腦信號(hào)蛋白3A及其受體神經(jīng)菌毛素-1在慢性肝性腦病大鼠模型中的表達(dá)及意義

阮景晟， 陳 闖， 李科志， 黃 山， 何劍波， 曾愛(ài)屏， 連 芳， 鄔國(guó)斌

1 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 肝膽外科， 南寧 530021； 2 廣西醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 南寧 530021

肝性腦病(hepatic encephalopathy，HE)是由肝功能不全和(或)門(mén)體靜脈分流所引起的大腦功能障礙，表現(xiàn)為從輕微認(rèn)知障礙到昏迷等一系列神經(jīng)精神癥狀[1-2]。HE是急慢性肝病常見(jiàn)的并發(fā)癥，病死率較高[3]。目前HE發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，也無(wú)有效的防治藥物與方法。因此，建立HE動(dòng)物模型對(duì)其發(fā)病機(jī)制、診斷和治療的基礎(chǔ)及臨床研究發(fā)揮著重要作用[4]。HE患者臨床表現(xiàn)出一系列的運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀，如運(yùn)動(dòng)能力、協(xié)調(diào)能力、運(yùn)動(dòng)活性等的降低[5-6]。尋找與HE發(fā)病相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)相關(guān)蛋白的改變及作用很有探索意義[7]。Sema3A是一種分泌型蛋白，其具有影響神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)軸突導(dǎo)向的功能[8]。Sema3A可以通過(guò)跨膜蛋白受體神經(jīng)菌毛素(neuropilins-1,NRP-1)結(jié)合形成Plex-NP復(fù)合物來(lái)誘導(dǎo)軸突末端的生長(zhǎng)錐坍塌崩解來(lái)引發(fā)神經(jīng)退行性疾病，但在神經(jīng)系統(tǒng)損傷與修復(fù)中的作用尚未完全清楚[9-11]。國(guó)外已有研究[12]證明了去葡萄糖對(duì)大鼠神經(jīng)皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Sema3A及NRP-1的作用及影響。因此，本文通過(guò)建立HE大鼠模型檢測(cè)Sema3A及其受體NRP-1的表達(dá)及變化情況，初步探討Sema3A及NRP-1參與HE病理生理過(guò)程的相關(guān)機(jī)制，為相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究及HE的臨床干預(yù)提供新的思路及靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量200～220 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCKK桂2014-0002，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK桂2014-0003。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合中國(guó)倫理委員會(huì)的相關(guān)要求。

1.1.2 藥品及試劑 乙酸銨；Sema3A兔多克隆抗體，NRP-1兔單克隆抗體，Anti-beta Actin兔多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為ab23393、ab81321、ab8227)；山羊抗兔IgG(H + L)抗體(上海碧云天公司，批號(hào)A0208)；大鼠血氨Elisa試劑盒(江蘇JSBOSSEN公司，批號(hào)BS-E12304R2);大鼠ALP、ALT、AST、TAB、Alb、TBil ELISA試劑盒(江蘇酶免公司，批號(hào)分別為MM-0217R1、MM-20436R1、MM-20437R1、MM-20428R1、MM-20429R1、 MM-20439R1)； Real-time PCR試劑盒(日本Takara公司，批號(hào)：RR820A)；引物β-Actin：上游5’-CTGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’；下游5’-AGGAA-GAGGATGCGGCAGTGG-3’；Sema3A：上游5’-TTGCTCGGGACCCTTATTGTG-3’；下游5’-CAGTGAGTCAGTGGGTCTCCATTC-3’；NRP-1：上游5’-CCCTCCTCCT-CGCAACTCCTC-3’；下游5’-CTCAAGTCGCCTGCATCCTGTC-3’。

1.1.3 儀器 SMART3.0行為學(xué)采集和分析系統(tǒng)(西班牙 Panlab 公司)；Axio Observer 3型倒置顯微鏡(德國(guó) Carl Zeiss 公司)；Power/Pac300 型電泳儀，CelDoc2000型凝膠電泳成像分析儀(美國(guó) Bio-Rad 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠HE模型(C型)的制備 將40只SD大鼠按照體質(zhì)量、身體狀況、活動(dòng)性等均衡的原則隨機(jī)分為4組：對(duì)照組，HE 1 d、15 d、30 d組，每組10只。HE模型制備：水合氯醛大鼠腹腔麻醉后，無(wú)菌操作開(kāi)腹結(jié)扎大鼠膽總管，并將兩結(jié)扎之間的膽總管切除，給予膽總管切除術(shù)后大鼠連續(xù)灌胃濃度10 %的乙酸銨2周。對(duì)照組給予開(kāi)腹后縫合但不進(jìn)行膽管結(jié)扎和灌胃。

1.2.2 大鼠行為學(xué)檢測(cè) 利用SMART3.0行為學(xué)采集和分析系統(tǒng)在曠場(chǎng)中分析大鼠的行為，大鼠出現(xiàn)自主性活動(dòng)減少、嗜睡、反應(yīng)遲緩、共濟(jì)失調(diào)等癥狀之一，即可診斷為HE[13]。Zimmermann法[14]對(duì)大鼠分級(jí)，0 級(jí)：正常(11 分)；Ⅰ級(jí)：反應(yīng)遲緩，神經(jīng)反射正常(11 分)；Ⅱ級(jí)：自主活動(dòng)下降，但反射仍基本正常(10～11 分)；Ⅲ級(jí)：共濟(jì)失調(diào)(<10 分)；Ⅳ級(jí)：角膜反射消失，動(dòng)物昏迷(0 分)。

1.2.3 血液生化指標(biāo)及肝臟與腦組織病理學(xué)檢測(cè) 大鼠禁食12 h后水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心，取上清。檢測(cè)血清中血氨、TBA、Alb 、TBil、AST、ALT、ALP。取各組大鼠腦組織和一小塊左葉肝組織固定，包埋，切片，染色。

1.2.4 Real-time PCR檢測(cè)Sema3A及NRP-1 mRNA的表達(dá)水平 每組10只大鼠麻醉后處死，分離出大鼠腦皮質(zhì)和海馬各區(qū)，加入trizol提取RNA 進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。2﹣△△ct用以計(jì)算mRNA的表達(dá)情況。

1.2.5 免疫組化法檢測(cè)前額葉皮層、海馬各區(qū)中Sema3A/NRP-1蛋白的表達(dá) 切片脫蠟、水化、抗原修復(fù)，封閉，一抗Sema3A(1∶300)/NRP-1(1∶200)，4 ℃孵育，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，DAB顯色，封片。棕褐色或棕黃色為蛋白染色陽(yáng)性表達(dá)。

1.2.6 Western Blot檢測(cè)前額葉皮層及海馬CA1、CA3、DG各區(qū)組織中Sema3A/NRP-1的表達(dá) 取各組大鼠皮層、海馬CA1、CA3、DG區(qū)組織提取蛋白。SDS-PAGE電泳，封閉1 h，一抗Sema3A，NRP-1，β-actin(均1∶1000),4 ℃孵育，TBST洗膜3次，二抗孵育1 h，洗膜3次。Image J軟件采集條帶灰度值，取目的條帶和內(nèi)參條帶灰度值比值作為相對(duì)表達(dá)量。

比較用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)反射、血氨水平及HE分級(jí)的比較 對(duì)照組大鼠活動(dòng)正常，感覺(jué)及神經(jīng)反射靈敏。造模組大鼠均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)反射和自主活動(dòng)的減弱。與對(duì)照組相比，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)(1 d、15 d、30 d)模型組在曠場(chǎng)中神經(jīng)反射等級(jí)、HE分級(jí)、血氨均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠神經(jīng)反射評(píng)分、血氨濃度、HE分級(jí)的比較

注：與對(duì)照組比較，1)P<0.01，2)P<0.001；與HE 1 d組相比，3)P<0.001；與HE 15 d組相比，4)P<0.001。

2.2 各組大鼠血清學(xué)各生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 4組間TBA、Alb 、TBil、AST、ALT、ALP比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.001)，與對(duì)照組相比，模型組Alb水平隨時(shí)間的延長(zhǎng)(1 d、15 d、30 d)明顯降低，其余指標(biāo)明顯升高(P值均<0.05)(表2)。

2.3 各組大鼠肝臟和大腦皮層、海馬CA1、CA3、DG區(qū)的病理結(jié)構(gòu)的比較 肝臟HE染色結(jié)果顯示：對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞正常，無(wú)腫脹、變性、壞死等明顯病理改變。模型組大鼠肝臟匯管區(qū)及小葉周邊可見(jiàn)纖維組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。對(duì)照組大鼠腦組織清晰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元分布均勻;海馬CA1、CA3、DG區(qū)結(jié)構(gòu)清楚，染色質(zhì)均勻，細(xì)胞排列整齊。模型組可見(jiàn)大腦皮層及海馬CA1、CA3、DG區(qū)大量神經(jīng)細(xì)胞核固縮變形，染色加深，細(xì)胞排列紊亂(圖2)。

2.4 造模后各腦區(qū)Sema3A及NRP-1 mRNA表達(dá)的改變 HE組大鼠前額葉皮層和海馬CA1、CA3、DG區(qū)Sema3A及NRP-1 mRNA表達(dá)于造模后開(kāi)始上調(diào)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)(1 d、15 d、30 d)明顯增加，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.001)(表 3、4)。

表2 各組大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)結(jié)果分析

注：與對(duì)照組比較，1)P<0.001；與HE 1 d組比較，2)P<0.001；與HE 15 d組比較，3)P<0.05。

注：a、c，對(duì)照組；b、d，HE 30 d組。

注：a、c、g、e，對(duì)照組；b、d、f、h，HE 30 d組。

2.5 大鼠各腦區(qū)Sema3A及NRP-1蛋白表達(dá)分析 免疫組化結(jié)果顯示，HE組大鼠前額葉皮層和海馬CA1、CA3、DG區(qū)Sema3A及NRP-1呈陽(yáng)性染色，Sema3A陽(yáng)性染色可見(jiàn)于神經(jīng)元胞質(zhì)和軸突，以胞膜和胞質(zhì)為主(圖3)；NRP-1陽(yáng)性染色可見(jiàn)于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞，以胞質(zhì)為主，偶可見(jiàn)于胞核(圖4)。Western Blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比, HE組Sema3A及NRP-1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.001)(圖5，表5)。

3 討論

HE動(dòng)物模型的制備分為A型、B型、C型等[15]。其中可能接近慢性HE形成機(jī)制的是C型動(dòng)物模型，其他模型均會(huì)導(dǎo)致肝臟的急性損傷，造成模型動(dòng)物的死亡率較高，對(duì)HE模型的病理生理機(jī)制的研究帶來(lái)困擾[16-19]。本研究采用膽管結(jié)扎和以低毒性的乙酸銨灌胃的方式制備HE模型，模型動(dòng)物神經(jīng)功能呈現(xiàn)隨時(shí)間延長(zhǎng)的緩慢持續(xù)性受損，病理學(xué)觀察肝臟內(nèi)可見(jiàn)膽汁淤積和炎性細(xì)胞聚集的慢性肝損傷病變，腦組織內(nèi)可見(jiàn)大量神經(jīng)元變性，局部膠質(zhì)細(xì)胞的增生及尼氏體的固縮紊亂。且模型動(dòng)物的死亡率很低，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)建立了較為可靠穩(wěn)定的HE模型，這是進(jìn)行相關(guān)分子機(jī)制研究的基礎(chǔ)。

Sema3A在神經(jīng)系統(tǒng)中可以根據(jù)神經(jīng)元內(nèi)cGMP水平的改變而呈現(xiàn)雙重性的生物功能，可以作為某種化學(xué)抑制劑，抑制神經(jīng)軸突生長(zhǎng)，或作為化學(xué)激活劑，刺激樹(shù)突頂端生長(zhǎng)[20-22]。除了神經(jīng)系統(tǒng)以外，Sema3A在其他組織也有分布，與細(xì)胞遷徙、腫瘤生長(zhǎng)、免疫反應(yīng)及血管生成都有密切關(guān)系[23-24]。2014年Nature發(fā)表了關(guān)于神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Sema3A的研究成果[8]，證實(shí)了阻斷Sema3A的生成，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元無(wú)法形成正常的連接，并且半數(shù)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡。由此推斷特定區(qū)域內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)Sema3A蛋白是維持控制反射動(dòng)作神經(jīng)回路的必要條件。近年來(lái)有研究[25-26]表明，在腦缺血梗死及脊髓損傷中，Sema3A在梗死灶及其周圍瘢痕區(qū)的大腦皮層和海馬組織中表達(dá)上調(diào)，呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。與此相似的是，本研究結(jié)果顯示，大鼠HE模型中隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，前額葉皮層和海馬CA1、CA3、DG區(qū)Sema3A蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，提示HE的發(fā)生發(fā)展機(jī)制中可能與Sema3A蛋白的高表達(dá)有關(guān)。

NRP-1是一種跨膜受體，可以介導(dǎo)Sema3A的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[27]。Sema3A通過(guò)與跨膜蛋白受體NRP-1結(jié)合形成Plex-NP復(fù)合物，構(gòu)成了Sema3A信號(hào)通路第一級(jí)水平的調(diào)節(jié)，然后通過(guò)一定途徑將信號(hào)傳遞給細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白，使軸突生長(zhǎng)錐和其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)的變化[28]。NRP-1表達(dá)于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞，可介導(dǎo)多種信號(hào)蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)，與腦損傷、腦缺血、腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成等都有密切的關(guān)系[29]。有報(bào)道[30]顯示，Sema3A與NRP-1形成的受體復(fù)合物，會(huì)使微管蛋白磷酸化，導(dǎo)致微管的失穩(wěn)和解聚，從而導(dǎo)致生長(zhǎng)錐的崩潰及神經(jīng)功能的紊亂。本研究結(jié)果顯示，大鼠HE模型建立后NRP-1逐漸上調(diào)。結(jié)合上述結(jié)果，認(rèn)為HE的發(fā)生機(jī)制可能與Sema3A/NRP-1軸的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

表3 大鼠各腦區(qū)Sema3AmRNA表達(dá)的改變

注：與對(duì)照組比較，1)P<0.001；與HE 1 d組比較，2)P<0.001；與HE 15 d組比較，3)P<0.001。

表4 大鼠各腦區(qū)NRP-1mRNA表達(dá)的改變

注：與對(duì)照組比較，1)P<0.001；與HE 1 d組比較，2)P<0.001；與HE 15 d組比較，3)P<0.001。

圖3 大鼠前額葉皮層和海馬CA1、CA3、DG區(qū)不同時(shí)間Sema3A的表達(dá)改變(免疫組化染色，×400)

圖4 大鼠前額葉皮層和海馬CA1、CA3、DG區(qū)不同時(shí)間NRP-1的表達(dá)改變(免疫組化染色，×400)

注：a，前額葉皮層；b，海馬CA1區(qū)；c，海馬CA3區(qū)；d，海馬DG區(qū)。

表5大鼠前額葉皮層和海馬中Sema3A和NRP-1蛋白表達(dá)的定量分析

組別動(dòng)物數(shù)(只)前額葉皮層Sema3A NRP-1CA1區(qū) Sema3A NRP-1 CA3區(qū)Sema3A NRP-1DG區(qū) Sema3A NRP-1 對(duì)照組100.11±0.020.40±0.040.51±0.040.34±0.030.44±0.03 0.23±0.03 0.22±0.02 0.42±0.03HE 1 d組100.19±0.021)0.67±0.041)0.70±0.021)0.65±0.041)0.54±0.341)0.30±0.031)0.32±0.031)0.56±0.031)HE 15 d組HE 30 d組10100.29±0.011)2)0.76±0.051)2)3)0.89±0.341)2)1.35±0.061)2)3)0.99±0.071)2)1.41±0.031)2)3)0.75±0.031)2) 0.98±0.051)2)3)0.61±0.051)2)1.00±0.071)2)3)0.53±0.031)2)0.64±0.041)2)3)0.64±0.031)2)0.86±0.041)2)3)0.72±0.041)2) 1.06±0.101)2)3)F值835.14876.59774.16472.48282.60402.36856.29207.47P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 <0.001 <0.001

注：與對(duì)照組比較，1)P<0.001；與HE 1 d組比較，2)P<0.001；與HE 15 d組比較，3)P<0.001。

目前HE的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，關(guān)于發(fā)病機(jī)制的主要學(xué)說(shuō)有氨中毒、氧化應(yīng)激、γ-氨基丁酸、錳離子、假性神經(jīng)遞質(zhì)、血漿氨基酸失衡等[31]。氨中毒是目前主流的認(rèn)同觀點(diǎn)，在HE治療過(guò)程中降低血氨仍是主要的治療措施。在臨床治療過(guò)程中緩解氨中毒癥狀可以減緩HE患者的臨床昏迷癥狀。臨床前瞻性研究中血氨與認(rèn)知功能障礙存在一定的劑量依賴關(guān)系[32]。而且國(guó)內(nèi)外關(guān)于氨中毒對(duì)HE發(fā)病機(jī)制及其神經(jīng)系統(tǒng)病變影響的研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，已有研究[33]表明在大鼠慢性HE模型中，降低血氨后大鼠神經(jīng)系統(tǒng)一系列測(cè)試和評(píng)分都有改善，降低血氨對(duì)大鼠肝功能生物標(biāo)志物及一些炎癥因子、凋亡基因、神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)都有一定影響。與此相似的是，本研究中慢性HE大鼠血氨的升高可能對(duì)Sema3A/NRP-1的表達(dá)也有一定的影響作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，Sema3A及其受體NRP-1在大鼠HE后隨著病變的進(jìn)展表達(dá)逐漸上調(diào)，Sema3A/NRP-1可能參與到抑制軸突生長(zhǎng)，阻礙神經(jīng)介導(dǎo)，擾亂神經(jīng)功能的病理生理機(jī)制中。血氨、Alb等炎性介質(zhì)也可能對(duì)Sema3A/NRP-1的表達(dá)及其他基因調(diào)控機(jī)制有一定的影響?；诋?dāng)前的研究進(jìn)展，可對(duì)Sema3A/NRP-1神經(jīng)軸進(jìn)行NRP-1抑制肽、基因調(diào)控、尋找上下游靶點(diǎn)等進(jìn)行干預(yù)。本研究尚未進(jìn)行干預(yù)措施的研究，但為其相關(guān)干預(yù)的研究提供了靶點(diǎn)及良好的理論基礎(chǔ)。