生脈注射液對人鼻咽癌CNE-2細胞抗拒株的放射增敏作用＊

劉詩雅，朱道琦，楊家彬，婁丹丹，高瑞嬌，呂 英，范 欽＊＊

（1.南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院分子生物實驗室 廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院古中醫(yī)科 廣州 510515）

鼻咽癌是我國多發(fā)的惡性腫瘤，中國人群的發(fā)病率和死亡率明顯高于世界平均水平[1]。放射治療是目前臨床首選的治療手段，但是在臨床治療中發(fā)現(xiàn)許多患者存在放射抗拒現(xiàn)象，嚴重影響放療療效及其預后?，F(xiàn)有的西藥放射增敏劑能夠有效提高鼻咽癌的放射敏感性，可是由于存在一定的毒副作用，這些藥物的臨床應(yīng)用受到限制[2-3]。因此尋找高效低毒的放射增敏劑成為研究熱點。

生脈注射液是經(jīng)典益氣養(yǎng)陰方劑“生脈飲”加工而成的中藥注射液，具有益氣復脈、養(yǎng)陰生津的功效，能夠有效減輕多種癌癥放化療毒副作用和實現(xiàn)放化療增效，提高患者生活質(zhì)量[4-5]。在前期研究中，本課題組發(fā)現(xiàn)生脈飲組方生脈姜黃散[6-7]、加味生脈散[8]等都對鼻咽癌有放射增敏作用，因此為進一步明確其作為增敏劑的可能性，本研究選用課題組前期成功構(gòu)建的可穩(wěn)定表達的鼻咽癌CNE-2細胞放射抗拒株CNE-2R[9-10]作為成熟的放射抗拒模型進行研究，通過體內(nèi)外實驗反映生脈注射液對鼻咽癌的放射增敏作用，并對其增敏作用機制進行初步探討。

1 材料

1.1 細胞

人低分化鼻咽癌細胞株CNE-2（中山大學腫瘤防治中心惠贈）。人鼻咽癌放射抗拒株細胞系CNE-2R由本課題組構(gòu)建。

1.2 SPF級BALB/C-nu裸鼠

4-5周齡，雄性，體重15±3 g，于廣東省醫(yī)學實驗動物中心購入，許可證號：SCXK（粵）2013-0002。動物實驗開展已通過南方醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準，批號L2018057。

1.3 藥物

生脈注射液（江蘇蘇中藥業(yè)集團股份有限公司，批準文號：國藥準字Z20053993），細胞給藥濃度計算采用有效成分的總質(zhì)量濃度（ug·mL-1）；動物實驗給藥濃度按照人和動物體表面積比值表計算出裸鼠等效劑量，并分別以成人正常劑量及其3倍設(shè)2個濃度，即低劑量（1.83 g·kg-1）與高劑量（5.49 g·kg-1）。姜黃素對照品（中國曼斯特公司）。

1.4 試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清（美國Gibco公司）；胰酶（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；MTT（Sigma公司）；STAT3、p-STAT3、GAPDH單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology（CST）公司）；二抗（美國Earthox公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天試劑有限公司）；ECL發(fā)光液（美國Millipore公司）；DAB試劑盒（英國Vision公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

細胞貼壁生長，在37℃、5%CO2、飽和濕度孵育條件下，CNE-2R細胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1 640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。細胞生長到培養(yǎng)瓶70%-80%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

2.2 MTT法檢測細胞生長

取CNE-2R對數(shù)生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細胞濃度為5.0×107·L-1，以每孔100μL種植于96孔板，每組細胞設(shè)6個平行對照孔。按濃度梯度（0、50、100、150、200、250、300、350、400μg/ml）給予生脈注射液。給藥24/48 h后，加5 g·L-1MTT溶液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去液體，再加入100μL DMSO，振搖10 min。M550酶標儀在490 nm波長下測量每孔的吸光度。根據(jù)不同細胞吸光度的均值作出細胞生長曲線。實驗重復3次。

2.3 克隆形成實驗

取CNE-2R細胞種板后，分別處理孵育48 h后照射（8、6、4、2、0 Gy），換液后繼續(xù)培養(yǎng)。10-14天后棄去培養(yǎng)液，PBS溶液清洗2次，加入2 mL甲醇，固定30 min，PBS溶液清洗2次，每孔加入2 mL 0.1%的吉姆薩染液染色30 min。蒸餾水洗凈晾干，計數(shù)所形成的集落數(shù)（≥50個細胞數(shù)為有效集落），得出集落形成率（PE），根據(jù)下列公式計算不同劑量照射下的存活分數(shù)（SF），并在GraphPad Prism軟件中運用單擊多靶模型模型擬合，計算相關(guān)放射增敏參數(shù)值。實驗重復3次。

存活分數(shù)（SF）=實驗組集落形成率/對照組集落形成率；

集落形成率（PE）=形成集落數(shù)/種植細胞數(shù)。

2.4 模型建立、分組及給藥

42只BALB/C-nu裸鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后隨機分為7組，即空白組（A組），生脈注射液低劑量組（B組），生脈注射液高劑量組（C組），生脈注射液低劑量聯(lián)合照射組（D組），生脈注射液高劑量聯(lián)合照射組（E組），照射組（F組），姜黃素聯(lián)合照射組（G組，經(jīng)本課題組前期研究證明姜黃素對鼻咽癌有放射增敏作用，設(shè)為陽性對照組），每組6只。分別將收集好的對數(shù)生長期CNE-2R細胞株，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至5×106個/mL，按相應(yīng)分組接種0.2 mL腫瘤細胞于裸鼠右大腿皮下。接種后14 d成瘤，第16天開始，各組裸鼠分別給予相關(guān)藥物干預。A、F組生理鹽水腹腔注射（與生脈注射液低劑量組同體積）；B、C、D、E組裸鼠進行生脈注射液腹腔注射；G組用姜黃素灌胃，每組一天一次藥物干預。1周后另給予D、E、F、G組X射線照射（照射劑量4 Gy），隔天1次，連續(xù)3次。

2.5 移植瘤體積、抑瘤率

隔天測量皮下移植瘤的最大長徑（a）和橫徑（b），計算移植瘤體積V（V=ab2·2-1）。處死動物后無菌剝離瘤體稱重，并計算腫瘤體積抑制率和抑瘤率。瘤體體積抑制率=（1-實驗組平均瘤體積/空白組平均瘤體積）×100%，抑瘤率=（1-實驗組平均瘤質(zhì)量/空白組平均瘤質(zhì)量）×100%。

2.6 裸鼠腫瘤組織的HE染色

取處理完成后的各組裸鼠腫瘤于10%甲醛中固定，洗滌脫水后浸蠟包埋制備病理切片，蘇木素和伊紅染色染色后封片，于200倍光鏡下觀察各組裸鼠腫瘤組織形態(tài)學改變。

2.7 蛋白檢測蛋白免疫印跡法

提取總蛋白，采用BCA法定量蛋白濃度，灌制10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，滴加一抗（1∶1 000），4℃過夜，二抗室溫孵育（1∶5 000）1 h，曝光顯示蛋白表達情況。以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)測定條帶灰度值。實驗重復3次。

圖1 不同濃度生脈注射液對CNE-2R細胞生長的影響

表1 相關(guān)放射生物學參數(shù)

2.8 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。裸鼠腫瘤體積采用重復測量的方差分析，處死裸鼠后的腫瘤質(zhì)量比較、免疫印跡等結(jié)果采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊時采用LSD法，不齊采用DunnettT3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 ∶生脈注射液對鼻咽癌CNE-2細胞抗拒株的抑制作用

給藥24 h及48 h，都在濃度約50 ug·mL-1之后，隨著生脈注射液濃度的增加，其對CNE-2R細胞的抑制作用明顯增加，而給藥48 h時，則表現(xiàn)出更為明顯的抑制趨勢。可見生脈注射液對鼻咽癌CNE-2細胞抗拒株的抑制作用呈一定的時間、劑量相關(guān)性。在后續(xù)實驗中，本文選擇對鼻咽癌CNE-2細胞抗拒株無明顯生長抑制作用時的最大用藥濃度（50 ug·/mL-1）作用48 h。見圖1

3.2 生脈注射液對鼻咽癌CNE-2細胞抗拒株放射敏感性的影響

克隆形成實驗結(jié)果采用單擊多靶模型擬合細胞存活曲線，見圖2，計算出相關(guān)放射生物學參數(shù)D0、N、SF2及放射增敏比等，見表1。與單純放射治療組相比，生脈注射液聯(lián)合照射組的D0、N、SF2值均減小，提示用藥后細胞抗拒性降低。隨著照射劑量的增大，細胞存活分數(shù)有較大幅度的降低，放射增敏比為1.484，表明用藥后，細胞放射敏感性增加。

3.2.1 裸鼠移植瘤模型建立情況

42只裸鼠接種CNE-2R細胞懸液后，10天成功出瘤，至第14天被接種裸鼠均出現(xiàn)直徑為5 mm左右的移植瘤，動物移植瘤模型建立成功。各組移植瘤生長不一，大小不等，裸鼠無明顯異常。

3.2.2 生脈注射液對裸鼠移植瘤體積和重量變化的影響

與空白組比較，其余各組的腫瘤體積、瘤質(zhì)量均受一定程度的抑制，其中生脈注射液低、高劑量組抑瘤率分別為14.46%、13.21%，抑瘤率較低，提示單用生脈注射液有一定抗腫瘤作用但不明顯；與單純照射組（27.14%）相比，生脈注射液低劑量聯(lián)合照射組（26.96%）抑瘤率無明顯差異，而生脈注射液高劑量聯(lián)合照射組體積抑制率（44.96%）及抑瘤率（37.86%）明顯升高，腫瘤對放射治療敏感性增加。見圖3，表2。

3.3 裸鼠腫瘤組織HE染色結(jié)果

圖2 克隆形成結(jié)果示意圖

表2 各組處理對人鼻咽癌放射抗拒株細胞CNE-2R裸鼠移植瘤體積以及瘤重的影響（n=6）

圖3 各組裸鼠移植瘤組織（n=6）

圖4 各組裸鼠移植瘤組織HE染色結(jié)果（200X）

可見未經(jīng)處理的空白組（圖4A）的腫瘤生長良好，血管豐富，無明顯壞死，細胞核形態(tài)大且明顯，邊緣清晰，細胞膜完整，提示造模成功；單獨照射組（圖4B）的腫瘤經(jīng)照射后可見血管減少，部分細胞腔內(nèi)有空泡形成，細胞核邊緣模糊，核質(zhì)固縮；低劑量中藥聯(lián)合照射（圖4C）后，血管減少，細胞變性明顯加重，細胞核密度降低，空泡增加；高劑量聯(lián)合照射（圖4D）后可見瘤體組織成片壞死，可見藥物可誘導裸鼠腫瘤細胞壞死并呈現(xiàn)一定劑量依賴性。

3.4 生脈注射液對裸鼠移植瘤STAT3、p-STAT3表達的影響

各組腫瘤組織中STAT3、p-STAT3表達具有顯著差異。其中與空白組相比，單獨照射后腫瘤組織中的STAT3顯著上調(diào)，藥物聯(lián)合照射后STAT3均下調(diào)，以高劑量聯(lián)合照射組下調(diào)最為顯著。而與單獨照射組比較，用藥后各組中p-STAT3表達顯著下調(diào)，其中具有顯著抑瘤作用的生脈注射液高劑量聯(lián)合照射組中的STAT3、p-STAT3表達均顯著下調(diào)。提示了STAT3可能參與了生脈注射液在鼻咽癌中的放射增敏過程。見圖5。

4 討論

鼻咽癌患者在接受放療過程中，存在放射抗拒或者敏感性降低的現(xiàn)象，放射增敏劑的使用提高了臨床療效。近年來，傳統(tǒng)中醫(yī)藥開始被越來越多的應(yīng)用于放療增敏中，從中醫(yī)角度分析，放療后往往會因內(nèi)損臟腑，傷陰耗氣而形成了以氣耗陰傷證為主的證型[11]，因此，在放療過程中，需要對患者進行“養(yǎng)陰益氣”的對癥治療。生脈注射液主要成分為紅參、麥冬、五味子三味中藥中提取的有效成分，如人參皂苷、五味子乙素、五味子醇甲等，具有益氣復脈、養(yǎng)陰生津的功效，對于放療后處于氣耗陰傷的患者在臨床上取得了良好的增效減毒療效。有學者發(fā)現(xiàn)生脈注射液化療增敏作用顯著，其聯(lián)合不同化療藥物對多種腫瘤細胞均有明顯的增敏作用[12]，李晴等發(fā)現(xiàn)生脈散合增液湯加減聯(lián)合放療較單純放療能夠更好地穩(wěn)定鼻咽癌瘤體，提高NPC患者KPS評分、緩解臨床癥狀，且有效減輕放療毒副反應(yīng)[13]。還有研究表明其有效成分人參皂苷Rg3在多種癌癥中也具有放射增敏作用,如結(jié)腸癌[14]，非小細胞肺癌[15]和食道癌[16]等。此外人參皂苷Rg3被證實可在鼻咽癌、局限期小細胞肺癌等癌種中通過抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等與血管生成相關(guān)因子的表達水平從而抑制腫瘤血管生成，增強放療敏感性[17-18]。

圖5 生脈注射液對各組裸鼠移植瘤STAT3、p-STAT3蛋白表達的影響

STAT3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子STAT蛋白家族的重要成員。STAT3可以在許多信號通路中被磷酸化激活，是多種細胞信號轉(zhuǎn)導通路的匯聚點，是腫瘤細胞生長、增殖、血管生成和侵襲等過程中重要的參與者,其表達與激活失調(diào)和多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[19]。近年來，人們發(fā)現(xiàn)STAT3的過表達與腫瘤放射抗拒相關(guān)，通過抑制STAT3的表達與活化能夠增強放射敏感性[20-21]。Gao等人發(fā)現(xiàn)檸檬苦素可以通過抑制Stat3轉(zhuǎn)錄活性來降低NPC細胞的干性，從而提高鼻咽癌放射敏感性[22]。進一步研究表明，抑制STAT3自身表達和活化可誘導與STAT3相關(guān)的腫瘤細胞凋亡、抑制細胞增殖及阻斷腫瘤血管生成。其中STAT3可直接或間接促進VEGF表達從而促進血管新生，導致放射抗拒[23]。

在本研究中，我們選用了鼻咽癌CNE-2細胞抗拒株作為放射抗拒模型進行研究，通過體內(nèi)外實驗驗證了生脈注射液對鼻咽癌的放射增敏作用。為進一步探討其作用機制，我們將裸鼠移植瘤組織切片進行HE染色觀察，發(fā)現(xiàn)照射及藥物聯(lián)合照射后，組織內(nèi)血管減少，腫瘤細胞呈逐步壞死變性改變，具有高抑瘤率的高劑量聯(lián)合照射組中可見瘤體組織成片壞死并未見明顯血管，提示生脈注射液可能抑制瘤體內(nèi)的血管生成。進一步檢測STAT3、p-STAT3蛋白在各組腫瘤組織中表達，與空白組相比，單獨照射后腫瘤組織中的STAT3顯著上調(diào)，藥物聯(lián)合照射后STAT3均下調(diào)，以高劑量聯(lián)合照射組下調(diào)最為顯著。而與單獨照射組比較，用藥后各組中p-STAT3表達顯著下調(diào)，其中具有顯著抑瘤作用的生脈注射液高劑量聯(lián)合照射組中的STAT3、p-STAT3表達均顯著下調(diào)。提示生脈注射液對人鼻咽癌裸鼠移植瘤放射增敏作用可能與抑制STAT3的表達和活化相關(guān)。因此我們推測，生脈注射液可能通過抑制STAT3的表達和活化，阻斷STAT3信號通路活化進而阻斷了血管生成相關(guān)因子的表達，如VEGF等，從而提高了放射敏感性，提高患者治療療效。或許這將會是我們繼續(xù)探索鼻咽癌放射抗拒以及生脈注射液對鼻咽癌放射增敏分子機制新的研究方向。