液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定水產(chǎn)品中阿維菌素、伊維菌素及四種三苯甲烷類殘留

袁斯甜，伍華雯，羅秋紅，黃海軍，吉麗華，占春瑞

（南昌海關(guān)技術(shù)中心，江西 南昌 330002）

阿維菌素（AVM）和伊維菌素（IVM）屬于阿維菌素類藥物（AVMs），是一種高效、廣譜的大環(huán)內(nèi)酯類殺蟲藥物；孔雀石綠（MG）、結(jié)晶紫（CV）及其代謝物（隱性孔雀石綠LMG和隱性結(jié)晶紫LCV）是一種三苯甲烷類化合物，既是染料，也是一種抗菌、殺寄生蟲的藥物。兩類藥物價(jià)格低廉、用量少，并且具有很好的殺菌效果，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)疾病防控[1]。研究表明：AVMs用作獸藥，代謝的藥物主要通過糞便以原型排出，嚴(yán)重污染水體，未代謝的藥物殘留在水產(chǎn)品中對水生生物以及人類帶來潛在的危害；另外三苯甲烷類化合物是一種致癌物質(zhì)，在水生物體內(nèi)殘留時(shí)間可達(dá)100 d以上，通過食物鏈對人類身體造成嚴(yán)重傷害，具有致畸、致癌等危害，我國將MG、CV也列入獸藥禁用藥清單[2]。為保障水產(chǎn)品質(zhì)量以及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，需嚴(yán)格監(jiān)控水產(chǎn)品中AVMs和三苯甲烷類殘留。

目前有關(guān)檢測AVM和IVM的方法多采用液相色譜-熒光法[3-8]，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-13]；孔雀石綠及其代謝物多采用液相色譜法[14-18]，液相色譜熒光法[19-21]，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[22-26]。目前AVMs殘留檢測方法大都建立在動(dòng)物源性食品，而在水產(chǎn)品中研究報(bào)道甚少，并且同時(shí)測定水產(chǎn)品中阿維菌素、伊維菌素及四種三苯甲烷類殘留的方法尚未報(bào)道過。對于目前水產(chǎn)品中AVMs和四種三苯甲烷類藥物殘留，采用的是分類檢測，利用不同的檢測方法和前處理進(jìn)行分類檢測，不僅耗時(shí)耗力、成本高，并且很難滿足大批量樣品檢測要求。因此，發(fā)展同時(shí)測定水產(chǎn)品中多獸藥殘留的方法已成為迫切需求。

該文基于固相萃取技術(shù)，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立了同時(shí)測定水產(chǎn)品中阿維菌素、伊維菌素及四種三苯甲烷類殘留的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

4000Qtrap液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀（AB Sciex公司）；Sartorious電子天平（精度 0.01 mg和 0.01 g）；SI G560E型旋渦混勻器；Eppendorf 5430R冷凍高速離心機(jī)；N-EVAP112氮吹濃縮儀；Visiperp DL固相萃取裝置；Alumina－N固相萃取小柱（1 g/3 mL）；有機(jī)系微孔濾膜0.2 μm。

阿維菌素、伊維菌素、孔雀石綠、隱性孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱性結(jié)晶紫六種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和兩種氘代內(nèi)標(biāo)（MG－D5和LMG－D6）的純度均不低于98%。

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：1 000 mg/L，分別稱取適量的上述六種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和兩種氘代內(nèi)標(biāo)于10 mL容量瓶，用乙腈溶解并稀釋至刻度，-18℃保存于棕色玻璃瓶中。使用前用乙腈稀釋成合適濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液和混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液。

甲醇、乙腈、乙酸、無水乙酸銨均為HPLC純；試驗(yàn)用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。

5 mmol/L乙酸銨緩沖溶液（含0.1%乙酸）：稱取0.385 g無水乙酸銨溶解于900 mL水中，加入1 mL乙酸，用水定容至1 000 mL。

1.2 儀器檢測條件

1.2.1 色譜條件 Waters C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm），柱溫 30 ℃；進(jìn)樣量 10 μL；四種三苯甲烷類流動(dòng)相A為乙腈，B為5 mmol/L乙酸銨緩沖溶液，梯度洗脫程序?yàn)?～2.5 min，A由70%升至95%；2.5～7.0 min，A 保持 95%；7.0～7.1 min，A 由95%降至70%；7.1～15 min，A保持70%。AVMs流動(dòng)相A為乙腈，B為水，其等度洗脫程序?yàn)?～5 min，A為95%。

1.2.2 質(zhì)譜條件 四種三苯甲烷類為ESI正離子模式掃描（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，霧化氣壓力（GAS1）：45 psi，輔助氣壓力（GAS2）：55 psi，氣簾氣壓力（CUR）：10 psi，電噴霧壓力（IS）：5500 V；AVMs為APCI負(fù)離子模式掃描（APCI-），多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，霧化氣壓力（GAS1）：40 psi，輔助氣壓力（GAS2）：12 psi，氣簾氣壓力（CUR）：13 psi，電噴霧壓力（IS）：-4 500 V。

其他質(zhì)譜參數(shù)見表1，其中帶*為定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

1.3 樣品前處理

取約500 g水產(chǎn)品肌肉組織，用高速勻漿機(jī)勻漿，制成魚糜樣品。

1.3.1 提取 稱取5.00 g魚糜樣品置于50 mL具塞塑料離心管中，加入40 ng孔雀石綠、隱性孔雀石綠混合內(nèi)標(biāo)，加入乙腈11 mL，渦旋混勻，均質(zhì)提取30 s，4200 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中。另取一套離心管加入11 mL乙腈，洗滌均質(zhì)刀頭，洗滌液提取殘?jiān)淮?，渦旋超聲5 min，4200 r/min離心5 min，合并提取液，用乙腈定容至25mL，搖勻備用。

1.3.2 凈化 移取上述5 mL提取液加入中性氧化鋁柱（預(yù)先用5 mL乙腈活化）中，用5 mL乙腈進(jìn)行洗脫，上樣即接收。收集液于40℃下氮吹至干，加入1 mL乙腈－5 mmol/L乙酸銨緩沖溶液（1+1），渦勻后過濾膜，進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

在魚糜陰性樣品中添加阿維菌素、伊維菌素及四種三苯甲烷類六種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。4.0 μg/kg AVMs色譜圖見圖1；0.5 μg/kg四種三苯甲烷類色譜圖見圖2。所有待測目標(biāo)組分均能獲得最佳色譜分離效果且峰型尖銳，表明該方法能夠有效的分離水產(chǎn)品中AVMs和四種三苯甲烷類殘留，建立了水產(chǎn)品多藥殘同時(shí)檢測的簡便方法，為日常檢測節(jié)約成本，并且有效縮短檢測時(shí)間。

圖 1 4.0 μg/kg AVMs色譜圖

圖2 0.5 μg/kg四種三苯甲烷類色譜圖

2.2 提取試劑的選擇

綜合考慮AVMs和四種三苯甲烷類結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，均易溶于有機(jī)試劑。試驗(yàn)常用的有機(jī)試劑有乙腈、甲醇、乙酸乙酯和二氯甲烷等。因此，該試驗(yàn)分別采用這四種試劑對添加AVMs和四種三苯甲烷類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的魚糜樣品進(jìn)行提取。結(jié)果表明：乙酸乙酯和二氯甲烷對樣品中的目標(biāo)物提取率低；甲醇和乙腈對四種三苯甲烷類提取效果好且無明顯差異，而對于AVMs，乙腈提取效果更好。相對乙腈，甲醇極性強(qiáng)更易將樣品基質(zhì)中的極性雜質(zhì)提取出來。因此，本試驗(yàn)選擇乙腈作為提取試劑，能有效提取六種目標(biāo)物并去除雜質(zhì)的干擾。

2.3 凈化方式的選擇

該試驗(yàn)選擇中性氧化鋁固相萃取柱，其能有效地適用于芳香烴以及酸堿溶液中不穩(wěn)定的含酯化合物的分離，其試驗(yàn)結(jié)果表明：采用中性氧化鋁固相萃取柱，添加回收高，且對提取液中油脂和雜質(zhì)成分也有很好的凈化效果。另外，該試驗(yàn)采用5 mL乙腈洗脫，可將固相萃取柱中殘留的目標(biāo)物完全洗脫下來，防止過量的洗脫液將吸附的雜質(zhì)洗脫下來。

2.4 流動(dòng)相的選擇

從待測組分的分離效果和離子化效率選擇流動(dòng)相。對于四種三苯甲烷類，采用的是ESI正離子模式掃描，流動(dòng)相直接選用樣品上機(jī)的定溶液，即乙腈和5 mmol/L乙酸銨緩沖溶液，由于這四種三苯甲烷類具有弱堿性，試驗(yàn)表明流動(dòng)相中加入適量的乙酸和低濃度的揮發(fā)性緩沖鹽可提高待測組分的離子化效率，待測組分得到了很好的色譜分離效果且峰性尖銳。AVMs采用的APCI負(fù)離子模式掃描，乙酸銨-0.1%乙酸體系呈弱酸性抑制AVMs離子化效率，采用乙腈和水流動(dòng)相，5min等度洗脫程序即可將AVM和IVM有效的分離。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

考慮實(shí)際樣品測定，可能存在基質(zhì)效應(yīng)的影響。試驗(yàn)分別采取純試劑和陰性基質(zhì)樣品提取液配制相同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在相同儀器條件下測定目標(biāo)物的響應(yīng)值并進(jìn)行比較。試驗(yàn)結(jié)果表明：純試劑配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的響應(yīng)值和陰性基質(zhì)提取液配制的響應(yīng)值無明顯差異，故試驗(yàn)選擇純試劑配制混合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

采用純試劑配制成質(zhì)量濃度為0.25/2.0、0.5/4.0、1.0/8.0、2.0/16、4.0/32 和 10/80 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定，AVMs采用外標(biāo)法，在2.0～80 μg/L質(zhì)量濃度范圍呈線性，檢出限為4.0 μg/kg；四種三苯甲烷類采用內(nèi)標(biāo)法，在0.25～10 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)，檢出限為0.5 μg/kg。其六種目標(biāo)待測物線性參數(shù)和檢出限見表2。

2.6 精密度與回收試驗(yàn)

分別在魚糜陰性樣品中添加3個(gè)濃度水平的AVMs和四種三苯甲烷類六種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按實(shí)驗(yàn)方法和儀器條件進(jìn)行測定，分別計(jì)算六種目標(biāo)物的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=6），結(jié)果見表3。六種目標(biāo)物的平均回收率為89.8%～113%，RSD為1.4%～10%，表明該試驗(yàn)方法的回收率和重現(xiàn)性好。

表2 線性參數(shù)和檢出限

表3 加標(biāo)回收率和精密度（n=6）

3 結(jié)論

該文建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測定水產(chǎn)品中阿維菌素、伊維菌素及四種三苯甲烷類藥物殘留。從試驗(yàn)結(jié)果來看，準(zhǔn)確性、靈敏度、精密度和檢出限均滿足獸藥殘留檢測要求，從而說明同時(shí)測定水產(chǎn)品中AVMs和四種三苯甲烷類殘留的方法是有效可行的，并且本方法大大減少日常檢測時(shí)間與成本，為日常水產(chǎn)品中多獸藥殘留分析提供有利檢測手段。