流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫程序：0-2 min 1%A；2-5 min，1%-20%A；5-13 min，20%-45%A；13-17 min，45%-100%A；17-20 min，100%A，體積流量0.3 mL·min-1。

質(zhì)譜條件：飛行時(shí)間質(zhì)譜采用TurboIonSpray離子源，ESI正負(fù)離子掃描模式。具體條件為：Ion Source Gas1（Gas1）：55，Ion Source Gas2（Gas2）：55，Curtain gas（CUR）：35，source temperature：600℃，IonSapary Voltage Floating（ISVF）：5 500 V∕-4 500 V（正負(fù)離子兩種 模 式）；TOF MS scan m∕z range：50-1 500 Da，production scan m∕z range：25-1 000 Da，TOF MSscan accumulation time 0.15 s∕spectra，product ion scan accumulation time 0.05 s∕spectra；二 級(jí) 質(zhì) 譜 采 用information dependent acquisition（IDA）獲得，并且采用high sensitivity模式，Declustering potential（DP）：±60 V（正負(fù)離子兩種模式），Collision Energy：35±15 eV，IDA設(shè)置如下Exclude isotopes within 4 Da，Candidate ions to monitor per cycle：10。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SCIEX OS軟件采集和處理數(shù)據(jù)。SCIEX OS軟件包含多重置信標(biāo)準(zhǔn)，包括質(zhì)量準(zhǔn)確度，保留時(shí)間，同位素，以及化合物庫(kù)的匹配使用。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)化合物的一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)、同位素分布比和MS∕MS搜索SCIEX OS配置的中藥二級(jí)數(shù)據(jù)庫(kù)TCM MS∕MSLibrary（包含1 000多種中藥化合物二級(jí)數(shù)據(jù)），即可在在無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品的情況下完成對(duì)目標(biāo)物的篩查。

2 結(jié)果與分析

表1 正離子模式下益胃飲水提物歸屬的化學(xué)成分

表2 負(fù)離子模式下益胃飲水提物歸屬的化學(xué)成分

圖3 負(fù)離子模式下益胃飲水提物總離子流圖（A）和混合對(duì)照品溶液總離子流圖（B）

2.1 益胃飲水提物化學(xué)成分歸屬及其質(zhì)譜裂解分析

按“1.2.2”項(xiàng)方法取益胃飲提取液供試品溶液進(jìn)UHPLC-Q∕TOF-MS系統(tǒng)分析，得到益胃飲提取液總離子流圖（圖1）。

通過(guò)與SCIEX OS軟件自帶的中藥二級(jí)數(shù)據(jù)庫(kù)中化合物TCM MS∕MSLibrary的一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)、同位素分布比和MS∕MS比較與篩選（圖2），在正離子模式下歸屬色譜峰53個(gè)（表1），在負(fù)離子模式下歸屬色譜峰55個(gè)（表2），去除重復(fù)的20個(gè)化合物后共歸屬色譜峰88個(gè)。通過(guò)購(gòu)買對(duì)照品，對(duì)益胃飲水提物供試品溶液中的精氨酸、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、芍藥苷、毛蕊異黃酮苷、甘草苷、黃芪甲苷和甘草酸進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間（tR）及二級(jí)碎片離子信息比對(duì)（圖3），結(jié)果表明通過(guò)搜庫(kù)鑒定化合物的結(jié)果穩(wěn)定可靠，可用于中藥中復(fù)雜化學(xué)成分的分析鑒定。

2.2 益胃飲血中移行成分分析

在益胃飲水提物化學(xué)成分分析的基礎(chǔ)上，在SCIEX OS軟件中輸入上述分析鑒定的88個(gè)化合物的分子式和保留時(shí)間，根據(jù)目標(biāo)化合物的一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)、同位素分布比和MS∕MS進(jìn)行匹配，篩選在空白血清中未檢出，而在含藥血清中檢測(cè)的化合物（見(jiàn)圖4）。

經(jīng)篩選鑒定，益胃飲含藥血清正離子模式下共檢出血中移行成分15個(gè)（表3），負(fù)離子模式下共檢出血中移行成分20個(gè)（表4），去除8個(gè)重復(fù)化合物后共檢出益胃飲血中移行成分27個(gè)。

3 討論

益胃飲是分析歷代醫(yī)家對(duì)胃癌的認(rèn)識(shí)及用藥基礎(chǔ)上，總結(jié)多年大量臨床經(jīng)驗(yàn)而得的經(jīng)驗(yàn)方，具有健脾益氣、袪瘀化痰、清熱解毒之功效。在長(zhǎng)期臨床工作中，益胃飲治療了大量胃癌患者，可減少胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，明顯提高患者生活質(zhì)量，使不少胃癌進(jìn)展期患者得以長(zhǎng)期帶瘤生存。雖然益胃飲臨床使用卓有成效，但益胃飲的藥物開(kāi)發(fā)尚屬于初步階段，益胃飲的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)承待闡明。

圖4 SCIEX OS軟件篩選益胃飲水提物血中移行成分示意圖（A：芍藥苷；B：芒柄花素；C：甘草酸）

表3 正離子模式下益胃飲水提物血中移行成分

表4 負(fù)離子模式下益胃飲水提物血中移行成分

中藥血清藥物化學(xué)是闡明中藥及中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的有力手段，其中超高效液相色譜四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UHPLC-Q∕TOF-MS）具有強(qiáng)大的色譜分離能力和精準(zhǔn)的質(zhì)譜高分辨定性能力，已成為中藥血清藥物化學(xué)研究的首選方法[8-9]。本實(shí)驗(yàn)建立的UHPLC-Q∕TOF-MS益胃飲中藥血清藥物化學(xué)分析方法是可靠的定性分析方法，能夠較全面地反映益胃飲水提物口服后吸收入血的藥物成分，為快速確定益胃飲藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及代謝研究奠定基礎(chǔ)。

為了獲得分離度好、靈敏性高且信息量豐富的色譜圖，本實(shí)驗(yàn)對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)比較不同廠 家 色 譜 柱（Waters BEH C18、Waters HSS T3和Shimadzu Inetsil SPC18）對(duì)益胃飲水提物及血清樣品的分離效果，最終選擇Waters HSST3色譜柱；通過(guò)比較流動(dòng)相系統(tǒng)，比包括4種流動(dòng)相體系：乙腈-水、甲醇-水、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水、0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水，結(jié)果表明，使用乙腈體系流動(dòng)相優(yōu)于甲醇體系，并且添加0.1%甲酸有利于峰形的改善及質(zhì)譜響應(yīng)，最終選擇0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水流動(dòng)相體系；通過(guò)比較血清樣品前處理方法，包括有機(jī)溶劑沉淀蛋白法、乙酸乙酯萃取法、熱水浴法和SPE小柱萃取法，最終選擇出峰較多，基質(zhì)干擾較少的SPE小柱萃取法進(jìn)行血清樣品前處理。

本實(shí)驗(yàn)在建立UHPLC-Q∕TOF-MS方法的基礎(chǔ)上，采用SCIEX OS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和化合物譜庫(kù)比較鑒定，可對(duì)中藥復(fù)雜化學(xué)體系進(jìn)行高通量和快速的鑒定，具有準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)單的操作特點(diǎn)[10]。通過(guò)SCIEX OS數(shù)據(jù)處理與鑒定，共歸屬益胃飲水提物中88個(gè)化合物，胃飲血中移行成分27個(gè)，主要包括氨基酸類，有機(jī)酸類，黃酮類，苷類和萜類化合物。研究結(jié)果為揭示益胃飲防治胃癌前病變及胃癌的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為益胃飲的藥物開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。