從JAK-STAT信號通路探討痹證寧對風(fēng)寒濕痹型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制

何東初 張倩

【摘 要】目的：探討痹證寧對風(fēng)寒濕痹型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎JAK-STAT信號通路的影響及作用機(jī)制。方法：將70只Wistar大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組，模型對照組，痹證寧低、中、高劑量組（9，18，36 g·kg-1），甲氨蝶呤組（1 mg·kg-1）和中西醫(yī)結(jié)合組（甲氨蝶呤1 mg·kg-1+痹證寧18 g·kg-1），每組10只。除空白對照組外，其余各組大鼠模擬風(fēng)寒濕環(huán)境，采用Ⅱ型膠原誘導(dǎo)方法制備風(fēng)寒濕痹型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型，各組大鼠給予相應(yīng)藥物干預(yù)。28 d后，觀察大鼠關(guān)節(jié)腫脹度、關(guān)節(jié)滑膜組織白細(xì)胞介素-6（IL-6）含量、PIAS3、P-STAT3蛋白和JAK3、STAT3 mRNA表達(dá)情況。結(jié)果：痹證寧可顯著降低風(fēng)寒濕痹型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠的關(guān)節(jié)腫脹度，降低IL-6含量，抑制P-STAT3蛋白、JAK3和STAT3 mRNA過表達(dá)，增進(jìn)PIAS3蛋白表達(dá)。結(jié)論：痹證寧有抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用，其作用機(jī)制可能與抑制JAK-STAT信號通路的過度激活有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕;痹證寧;風(fēng)寒濕痹;JAK-STAT信號通路

【ABSTRACT】Objective：To explore the effect of Bizheng Ning（痹證寧）on JAK-STAT signal pathwayin rheumatoid arthritis of wind-cold-dampness bi type and its mechanism.Methods：Seventy Wistar rats were randomly divided into a blank control group，a model control group，low，medium and high dose Bizheng Ning groups（9，18，36 g·kg-1），a methotrexate group（1 mg·kg-1）and a combination group（1 mg·kg-1 of methotrexate + 18 mg·kg-1 of Bizheng Ning）treated with Chinese and Western medicine.There were10 rats in each group.Except the blank control group，the other groups of rats were used to establish rheumatoid arthritis models of wind-cold-dampness bi type by the method of typeⅡ collagen induction.The rats in each group were given corresponding medicine intervention.After 28 days，the degree of joint swelling，the content of IL-6 in synovium tissue，PIAS3，the expressions of P-STAT3 protein，JAK3 and STAT3 mRNA were observed.Results：Bizheng Ning can significantly reduce the joint swelling and IL-6 content，inhibit the expressions of P-STAT3 protein，JAK3 and STAT3 mRNA，and increase the expression of PIAS3 protein.Conclusion：Bizheng Ning has anti-inflammatory and immunomodulatory effects，whose mechanism may be related to inhibiting the over activation of JAK-STAT signal pathway.

【Keywords】arthritis，rheumatoid;Bizheng Ning（痹證寧）;wind-cold-dampnessbi;JAK-STAT signal pathway

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種因高風(fēng)險遺傳、環(huán)境暴露等多種因素導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜炎的自身免疫性疾病，其病變可累及內(nèi)臟器官結(jié)構(gòu)[1]。目前，臨床治療RA的藥物主要有非甾體抗炎藥（NSAIDs）、改善病情抗風(fēng)濕藥（DMARDs）、糖皮質(zhì)激素等，這些藥物雖然能在一定程度上緩解病情，但需要長期服用，并且對患者的血細(xì)胞、肝腎功能都有不同程度的損害。隨著疾病研究的深入，各種生物制劑相繼出現(xiàn)，但其價格昂貴，且存在感染等不良反應(yīng)[2-4]。因此，尋求高效低毒又個體化治療的藥物顯得尤為重要。痹證寧是中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院自擬中藥復(fù)方，前期臨床試驗已證實本方可改善RA患者臨床癥狀且不良反應(yīng)少[5]。本研究將觀察痹證寧對RA治療效果并探討其作用機(jī)制，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康Wistar大鼠70只，雌性，體質(zhì)量（160±20）g，購于湖北省疾病防疫控制中心實驗動物中心，動物許可證號SCXK（鄂）2015-0018。飼養(yǎng)溫度（23±1）℃，濕度（60±10）%，光照和黑暗各12 h更替，每天補(bǔ)充飼料、飲用水保證正常喂養(yǎng)。

1.2 藥品與試劑 痹證寧方由鹿角膠、制附子、威靈仙、青風(fēng)藤等中藥組成，藥物購自中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院并由其中藥制劑室加工制作;甲氨蝶呤片[上海醫(yī)藥（集團(tuán)）有限公司信誼制藥總廠，生產(chǎn)批號036190302];牛Ⅱ型膠原蛋白（biosharp公司）;弗氏完全佐劑（美國Sigma公司，生產(chǎn)批號SLBW1457）;白細(xì)胞介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒（武漢科鹿生物科技有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號16147145646）;抗P-STAT3抗體（美國CST公司，9145S，生產(chǎn)批號34）;抗PIAS3抗體（美國CST公司，4164S，生產(chǎn)批號2）。

1.3 主要儀器 臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，TGL-16c）;冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)公司，TGL-16）;制冰機(jī)（常熟市雪科電器有限公司，IMS-20）;PCR儀（杭州博日科技，基因擴(kuò)增儀TC-XP）;熒光定量PCR儀（Life technologies，StepOne Real-Time PCR System）;酶標(biāo)儀（Diatek公司，DR-200Bs）;電泳儀（北京市六一儀器廠，DYY-6C）;掃描儀（Canon，LiDE110）。

2 方 法

2.1 動物分組、模型制備及給藥 將Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為7組：空白對照組，模型對照組，痹證寧低、中、高劑量組（9，18，36 g·kg-1），甲氨蝶呤組（1 mg·kg-1）和中西醫(yī)結(jié)合組（甲氨蝶呤1 mg·kg-1 + 痹證寧18 g·kg-1），每組10只。冰浴環(huán)境下將牛Ⅱ型膠原蛋白充分溶解于0.1 mol·L-1的冰醋酸，配成濃度為2 mg·mL-1的溶液。4 ℃放置過夜后與等體積完全弗氏佐劑充分乳化制成1 g·L-1的牛Ⅱ型膠原乳劑，于造模各組大鼠足跖及尾根部多點皮下注射配制好的膠原乳劑0.2 mL。除空白對照組外，將其余各組大鼠模擬風(fēng)寒濕環(huán)境[6]，置于5～7 ℃冷水中，水深2 cm，同時伴以4級風(fēng)力，每日20 min，持續(xù)14 d;首次免疫后第7天再次加強(qiáng)免疫1次，以制備風(fēng)寒濕痹型RA大鼠動物模型;空白對照組大鼠于相同部位皮下注射等量生理鹽水。造模第15天開始灌胃給藥（記為1 d），空白對照組、模型對照組大鼠給予等體積生理鹽水，痹證寧低、中、高劑量組分別給予相應(yīng)劑量藥物，每日1次，連續(xù)28 d;甲氨蝶呤組每周1次給藥，共4次。

2.2 觀察指標(biāo) 觀察各組大鼠足趾腫脹情況，從造模第15天開始，采用容積法檢測各組大鼠右后肢容積，每周1次。關(guān)節(jié)腫脹度計算如下：腫脹度 = （造模前容積-造模后容積）/造模前容積×100%。給藥28 d后，將大鼠處死，浸泡在新潔爾滅消毒液中5 min。于膝關(guān)節(jié)正中縱向切開皮膚，暴露膝關(guān)節(jié)，在髕骨上緣橫向切斷上面的肌肉和韌帶，再從髕骨兩側(cè)向下分離，然后翻開髕骨，打開膝關(guān)節(jié)，可以看見髕骨下緣韌帶上附著一層微黃發(fā)亮的組織，即滑膜組織，用手術(shù)刀將其分離出來。用同樣的方法采集另一側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織。分別采用ELISA法檢測滑膜組織中IL-6水平，Western Blot法檢測滑膜中PIAS3、P-STAT3蛋白的表達(dá)水平，采用Real time-PCR法對滑膜組織中JAK3、STAT3 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果分析采用2-△△CT法。見表1。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，進(jìn)行單因素方差分析，多組間比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 痹證寧對大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織IL-6含量的影響 模型對照組比空白對照組滑膜組織IL-6含量顯著升高（P < 0.01），提示造模成功;給藥組較模型對照組均有所下降，其中，痹證寧中劑量組、甲氨蝶呤組、中西醫(yī)結(jié)合組差異有統(tǒng)計學(xué)意義

（P < 0.01）;在給藥組中，中西醫(yī)結(jié)合組的IL-6含量最低，與痹證寧各劑量組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見表2。

3.2 痹證寧對大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的影響 各模型組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度與空白對照組比較顯著升高（P < 0.01）;與模型對照組比較，甲氨蝶呤組、中西醫(yī)結(jié)合組自給藥7 d，痹證寧給藥14 d均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）;給藥14 d開始，中西醫(yī)結(jié)合組抗關(guān)節(jié)腫脹作用明顯優(yōu)于其他給藥組（P < 0.01）;痹證寧各劑量組中，至給藥28 d，中劑量組較低，高劑量組顯著降低（P < 0.05）。見表3。

3.3 痹證寧對大鼠關(guān)節(jié)滑膜P-STAT3、PIAS3蛋白表達(dá)的影響 與空白對照組比較，模型對照組、痹證寧各劑量組、甲氨蝶呤組大鼠滑膜組織P-STAT3蛋白表達(dá)顯著升高（P < 0.01），而模型對照組PIAS3蛋白表達(dá)較空白對照組上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ﹥ 0.05）;與模型對照組比較，痹證寧各劑量組、甲氨蝶呤組和中西醫(yī)結(jié)合組P-STAT3表達(dá)明顯降低（P < 0.01），痹證寧中劑量組、甲氨蝶呤組和中西醫(yī)結(jié)合組PIAS3表達(dá)顯著升高（P < 0.01）。其中，中西醫(yī)結(jié)合組相較其他給藥組P-STAT3顯著降低、PIAS3表達(dá)明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）;而在痹證寧各劑量組中，痹證寧中劑量組大鼠關(guān)節(jié)滑膜P-STAT3蛋白表達(dá)明顯低于痹證寧低、高劑量組（P < 0.01）。見圖1、表4。

3.4 痹證寧對大鼠關(guān)節(jié)滑膜JAK3、STAT3 mRNA表達(dá)的影響 模型對照組、痹證寧各劑量組和甲氨蝶呤組大鼠滑膜JAK3、STAT3 mRNA表達(dá)較空白對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）;與模型對照組比較，痹證寧各劑量組、甲氨蝶呤組和中西醫(yī)結(jié)合組JAK3、STAT3 mRNA表達(dá)明顯降低（P < 0.01），而與其他給藥組比較，中西醫(yī)結(jié)合組JAK3、STAT3 mRNA表達(dá)顯著降低（P < 0.01）;痹證寧中劑量組大鼠關(guān)節(jié)滑膜STAT3 mRNA表達(dá)低于痹證寧低、高劑量組（P < 0.01），而在JAK3 mRNA表達(dá)上，痹證寧中劑量組明顯低于高劑量組（P < 0.01），與痹證寧低劑量組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ﹥ 0.05）。見表5。

4 討 論

RA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇?！队卓迫槨分小氨哉?，內(nèi)因肝血不足”，《靈樞·陰陽二十五人》中“血氣皆少……善痹骨痛”提示氣血虧虛、肝腎不足是痹證之內(nèi)因，《素問·痹論篇》中：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也?！北硎撅L(fēng)寒濕邪是導(dǎo)致痹證發(fā)生的外在因素。故本院自擬痹證寧方，由附子、威靈仙、青風(fēng)藤、徐長卿、細(xì)辛、獨活、生薏苡仁等16味中藥組成，有補(bǔ)益氣血肝腎、風(fēng)寒濕邪得調(diào)的功效。其中，制附子[7]具有消除關(guān)節(jié)腫脹、改善滑膜組織病理變化等作用;威靈仙總皂苷[8-9]可降低IL-6、IL-17、腫瘤壞死因子-α的含量，抑制P-JAK2、P-STAT3蛋白表達(dá)，有抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫的作用;青風(fēng)藤[10]可降低核轉(zhuǎn)錄因子κB受體活化因子配體/骨保護(hù)素水平，抑制破骨細(xì)胞生成，對關(guān)節(jié)破壞起到抑制作用。

膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠模型因其病理改變與RA患者相似度最高，是目前公認(rèn)的篩選治療RA藥物的理想模型[11]。近年來研究表明，促炎細(xì)胞因子經(jīng)JAK/STAT信號通路激活是RA的發(fā)病機(jī)制和病程進(jìn)展中的關(guān)鍵事件[12]。JAK-STAT信號通路參與多種疾病的免疫、分化、凋亡和腫瘤形成等過程，是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)之間的相互作用鏈[13]。細(xì)胞因子與其相應(yīng)的膜受體聯(lián)系，JAK沉淀激活，介導(dǎo)STAT的酪氨酸磷酸化形成STAT二聚體，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與相應(yīng)DNA結(jié)合，并最終調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。其中，IL-6與JAK1、JAK2、TYK2結(jié)合，誘導(dǎo)STAT3的激活，其水平的升高與T細(xì)胞和單核細(xì)胞的STAT3磷酸化水平密切相關(guān)。而STAT3失調(diào)后，可失去對成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡的抑制作用，同時對抗體的產(chǎn)生、T細(xì)胞存活也失去調(diào)節(jié)作用[14-15]。PIAS3是調(diào)節(jié)STAT3過度激活的抑制因子，通過結(jié)合STAT3DNA結(jié)合域，與二聚體相互作用阻斷其轉(zhuǎn)錄，從而抑制細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[16]。在淋巴細(xì)胞大量表達(dá)的JAK3參與介導(dǎo)IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15等多種細(xì)胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對調(diào)節(jié)免疫功能、修復(fù)軟骨組織有著重要作用[17-18]。針對JAK3的小分子抑制劑Tofacitinib也已被美國FDA批準(zhǔn)上市[12]，因此，JAK-STAT信號通路在RA起病和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用，特異性阻斷JAK3/STAT3通路成為治療RA的靶點。

本課題主要建立風(fēng)寒濕痹型CIA大鼠模型，觀察痹證寧對RA活動期關(guān)節(jié)腫脹度的影響及炎性因子IL-6水平表達(dá)情況，滑膜組織中PIAS3、P-STAT3蛋白表達(dá)，以及JAK3、STAT3 mRNA表達(dá)水平的高低，探討痹證寧治療RA的可能作用靶點。實驗結(jié)果顯示，痹證寧各劑量組明顯減輕風(fēng)寒濕痹型CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹度，對IL-6含量、P-STAT3蛋白，以及JAK3、STAT3 mRNA的過表達(dá)較模型對照組均有抑制作用，PIAS3表達(dá)上升。因此，痹證寧可能是通過降低IL-6細(xì)胞因子含量，抑制JAK3/STAT3信號通路的過度激活狀態(tài)，同時增進(jìn)PIAS3對STAT3的抑制作用來改善關(guān)節(jié)破壞，延緩RA病情發(fā)展。而痹證寧聯(lián)合甲氨蝶呤的療效均優(yōu)于單一用藥，其對JAK-STAT信號通路中PIAS3、P-STAT3、JAK3、STAT3的作用也強(qiáng)于其他各組，為臨床治療RA提供實驗依據(jù)。其中痹證寧中劑量組的作用效果較低、高劑量組顯著，可能與中劑量組血藥濃度較高，藥物吸收更好，相對于高劑量組無胃腸道反應(yīng)等有關(guān)。相關(guān)預(yù)實驗研究提示中劑量療效好，故而選取痹證寧中劑量聯(lián)合甲氨蝶呤用藥，下一步可繼續(xù)研究痹證寧最佳劑量以及聯(lián)合用藥配比關(guān)系。

綜上所述，本研究在前期臨床觀察基礎(chǔ)上探討痹證寧對RA的JAK-STAT信號通路的影響。結(jié)果表明，痹證寧有抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用，其作用機(jī)制可能與抑制JAK-STAT信號通路的過度激活有關(guān)?？煽紤]進(jìn)行其他信號通路相關(guān)指標(biāo)檢測及滑膜細(xì)胞培養(yǎng)實驗，進(jìn)一步確定痹證寧對RA的治療及多靶點作用機(jī)制。

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