三七總皂苷對脊髓損傷大鼠神經(jīng)元凋亡及Nrf2、caspase-3表達的影響

謝慕可 許念茹 黃賢勝

摘要 目的：探究三七總皂苷（TSPN）對脊髓損傷（SCI）大鼠神經(jīng)元凋亡及Nrf2、Caspase-3表達的影響。方法：采用“自制擊打器”建立SCI大鼠模型，將成功構(gòu)建的100只SCI大鼠隨機分為對照組、模型組、陽性對照組及實驗組，每組25只。陽性對照組與實驗組分別腹腔注射甲基強的松龍[30 mg/（kg·d）]與TSPN[100 mg/（kg·d）]，對照組與模型組則腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)干預(yù)14 d。采用HE染色與TUNEL法檢測大鼠脊髓組織病理學(xué)變化與神經(jīng)元凋亡;采用免疫組化法及Wb法檢測脊髓組織Nrf2、Caspase-3蛋白表達。結(jié)果：與對照組比較，模型組大鼠脊髓組織Nrf2蛋白表達顯著降低，且陽性對照組與實驗組高于模型組，陽性對照組高于實驗組;神經(jīng)元凋亡率及Caspase-3蛋白表達升高，且陽性對照組與實驗組低于模型組，陽性對照組低于實驗組（均P<0.05）。結(jié)論：TSPN可減輕SCI大鼠脊髓組織病變程度，保護神經(jīng)元，其作用機制可能與下調(diào)脊髓組織Caspase-3蛋白表達，上調(diào)Nrf2蛋白表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞 脊髓損傷;三七總皂苷;神經(jīng)元凋亡;Nrf2;Caspase-3

Abstract Objective：To explore the effects of Panax notoginseng saponins（TSPN）on neuronal apoptosis and expression of Nrf2 and Caspase-3 in rats with spinal cord injury（SCI）.Methods：Rat models were established with the “self-made beater” and 100 successfully constructed SCI rats were randomly divided into a control group，a model group，a positive control group，and a test group，with 25 rats in each group.Positive control group and the test group were given methylprednisolone[30 mg/（kg·d）]and TSPN[100 mg/（kg·d）]by intraperitoneal injection respectively; the control group and the model group were given the same amount of normal saline for 14 d.HE staining and TUNEL method were used to detect the histopathological changes and neuronal apoptosis of rat spinal cord tissue; the protein expression of Nrf2 and Caspase-3 in the spinal cord tissues were detected by immunohistochemistry and Wb method.Results：Compared with the control group，the expression of Nrf2 protein in the spinal cord tissues of rats in the model group significantly decreased，and the positive control group and the test group were higher than the model group，and the positive control group was higher than the test group; and the neuronal apoptosis rate and Caspase-3 protein expression significantly increased，and the positive control group and the test group were lower than the model group，and the positive control group was lower than the test group（all P<0.05）.Conclusion：TSPN can alleviate the degree of spinal cord tissue lesions in SCI rats and protect neurons，and the mechanisms may be related to down-regulation of Caspase-3 protein expression and up-regulation of Nrf2 protein expression in spinal cord tissues.

Keywords Spinal cord injury; Panax notoginseng saponins; Neuronal apoptosis; Nrf2; Caspase-3

脊髓損傷（Spinal Cord Injury，SCI）包括原發(fā)性和繼發(fā)性損傷，具有較高的致殘率，同時由于目前對其發(fā)病機制尚未完全了解，所以仍缺乏有效治療藥物[1]。三七總皂苷（TSPN）是三七的主要活性成分，具有抗炎、抗菌及抗氧化等多種藥理功效，近年來，其在神經(jīng)保護方面的研究成為熱點。研究發(fā)現(xiàn)，TSPN可促進全腦缺血后大鼠腦室下區(qū)（SVZ）神經(jīng)再生，加速SVZ區(qū)神經(jīng)祖細胞增殖和分化，促進星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化新生未成熟神經(jīng)元[2]。也有研究報道，黃芪甲苷和TSPN配伍可抑制小鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞的凋亡，發(fā)揮保護神經(jīng)細胞的作用[3]。目前TSPN在SCI方向的研究尚少，因此開展本研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級、雄性SD大鼠，6～7周齡，體質(zhì)量200～250 g，購于中山大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2016-0029。飼養(yǎng)環(huán)境和條件：飼養(yǎng)于中山大學(xué)實驗動物中心屏障環(huán)境動物實驗室，每籠5只，溫度（25±2）℃，濕度（55±2）%，光照明暗時間比為12 h/12 h，自由獲取食物和水。

1.1.2 藥物 TSPN（四川成都麥卡希化工有限公司，生產(chǎn)批號：12052901，純度≥98%）。

1.1.3 試劑與儀器 甲基強的松龍注射液（大連輝瑞制藥有限公司，生產(chǎn)批號：NE0242）;TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記（TUNEL）檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，生產(chǎn)批號：180804）;免疫組化試劑盒（PV系列）、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號：170910和1170403）;兔抗鼠核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）抗體（美國Bio-world公司，生產(chǎn)批號：HM0703）;兔抗鼠天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）多克隆抗體（美國Santa Cruz公司，生產(chǎn)批號：HS0608）等。RM2235型石蠟切片機（德國Leica公司，型號：GSW-0021）;DM 750型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司，型號：JMWD-03）;ELX-800酶標儀（美國BIO-TEK公司，型號：KYLS-216）;JY-SCZ2180型垂直電泳槽（西安賽維斯生物科技有限公司，型號：KDY-C23）;Image J圖像分析軟件（美國NIH公司，型號：BYS-SS161）等。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物模型制備[4]與分組 將100只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、陽性對照組及實驗組，每組25只。模型組、陽性對照組及實驗組均采用“自制擊打器”建立大鼠SCI模型，即10%水合氯醛（4 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，摸肋骨定位T10為中心，作長約5 cm的縱行切口，開棘突兩側(cè)豎脊肌，暴露T10棘突及椎板，小咬骨鉗咬除T10棘突及棘間韌帶，咬除黃韌帶及椎板，暴露T10段脊髓硬膜，剪開硬膜，暴露脊髓，采用“自制擊打器”擊打該段脊髓，擊打后重物壓迫脊髓2 min，建立SCI大鼠損傷模型。術(shù)中顯微鏡下直視受擊打段脊髓若出現(xiàn)明顯斷端，且大鼠脊髓受擊打時出現(xiàn)尾部痙攣性擺動，說明造模成功。

1.2.2 干預(yù)方法 陽性對照組大鼠腹腔注射甲基強的松龍[30 mg/（kg·d）]，實驗組大鼠腹腔注射TSPN[100 mg/（kg·d）]，對照組與模型組則腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)干預(yù)14 d。

1.2.3 蘇木精-伊紅（HE）[5]染色觀察大鼠脊髓組織病理學(xué)變化 干預(yù)結(jié)束后，頸椎脫臼法處死各組大鼠，收集脊髓組織標本。以傷處為中心取1.5 cm脊髓組織，10%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、包埋、切片等連續(xù)制作病理切片，進行常規(guī)HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠脊髓組織病理學(xué)變化。

1.2.4 TUNEL法[6]檢測神經(jīng)元凋亡情況 脊髓組織采集與病理切片制作同1.2.3。切片加入1% Triton X-100通透液，室溫促滲5 min;3%過氧化氫封閉，滴加末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）反應(yīng)液，37 ℃避光反應(yīng)1 h;加Streptavidin-HRP 37 ℃避光反應(yīng)30 min;DAB顯色，復(fù)染，觀察神經(jīng)元凋亡情況。胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡細胞。每張切片隨機選取4個視野，光學(xué)顯微鏡下計數(shù)每個視野中陽性細胞占總細胞的比例，取平均值。凋亡率=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.5 免疫組化法[7]檢測脊髓組織中Nrf2、Caspase-3蛋白的表達情況 取脊髓組織病理切片，免疫組化實驗步驟按照試劑盒說明操作。一抗為兔抗鼠Nrf2抗體（1∶100）、兔抗鼠Caspase-3抗體（1∶100），4 ℃過夜;37 ℃復(fù)溫1 h，滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG工作液，37 ℃孵育30 min;DAB顯色，中性樹膠封片。以細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色沉淀物為陽性表達，每張切片隨機選擇5個視野，光學(xué)顯微鏡下觀察并計數(shù)其陽性細胞數(shù)，求平均值。陽性細胞百分比=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.6 蛋白免疫印跡（Wb）法[8]檢測脊髓組織中Nrf2、Caspase-3蛋白的表達水平 取液氮中保存的脊髓組織，用勻漿機進行勻漿，加入一定量的蛋白裂解液，以12 000 r/min離心5 min，吸取上清液，對所提蛋白進行定量，進行垂直電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印，一抗4 ℃孵育過夜、隔日滴加二抗孵育20 min，顯影，拍照。以β-actin為內(nèi)參照，采用Image J圖像分析軟件進行灰度值分析，并計算蛋白相對表達量。目的蛋白相對表達量=目標蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，符合正態(tài)分布時，2組之間比較采用Dunnett′s t檢驗;不符合正態(tài)分布時，采用秩和檢驗分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠脊髓組織病理學(xué)變化 HE染色顯示，對照組大鼠脊髓組織形態(tài)正常，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)規(guī)則;模型組大鼠脊髓組織破壞嚴重，白質(zhì)松散不規(guī)則，神經(jīng)元腫脹壞死，并出現(xiàn)炎性反應(yīng)細胞浸潤;陽性對照組和實驗組大鼠較模型組損傷輕，神經(jīng)元形態(tài)較完整，炎性細胞浸潤少，膠質(zhì)增生減輕，且陽性對照組病理程度改善優(yōu)于實驗組。見圖1。

2.2 各組大鼠神經(jīng)元凋亡情況 對照組、模型組、陽性對照組及實驗組大鼠神經(jīng)元凋亡率分別為（6.52±3.41）%、（63.11±8.35）%、（21.06±6.24）%、（29.22±5.63）%。與對照組比較，模型組大鼠神經(jīng)元凋亡率顯著升高;與模型組比較，陽性對照組及實驗組神經(jīng)元凋亡率顯著降低，且陽性對照組低于實驗組（P<0.05）。見圖2。

2.3 各組大鼠脊髓組織中Nrf2、Caspase-3蛋白的表達情況 對照組、模型組、陽性對照組及實驗組大鼠脊髓中Nrf2蛋白陽性細胞百分比分別為（83.46±6.25）%、（12.52±2.37）%、（56.22±4.96）%、（34.73±4.11）%;Caspase-3蛋白陽性細胞百分比分別為（15.63±2.81）%、（86.87±5.79）%、（38.65±4.54）%、（59.83±3.46）%。與對照組比較，模型組大鼠脊髓組織中Nrf2蛋白陽性細胞百分比顯著降低，Caspase-3蛋白陽性細胞百分比顯著升高;與模型組比較，陽性對照組及實驗組大鼠脊髓中Nrf2蛋白陽性細胞百分比顯著升高，且陽性對照組高于實驗組，Caspase-3蛋白陽性細胞百分比顯著降低，且陽性對照組低于實驗組（P<0.05）。見圖3。

2.4 各組大鼠脊髓組織中Nrf2、Caspase-3蛋白的表達水平 對照組、模型組、陽性對照組及實驗組大鼠脊髓中Nrf2蛋白相對表達量分別為（0.94±0.04）、（0.12±0.01）、（0.43±0.09）、（0.31±0.12）;Caspase-3蛋白相對表達量分別為（0.16±0.03）、（0.96±0.03）、（0.47±0.07）、（0.59±0.05）。與對照組比較，模型組大鼠脊髓組織中Nrf2蛋白相對表達量顯著降低，Caspase-3蛋白相對表達量顯著升高;與模型組比較，陽性對照組及實驗組大鼠脊髓中Nrf2蛋白相對表達量顯著升高，且陽性對照組高于實驗組，Caspase-3蛋白相對表達量顯著降低，且陽性對照組低于實驗組（P<0.05）。見圖4。

3 討論

SCI是一種嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病，可導(dǎo)致相應(yīng)軀體運動和感覺功能喪失，造成損傷節(jié)段以下肢體嚴重的功能障礙，雖然目前其具體發(fā)病機制尚未完全闡明，但氧化應(yīng)激損傷與其密切相關(guān)[9]。SCI所致的偏癱、截癱或肢體痿軟等癥，其在中醫(yī)上歸屬于督脈受損，瘀血阻絡(luò)，加之患者元氣大傷且久臥傷氣，多見氣虛血瘀之證。TSPN是從三七中提取的多種皂苷活性物質(zhì)，具有活血祛瘀、通脈活絡(luò)等功效。研究證實，黃芪甲苷聯(lián)合TSPN可抑制小鼠腦缺血再灌注早期氧化應(yīng)激物質(zhì)的活性，進而減輕氧化應(yīng)激所致的腦組織中神經(jīng)損傷，進而保護神經(jīng)元細胞[10]。本研究結(jié)果顯示，實驗組大鼠神經(jīng)元細胞凋亡率顯著低于模型組，提示TSPN具有保護神經(jīng)元細胞的作用。

Nrf2是細胞內(nèi)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)的保護性轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2的激活可增強神經(jīng)元細胞對氧化應(yīng)激的抵抗能力，進而保護神經(jīng)功能[11]。Caspase-3是哺乳動物細胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶，是凋亡下游的關(guān)鍵執(zhí)行者，下調(diào)其表達，可抑制神經(jīng)元細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，TSPN對6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細胞損傷具有保護作用，其作用可能與激活Nrf2、上調(diào)HO-1表達、抑制氧化應(yīng)激和SH-SY5Y神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)[12]。研究顯示，TSPN可通過上調(diào)B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）和Bax陽性細胞和蛋白水平的比值，減少Caspase-3的活化而抑制全腦缺血后大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞凋亡[13]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，實驗組大鼠脊髓中Nrf2蛋白表達顯著升高，Caspase-3蛋白表達降低，提示TSPN可通過上調(diào)Nrf2的表達，下調(diào)Caspase-3的表達，降低神經(jīng)元細胞的氧化應(yīng)激損傷，抑制其凋亡，進而發(fā)揮保護神經(jīng)元細胞的作用，值得臨床推廣應(yīng)用。

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