利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除轉(zhuǎn)基因水稻中的潮霉素標(biāo)記基因

彭梅芳，甘 鳳，潘春梅，宋健蘭，范曉麗，陳克貴

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所，四川 成都 610061)

【研究意義】在植物基因工程中，通常將目標(biāo)基因(Gene of Interest, GOI)表達(dá)元件與適宜的選擇標(biāo)記基因(Selectable Marker Gene, SMG)構(gòu)建到同一載體上，一起轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，然后借助SMG篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，進(jìn)一步培育轉(zhuǎn)基因植株[1]。通過這種方法得到的轉(zhuǎn)基因植株中SMG會(huì)隨著GOI一起整合到宿主植物基因組中，而常用的SMG編碼的蛋白通常是抗生素或除草劑類，SMG殘留可能對(duì)人畜等食物鏈下游生物產(chǎn)生不良影響，特別是對(duì)人體健康存在潛在危害，這也是轉(zhuǎn)基因生物安全性一直備受爭(zhēng)議的主要原因[2]；此外，目前可利用的SMG數(shù)量有限，利用相同的SMG，對(duì)植物多次導(dǎo)入GOI存在一定困難，阻礙了多次轉(zhuǎn)化達(dá)到基因聚合的目的[3]。并且我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物安全管理也要求無標(biāo)記基因的存在。因此，無論從轉(zhuǎn)基因生物安全性考慮，還是從基因工程技術(shù)的更廣泛應(yīng)用考慮，去除轉(zhuǎn)基因作物中的SMG都十分必要。 【前人研究進(jìn)展】基因組編輯是指利用人工序列特異核酸酶(Sequence-specific nucleases, SSNs)在基因組特定位點(diǎn)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(Double-strand breaks, DSBs)，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因靶位點(diǎn)的敲除、染色體的重組以及基因的定點(diǎn)插入或替換等，是對(duì)基因組進(jìn)行定向修飾的一種技術(shù)。根據(jù)所采用的人工核酸內(nèi)切酶不同，基因組編輯技術(shù)主要經(jīng)歷了三代發(fā)展：即鋅指核酸酶(Zinc finger nucleases, ZFNs)[4]技術(shù)、類轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALENs)[5]技術(shù)、成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)及其相關(guān)核酸酶9系統(tǒng)(CRISPR-associated 9, Cas9)[6]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)自2013年初建立以來[7-8]，因其具有操作簡(jiǎn)單、作用高效、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，迅速成為基因組改造與修飾的重要工具。目前已成功應(yīng)用于各種細(xì)菌、動(dòng)物及植物的基因組精確修飾中，被認(rèn)為是最具有廣闊應(yīng)用前景的一種基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，針對(duì)水稻轉(zhuǎn)基因中常用的SMG潮霉素抗性基因(hygromycinphosphotransferaseII,hptII)進(jìn)行基因編輯?！緮M解決的關(guān)鍵問題】期望獲得刪除hptII基因的轉(zhuǎn)基因水稻，獲得marker-free的轉(zhuǎn)基因水稻。

1 材料與方法

1.1 植物材料

受體材料為野生型水稻(OryzasativaL.)品種日本晴(Nipponbare)，由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所基因與基因技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。含hptII基因的轉(zhuǎn)基因水稻品種日本晴由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所基因與基因技術(shù)實(shí)驗(yàn)室獲得(轉(zhuǎn)化質(zhì)粒為pCXUN)。

1.2 菌株與質(zhì)粒

農(nóng)桿菌LBA4404由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所基因與基因技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pYLsgRNA-OsU6a(GenBank登錄號(hào)：KR029105)、pYLsgRNA-OsU3(GenBank登錄號(hào)：KR029103)和質(zhì)粒pYLCRISPR/Cas9Pubi-B由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光教授惠贈(zèng)。質(zhì)粒pCXUN(GenBank登錄號(hào)：FJ905215)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所王國(guó)梁研究員惠贈(zèng)。

1.3 主要酶及試劑

質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和RNA提取試劑盒均購(gòu)自于天根生化科技有限公司；PrimeSTAR max DNA Polymerase、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD19-T載體購(gòu)自TakaRa公司；普通PCRmix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；BsaI內(nèi)切酶購(gòu)自于New England Biolabs(NEB)公司；T4DNA 連接酶購(gòu)自MBI Fermentas公司；CTAB、氯仿、異戊醇、異丙醇等常規(guī)化學(xué)試劑購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；PCR產(chǎn)物測(cè)序和引物合成由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成。

1.4 CRISPR/Cas9編輯載體構(gòu)建

根據(jù)sgRNA的設(shè)計(jì)原理，以pCXUN載體中的hptII基因序列為目標(biāo)序列，通過在線網(wǎng)站CRISPR RGEN Tools(http://www.rgenome.net/cas-designer/)設(shè)計(jì)hptII基因的sgRNA，選擇2個(gè)sgRNA作為基因編輯位點(diǎn)，具體sgRNA設(shè)計(jì)和載體構(gòu)建主要參照華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光教授的方法[9]。

1.4.1 OsU6a+sgRNA-1表達(dá)盒的克隆 sgRNA-1目標(biāo)序列為CTCCGACCTGATGCAGCTCTCGG。第一輪PCR擴(kuò)增：以U-F+OsU6aHy-1，gRHy-1+gR-R分別各為一對(duì)引物(表1)，以pYLgRNA-OsU6a質(zhì)粒為模板，用高保真酶PrimeSTAR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得片段1和2。第二輪PCR擴(kuò)增：以第一輪擴(kuò)增回收的1和2產(chǎn)物混合作為模板，以Pps-GGL和Pps-GG2-1為引物(表1)，PCR獲得帶BsaI酶切位點(diǎn)的DNA片段，該片段經(jīng)BsaI酶切后得第一個(gè)表達(dá)盒OsU6a+sgRNA-1。

1.4.2 OsU3+sgRNA-2表達(dá)盒的克隆 sgRNA-2目標(biāo)序列為ACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGG。第一輪PCR擴(kuò)增：以U-F+OsU3Hy-2，gRHy-2+gR-R分別各為一對(duì)引物(表1)，以pYLgRNA-OsU3質(zhì)粒為模板，用高保真酶PrimeSTAR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得片段3和4。第二輪PCR擴(kuò)增：以第一輪擴(kuò)增回收的3和4產(chǎn)物混合作為模板，以Pps-GG2-2和Pgs-GGR為引物(表1)，擴(kuò)增獲得帶BsaI酶切位點(diǎn)的DNA片段。該片段經(jīng)BsaI酶切后得到第二個(gè)表達(dá)盒OsU3+sgRNA-2。

1.4.3 sgRNA表達(dá)盒連入編輯載體 質(zhì)粒pYLCRISPR/Cas9Pubi-B經(jīng)BsaI酶切回收載體大片段，與經(jīng)BsaI酶切后的2個(gè)表達(dá)盒OsU6a+gRNA-1、OsU3+gRNA-2進(jìn)行連接，最終獲得編輯hptII基因的載體質(zhì)粒，命名為PMF117。將PMF117轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化。

表1 本研究所用引物

注：ggtctc為BsaI識(shí)別位點(diǎn)；ACTAGT為SpeI酶切位點(diǎn)；ACGCGT為MluI酶切位點(diǎn)。

Notes: ggtctc is theBsaI digestion recognition site; ACTAGT is theSpeI digestion recognition site; ACGCGT is theMluI digestion recognition site.

1.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化

日本晴遺傳轉(zhuǎn)化步驟參照Nishimura等[10]的方法，具體地將野生型水稻日本晴種子經(jīng)75 %無水乙醇、0.1 %升汞消毒處理后誘導(dǎo)成愈傷組織，然后用農(nóng)桿菌去侵染愈傷組織，經(jīng)篩選、分化等步驟得到再生植株。

1.6 T0代轉(zhuǎn)基因陽性苗鑒定及cas9表達(dá)分析

經(jīng)雙丙胺膦篩選得到的抗性植株，即為T0代轉(zhuǎn)化植株。通過CTAB法提取T0代植株基因組DNA，分別用引物F-Barr+R-Barr和SP-L1+SP-R(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2對(duì)引物均檢測(cè)為陽性的植株，即為所需要的轉(zhuǎn)基因陽性植株。進(jìn)一步對(duì)陽性植株提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用引物F-Lcas9-RT+R-Lcas9-RT(表1)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)Cas9基因表達(dá)情況。Cas9基因表達(dá)陽性的植株經(jīng)兩代篩選獲得可用于編輯hptII基因的純合株系。

1.7 敲除轉(zhuǎn)基因水稻中的hptII基因

將獲得的編輯hptII基因的水稻與含有hptII基因的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行雜交，雜交F1代種子萌發(fā)，分單株提取幼葉基因組DNA，用潮霉素抗性基因特異引物F-HPTII-542和啟動(dòng)子引物R-35S-P(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送測(cè)序，測(cè)序?yàn)殡p峰的即是hptII基因有被編輯的植株。進(jìn)一步將測(cè)序?yàn)殡p峰的PCR產(chǎn)物與T載體pMD19-T連接，進(jìn)行亞克隆，挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序分析hptII基因ORF區(qū)序列情況，確定hptII基因是否被敲除。

2 結(jié)果與分析

2.1 sgRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和表達(dá)盒擴(kuò)增

以pCXUN載體(GenBank登錄號(hào)：FJ905215)中的hptII基因序列設(shè)計(jì)了2個(gè)sgRNA的靶位點(diǎn)。sgRNA-1：5’-CTCCGACCTGATGCAGCTCTCGG-3’(正向)；sgRNA-2：5’-ACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGG-3’(反向)。其中sgRNA-1用OsU6a作為啟動(dòng)子，經(jīng)重疊PCR擴(kuò)增得到OsU6a+sgRNA-1表達(dá)盒的片段長(zhǎng)度為629 bp；sgRNA-2用OsU3作為啟動(dòng)子，PCR擴(kuò)增得到OsU3+sgRNA-2表達(dá)盒的片段長(zhǎng)度為603 bp(圖1)。

2.2 CRISPR/Cas9基因編輯工程菌的獲得

將OsU6a+sgRNA-1和OsU3+sgRNA-2表達(dá)盒片段回收后，與質(zhì)粒pYLCRISPR/Cas9Pubi-B(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光教授惠贈(zèng)，GenBank登錄號(hào)：KR029110)一起用BsaI 和T4DNA 連接酶進(jìn)行酶切連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5а，經(jīng)PCR鑒定陽性克隆送測(cè)序，結(jié)果表明OsU6a+sgRNA-1和OsU3+sgRNA-2表達(dá)盒均準(zhǔn)確連入載體pYLCRISPR/Cas9Pubi-B中，命名為PMF117(圖2)。將PMF117轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404即獲得編輯hptII基因的工程菌。

M：DNA marker (DL2000)； 1：OsU6a+sgRNA-1表達(dá)盒；2：OsU3+sgRNA-2表達(dá)盒M: DNA marker (DL2000); 1: OsU6a+sgRNA-1 expression box; 2: OsU3+sgRNA-2 expression box圖1 sgRNA 表達(dá)盒PCR擴(kuò)增圖Fig.1 PCR amplification of sgRNA expression box

2.3 水稻T0代轉(zhuǎn)基因植株的獲得及鑒定

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將PMF117轉(zhuǎn)化到水稻品種日本晴中，得到25株T0代轉(zhuǎn)化植株，分別提取基因組DNA，進(jìn)行PCR鑒定，其中23株Bar基因和sgRNA表達(dá)盒均檢測(cè)為陽性(圖3)，陽性率達(dá)92 %。進(jìn)一步對(duì)23株陽性植株提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，檢測(cè)Cas9基因表達(dá)情況，結(jié)果表明有18株轉(zhuǎn)基因植株中Cas9基因表達(dá)為陽性(圖4)，證明PMF117成功轉(zhuǎn)入水稻植株中，并且Cas9基因得到了表達(dá)。

1～6：不同的T0代轉(zhuǎn)基因株系；N：野生型日本晴1-6: Transgenic T0 plantlets; N: Wild type Nipponbare圖4 不同轉(zhuǎn)基因植株的Cas9基因轉(zhuǎn)錄水平的RT-PCR分析Fig.4 RT-PCR analysis of Cas9 gene transcript in the transgenic plantlets

2.4 hptII基因編輯材料的獲得及鑒定

T0代轉(zhuǎn)基因陽性植株再經(jīng)兩代篩選獲得純合的、穩(wěn)定表達(dá)Cas9基因和sgRNA的轉(zhuǎn)基因植株，即獲得可以編輯hptII基因的轉(zhuǎn)基因純合植株。將得到的編輯hptII基因的水稻植株與含有hptII基因的水稻植株進(jìn)行雜交，CRISPR/Cas9系統(tǒng)即可在雜交F1代植株中對(duì)hptII基因的DNA進(jìn)行編輯剪切。用引物F-HPTII-542和R-35S-P對(duì)F1代植株DNA進(jìn)行hptII基因擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物直接測(cè)序分析。結(jié)果表明，9株F1代植株中有6株的PCR產(chǎn)物測(cè)序在設(shè)計(jì)的sgRNA位點(diǎn)附近出現(xiàn)明顯雙峰(圖5)，初步確認(rèn)這6株F1代植株的hptII基因有被編輯，編輯率為66.67 %。進(jìn)一步，將測(cè)序?yàn)殡p峰的PCR產(chǎn)物與T載體連接，進(jìn)行亞克隆，挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明在F1代植株中hptII基因的ORF區(qū)有堿基缺失(1～43 bp)、替換以及單堿基插入(圖6)，使得hptII基因不能成功翻譯。這些編輯的F1代植株通過自交得到F2代，在F2代中篩選可得到hptII基因DNA缺失、不能翻譯出HPTII抗性蛋白，并且不含編輯載體等外源片段的植株，即得到成功敲除轉(zhuǎn)基因水稻中的潮霉素標(biāo)記基因的植株。

圖2 PMF117質(zhì)粒Fig.2 PMF117 vector

A：轉(zhuǎn)基因植株的Bar基因PCR檢測(cè)；B：轉(zhuǎn)基因植株的sgRNA表達(dá)盒PCR檢測(cè)；M：DNA marker (DL2000)；P：PMF117質(zhì)粒；N：野生型日本晴DNA；1～6：不同的T0代轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ): PCR detection of Bar gene; B: PCR detection of sgRNA expression box; M: DNA marker (DL2000); P: PMF117 plasmid; N: Wild type Nipponbare DNA; 1-6: Transgenic T0 plantlets圖3 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)Fig.3 PCR detection of transgenic plantlets

圖5 F1代植株的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果Fig.5 Sequencing results of PCR products from F1 generation plants

A：sgRNA-1靶位點(diǎn)的突變序列比對(duì)；B：sgRNA-2靶位點(diǎn)的突變序列比對(duì)；G、J、H：不同的F1代植株A: DNA sequence alignment of sgRNA-1 target site; B: DNA sequence alignment of sgRNA-2 target site; G，J,H: Different F1 generation plants圖6 亞克隆中 hptII基因靶位點(diǎn)突變序列比對(duì)Fig.6 DNA sequence alignment of hptII gene target site in subclone

3 討 論

在植物遺傳轉(zhuǎn)化中，SMG起著非常重要的作用，可以幫助更準(zhǔn)確快捷地得到轉(zhuǎn)化子，但當(dāng)轉(zhuǎn)化完成后，SMG就失去了其使用價(jià)值。相反，在轉(zhuǎn)基因植物中，SMG的存在被認(rèn)為可能對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境存在潛在的危害。隨著轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化進(jìn)程的快速發(fā)展，無SMG轉(zhuǎn)基因植物的研究和培育已成為國(guó)際上植物基因工程領(lǐng)域的一個(gè)趨勢(shì)。目前，刪除SMG的常用方法主要有：共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)法、DNA位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)法、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)法、同源重組法和多元自主轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)法[11]。利用這些方法在水稻[12-13]、玉米[14]、大豆[15]、柑橘[16]等作物研究上都成功實(shí)現(xiàn)了刪除SMG。經(jīng)過這么多年的發(fā)展，刪除SMG的技術(shù)也在不斷發(fā)展完善中，但目前這些技術(shù)大多處于實(shí)驗(yàn)室研究領(lǐng)域，且每種方法都存在著一定的局限性。因此簡(jiǎn)單快捷高效地刪除SMG技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用，仍然是國(guó)內(nèi)外轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要課題。

CRISPR/Cas9技術(shù)自2013年初建立以來，被認(rèn)為是一種相比ZFN和TALEN操作更簡(jiǎn)單快捷、作用更高效準(zhǔn)確的基因組編輯技術(shù)。目前已成功廣泛應(yīng)用于玉米[17]、水稻[18-20]、小麥[21-22]、大豆[23-24]、番茄[25]等作物轉(zhuǎn)基因研究中，編輯效率有的甚至可以達(dá)到100 %。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)，針對(duì)水稻轉(zhuǎn)基因中常用的SMGhptII基因進(jìn)行敲除。首先將構(gòu)建的用于編輯hptII基因的編輯載體轉(zhuǎn)入野生型水稻日本晴中，篩選獲得Cas9表達(dá)的純合株系；再將得到的編輯hptII基因的水稻純合植株與含有hptII基因的轉(zhuǎn)基因水稻植株進(jìn)行雜交，在雜交F1代植株中即獲得了hptII基因被敲除的植株。進(jìn)一步，F(xiàn)1代植株通過自交得到F2代，在F2代中篩選可得到hptII基因DNA缺失、不能翻譯出HPTII抗性蛋白，且不含有用于進(jìn)行編輯hptII基因所轉(zhuǎn)入水稻植株的外源DNA的植株，可以得到徹底刪除轉(zhuǎn)基因水稻中的hptII基因和其他非目的基因的外源片段的植株。

4 結(jié) 論

利用CRISPR/Cas9技術(shù)，成功獲得了可用于敲除水稻轉(zhuǎn)基因中hptII基因的轉(zhuǎn)基因水稻，利用該水稻與含hptII基因的轉(zhuǎn)基因水稻雜交，即可得到敲除hptII基因的水稻。利用該方法可在轉(zhuǎn)化完成后才刪除SMG，具有簡(jiǎn)單、通用的特點(diǎn)。