超聲輔助提取澳洲堅果青皮總黃酮工藝優(yōu)化及抗氧化性能研究

張明 杜麗清 馬飛躍 帥希祥 涂行浩

摘? 要：以澳洲堅果青皮為原料，研究了超聲輔助提取總黃酮工藝條件以及抗氧化活性。通過L9（34）正交試驗得到超聲功率為300 W條件下的最佳提取工藝：提取時間為45 min、乙醇濃度為50%、提取溫度為50 ℃、料液比為1∶60 （g/mL），在此條件下總黃酮提取量為（1638.59±44.26） mg/100 g。通過抗氧化實驗發(fā)現(xiàn)，澳洲堅果青皮總黃酮ABTS自由清除能力約為Trolox的2.48倍，總抗氧化還原能力約為Trolox的1.90倍，由此表明澳洲堅果青皮總黃酮具有較強的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：澳洲堅果青皮;超聲輔助;總黃酮;抗氧化

中圖分類號：S664.9? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Macadamia Green Peel

ZHANG Ming， DU Liqing*， MA Feiyue， SHUAI Xixiang， TU Xinghao

South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences / Key Laboratory of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract： The study focused on the optimization of the ultrasonic-assisted extraction and antioxidant activity of total flavonoids from macadamia green peel. An orthogonal test with four factors and three level was carried out and the optimized conditions were： ultrasonic extraction time 45 min， ethanol content 40%， extraction temperature 50 ℃， solid-liquid ratio 1∶60 （g/mL）. The total flavonoids yield was up to （1638.43±44.26） mg/100g under the optimized conditions. The ABTS radical scavenging and total antioxidant capacity was about 2.48， 1.90 times of Trolox. The results indicated that the total flavonoids from macadamia green peel had strong antioxidant capacity.

Keywords： macadamia green peel; ultrasonic-assisted; total flavonoids; antioxidant

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.05.024

澳洲堅果（Macadamia tetraphylla L.）是一種廣泛生長于澳大利亞，具有較高價值的山龍眼科木質(zhì)堅果作物[1]。從引種試種至今，特別是經(jīng)過近幾年的快速發(fā)展，我國已成為澳洲堅果種植面積最大的國家。同時，澳洲堅果產(chǎn)量節(jié)節(jié)攀升，澳洲堅果加工品也逐漸增多。加工過程中占澳洲堅果（鮮果）重量1/2的青皮等加工副產(chǎn)物絕大部分被隨意丟棄，青皮腐敗后會導(dǎo)致當(dāng)?shù)厮?、土壤等的污染[2]。有研究報道[3-4]澳洲堅果青皮中含有豐富的酚類、黃酮類等活性物質(zhì)，且具有較強的抗氧化活性。如果將澳洲堅果青皮中的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行提取并加以綜合利用，不僅為開發(fā)天然抗氧化劑提供了原料，還有利于保護(hù)環(huán)境以及實現(xiàn)資源的最大化利用，也為延伸澳洲堅果加工產(chǎn)業(yè)鏈提供了有力支撐。

提取是活性物質(zhì)單體分離和鑒定的重要步驟。當(dāng)前，常見的植物活性物質(zhì)提取方法主要有傳統(tǒng)溶劑浸提法、微波輔助[5]、超聲輔助[6]、酶輔助[7]、亞臨界溶劑提取[8]、超臨界溶劑提取[9]等現(xiàn)代提取方法。超聲輔助提取以其設(shè)備簡單、提取效率高等優(yōu)點而廣受研究人員青睞，其已被廣泛應(yīng)用于植物活性物質(zhì)提取中，如橘皮[10]、芒果皮[11]等。但到目前為止，仍未見關(guān)于超聲輔助提取澳洲堅果青皮總黃酮的研究。因此，本研究將從乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間和超聲功率5個因素對超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并以水溶性維生素E（Trolox）為陽性對照，研究澳洲堅果青皮總黃酮對ABTS自由基清除能力和總抗氧化還原能力，以期為澳洲堅果加工副產(chǎn)物的高效利用提供借鑒。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 植物材料? 澳洲堅果青皮由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所種質(zhì)資源圃品名為‘南亞1號的澳洲堅果脫皮所得。澳洲堅果青皮經(jīng)清洗后自然晾干，粉碎過40目篩，篩下物即為實驗樣品，置于4 ℃冰箱備用。

1.1.2? 試劑與儀器? 蘆丁、水溶性維生素E（Trolox）、Fe3+-三吡啶三吖嗪（TPTZ）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、過二硫酸鉀，Sigma公司;無水乙醇、醋酸，天津富宇精細(xì)化工有限公司;氯化鋁，廣州化學(xué)試劑廠;六水氯化鐵，廣東光華科技股份有限公司;亞硝酸鈉，天津市福晨化學(xué)試劑廠;鹽酸、氫氧化鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

UTP-313 百分之一電子天平，上?；ǔ彪娖饔邢薰?ST40高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技（中國有限公司）;FZ-06高速藥材調(diào)料粉碎機(jī)，浙江溫嶺市百樂粉碎設(shè)備廠;UV2007型紫外可見分光光度計，島津企業(yè)管理（中國）有限公司;SK5210HP超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 澳洲堅果青皮總黃酮提取方法? 準(zhǔn)確稱取1.00 g澳洲堅果青皮樣品于100 mL離心管，加入一定體積乙醇溶液，在設(shè)定的料液比、提取溫度、提取時間和超聲功率條件下提取。提取結(jié)束后，于8000 r/min條件下離心15 min，取上清液并保存于4 ℃冰箱。

1.2.2? 提取方法對澳洲堅果青皮總黃酮提取的影響? （1）超聲輔助提取法。準(zhǔn)確稱取1.00 g澳洲堅果青皮樣品于100 mL離心管，加入40%乙醇溶液75 mL，并置于50 ℃水浴中，在超聲功率為300 W條件下提取60 min，提取結(jié)束后，8000 r/min 離心15 min，取上清液保存于4 ℃冰箱待測。

（2）傳統(tǒng)提取法。準(zhǔn)確稱取1.00 g澳洲堅果青皮樣品于100 mL離心管，加入40%乙醇溶液75 mL，并置于50 ℃水浴中提取60 min，提取結(jié)束后操作同超聲輔助提取法。

1.2.3? 單因素實驗設(shè)計? （1）乙醇濃度對超聲輔助提取澳洲堅果青皮總黃酮的影響。準(zhǔn)確稱取1.00 g澳洲堅果青皮樣品于100 mL離心管，按料液比為1∶75 （g/mL）分別加入濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，并置于50 ℃水浴中，在超聲功率為300 W條件下提取60 min。提取結(jié)束后操作同超聲輔助提取法。

（2）料液比對超聲輔助提取澳洲堅果青皮總黃酮的影響。準(zhǔn)確稱取1.00 g澳洲堅果青皮樣品于100 mL離心管，分別按料液比為1∶15、1∶30、1∶45、1∶60、1∶75、1∶90 （g/mL）加入濃度為40%的乙醇溶液，并置于50 ℃水浴中，在超聲功率為300 W條件下提取60 min。提取結(jié)束后操作同超聲輔助提取法。

（3）提取溫度對超聲輔助提取澳洲堅果青皮總黃酮的影響。準(zhǔn)確稱取1.00 g澳洲堅果青皮樣品于100 mL離心管，按料液比為1∶75 （g/mL）加入濃度為40%的乙醇溶液，并分別置于20、30、40、50、60、70 ℃水浴中，在超聲功率為300 W條件下提取60 min。提取結(jié)束后操作同超聲輔助提取法。

（4）提取時間對超聲輔助提取澳洲堅果青皮總黃酮的影響。準(zhǔn)確稱取1.00 g澳洲堅果青皮樣品于100 mL離心管，按料液比為1∶75 （g/mL）加入濃度為40%的乙醇溶液，并置于50 ℃水浴中，在超聲功率為300 W條件下分別提取15、30、45、60、75、90 min。提取結(jié)束后操作同超聲輔助提取法。

（5）超聲功率對超聲輔助提取澳洲堅果青皮總黃酮的影響。準(zhǔn)確稱取1.00 g澳洲堅果青皮樣品于100 mL離心管，按料液比為1∶75 （g/mL）加入濃度為40%的乙醇溶液，并置于50 ℃水浴中，分別在超聲功率為300、350、400、450、500 W條件下提取15 min。提取結(jié)束后操作同超聲輔助提取法。

1.2.4? 正交試驗設(shè)計? 在單因素實驗基礎(chǔ)上進(jìn)行L9（34）正交試驗，因素水平如表1所示。

1.2.5? 澳洲堅果青皮總黃酮提取量的測定[12]? （1）總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。準(zhǔn)確稱取一定蘆丁配置濃度為200 mg/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后取一定體積200 mg/L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋為10、50、100、150、200 mg/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液;取0.3 mL稀釋后的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL離心管，依次加入3.4 mL 30%乙醇、0.15 mL 0.5 mol/L NaNO2和0.15 mL 0.3 mol/LAlCl3，搖勻后靜置5 min，再加入1 mL 1 mol/L NaOH，搖勻;以30%乙醇溶液為空白對照，在506 nm下測吸光值。以蘆丁濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.0008X+0.0047（R2=0.9990）。

（2）總黃酮提取量的測定。取0.3 mL備用提取液于10 mL離心管，然后按（1）中的步驟加入各試劑，于506 nm條件下測吸光值，3組平行實驗。總黃酮提取量計算公式如下：

總黃酮提取量（mg/100 g）=100×C×V/M

式中，C為經(jīng)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出來的黃酮濃度（mg/L）;V為提取液的總體積（mL）;M為稱取的澳洲堅果青皮的質(zhì)量（g）。

1.2.6? 澳洲堅果青皮總黃酮體外抗氧化性能研究? （1）ABTS自由基清除能力[13]。首先將備用提取液稀釋至總黃酮濃度為60、70、80、90、100、110 mg/L，分別取50 μL上述不同濃度樣液于10 mL離心管，加入4 mL ABTS+反應(yīng)液[7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L K2S2O8溶液按比例為1∶1進(jìn)行充分混合后避光反應(yīng)12～16 h，用30%乙醇溶液稀釋至732 nm條件下吸光值為（0.70± 0.02），即為ABTS+反應(yīng)液]，充分混勻避光反應(yīng)6 min后于732 nm處測吸光值A(chǔ)1。以50 μL 30%乙醇為空白對照，測吸光值A(chǔ)0。以澳洲堅果青皮總黃酮濃度為橫坐標(biāo)，以ABTS自由基清除率為縱坐標(biāo)，擬合線性方程，清除率為50%時的總黃酮的濃度即為澳洲堅果青皮總黃酮對ABTS自由基的半數(shù)清除率IC50，并以Trolox為陽性對照，平行測3次。ABTS自由基清除率計算公式如下：

澳洲堅果青皮總黃酮DPPH自由基清除率= （A0?A1）/A0×100 %

（2）總抗氧化還原能力[14]。取20 μL備用提取液于10 mL離心管，分別加入1 mL 蒸餾水、1.8 mL FRAP溶液（40 mmol/L鹽酸、20 mmol/L六水氯化鐵溶液與pH為3.6的0.3 mmol/L醋酸緩沖液按比例為1∶1∶10混勻后置于37 ℃恒溫水浴待用，需現(xiàn)配現(xiàn)用）充分混勻后于37 ℃恒溫水浴反應(yīng)10 min，于593 nm處測吸光值，平行測3次。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算澳洲堅果青皮總黃酮總抗氧化還原能力。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

每組實驗均進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 提取方法對澳洲堅果青皮總黃酮提取的影響

由圖1可知，在提取時間、提取溫度、料液比以及乙醇濃度等條件相同情況下，與傳統(tǒng)提取工藝相比，超聲輔助可顯著提高澳洲堅果青皮總黃酮提取量（P<0.05）。這可能是因為采用超聲輔助提取，加速了澳洲堅果青皮細(xì)胞的破壞，增加了目標(biāo)物質(zhì)與提取溶劑的接觸，從而增加了目標(biāo)物質(zhì)向提取溶劑的擴(kuò)散，從而導(dǎo)致提取量增加。

2.2? 單因素實驗結(jié)果分析

2.2.1? 乙醇濃度對超聲輔助提取澳洲堅果青皮總黃酮的影響? 由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度小于40%時，隨乙醇濃度增加，超聲輔助提取澳洲堅果青皮總黃酮的提取量增加;當(dāng)乙醇濃度大于40%時，隨乙醇濃度增加，總黃酮提取量減少;當(dāng)乙醇濃度為40%時，總黃酮提取量最高，且顯著高于其他乙醇濃度（P<0.05）?？傸S酮提取量隨乙醇濃度增加呈先增加后減少的趨勢，可能是因為乙醇濃度增加有利于材料與提取溶劑接觸，增加提取溶劑向細(xì)胞擴(kuò)散的可能性，從而總黃酮提取量增加[15];但當(dāng)乙醇濃度超過一定濃度時，總黃酮與提取溶劑極性的差異增加，從而導(dǎo)致提取量減少[16]。Sheng等[17]的研究表明，乙醇濃度為40%時楊樹花總黃酮提取量最高，本研究趨勢與其一致。綜合考慮，乙醇濃度宜選為40%。

2.2.2? 料液比對超聲輔助提取澳洲堅果青皮總黃酮的影響? 由圖3可知，料液比對澳洲堅果青皮總黃酮提取量的影響趨勢與乙醇濃度一致：隨料液比的增加，總黃酮提取量呈先增加后減少的趨勢，料液比為1∶75 （g/mL）時總黃酮提取量達(dá)到最高，顯著高于其他料液比（P<0.05）。在（1∶15）～ （1∶75） g/mL范圍內(nèi)，總黃酮提取量隨料液比增加而增加可能是因為料液比增加，提取溶劑中總黃酮含量較低，物料與提取溶劑之間的傳質(zhì)增加，從而提取量增加[18]。當(dāng)料液比超過1∶75 （g/mL）時總黃酮提取量降低，這可能是色素等雜質(zhì)向提取溶劑的擴(kuò)散對黃酮擴(kuò)散的影響所致[19]。同時，由于料液比的增加，會增加后續(xù)純化、分離的工作量以及試劑消耗，所以料液比宜選為1∶75 （g/mL）。

2.2.3? 提取溫度對超聲輔助提取澳洲堅果青皮總黃酮的影響? 由圖4可知，在20～70 ℃范圍內(nèi)，澳洲堅果青皮總黃酮提取量隨溫度升高而增加。其中，溫度在20～50 ℃范圍時，總黃酮提取量呈直線上升趨勢;溫度高于50 ℃時，總黃酮提取量增加緩慢。這可能是由于溫度升高，分子運動加劇，增加了材料與提取溶劑之間的傳質(zhì)推動力;同時，提取溶劑粘度降低，總黃酮溶解度增加，從而總黃酮提取量增加[20]。田剛等[21]的研究表明月季葉總黃酮提取率隨提取溫度的增加呈先增加后減少的趨勢，這可能是由于不同材料總黃酮組成成分不同所致。同時，由圖4可知，當(dāng)提取溫度為60 ℃時，總黃酮提取量與提取溫度為70 ℃時無顯著差異，顯著高于提取溫度為50 ℃（P< 0.05），但僅比提取溫度為50 ℃時高了4.87%。此外，提取溫度增加會造成材料中熱敏物質(zhì)的破壞、雜質(zhì)溶解度增加以及溶劑的揮發(fā)[22-23]。因此，綜合考慮，提取溫度宜為50 ℃。

2.2.4? 提取時間對超聲輔助提取澳洲堅果青皮總黃酮的影響? 由圖5可知，澳洲堅果青皮總黃酮提取量隨時間的增加而增加，并在45 min之后趨于平緩，與提取溫度影響趨勢一致。這可能是隨時間的增加，由于物料與提取溶劑中總黃酮濃度差減少，傳質(zhì)動力減小，從而45 min之后總黃酮提取量增加緩慢。同時，由圖5中可知，提取時間從15 min增加到45 min，總黃酮提取量增加了96.5 mg/100g，增長率僅為10.34%。由于隨提取時間的增加，溶劑揮發(fā)以及能量消耗也會隨之增加，所以提取時間宜選為15 min。

2.2.5? 超聲功率對超聲輔助提取澳洲堅果青皮總黃酮的影響? 超聲功率是影響總黃酮等生物活性物質(zhì)提取的重要因素之一。由圖6可知，總黃酮提取量隨超聲功率增加而緩慢增加。當(dāng)超聲功率從300 W增加到500 W時，雖然超聲功率為500 W時總黃酮提取量顯著高于超聲功率為300 W時（P<0.05），但也僅增加了5.34%。同時，隨超聲功率的增加，“空化作用”增強，加速了總黃酮向提取溶劑擴(kuò)散的能力，也會造成總黃酮的破壞以及能耗增加。因此，綜合考慮，超聲功率選為300 W。

2.3? 超聲輔助提取澳洲堅果青皮總黃酮正交試驗結(jié)果分析

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以總黃酮提取量為指標(biāo)，在超聲功率為300 W條件下，選取乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和提取時間（D）4個因素進(jìn)行L9（34）正交試驗，從而確定澳洲堅果青皮總黃酮的最佳超聲提取工藝條件。由表2極差分析和表3方差分析可知，超聲對澳洲堅果青皮總黃酮提取量的影響因素依次為：提取時間（D）、乙醇濃度（A）、提取溫度（C）、料液比（B），其中A、C、D為極顯著（P<0.01），B為不顯著。同時，由表2和表3可知，超聲輔助提取澳洲堅果青皮總黃酮最優(yōu)工藝條件為A1B3C3D3，由于影響因素B不顯著，所以調(diào)整最優(yōu)工藝條件為A1B1C3D3，即提取時間為45 min、乙醇濃度為50%、提取溫度為50 ℃、料液比為1∶60（g/mL）。在最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行驗證試驗，總黃酮提取量為（1638.59±44.26） mg/100 g，與A1B3C3D3無顯著差異（P<0.05）。

2.4? 澳洲堅果青皮總黃酮抗氧化性能實驗結(jié)果

2.4.1? ABTS自由基清除能力? 根據(jù)圖7制定ABTS自由基清除率與Trolox濃度的線性方程：Y=0.2257X?0.6190（R2=0.9938）。由圖8可知，在50～100 mg/L濃度范圍內(nèi)，澳洲堅果青皮總黃酮與ABTS自由基清除率呈較好的線性關(guān)系，擬合線性方程為：Y=0.5214X+2.7857（R2=0.9972）。由線性方程計算ABTS自由基清除率為50%時的Trolox濃度和澳洲堅果青皮總黃酮濃度即為半數(shù)清除率IC50。經(jīng)計算，Trolox對ABTS自由基的IC50為224.26 mg/L，澳洲堅果青皮總黃酮對ABTS自由基的IC50為90.55 mg/L。由此可知，澳洲堅果青皮總黃酮對ABTS自由基清除能力強于Trolox，約為Trolox的2.48倍。

2.4.2? 總抗氧化還原能力? 由圖9可知，以Trolox濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.0012X+0.0318（R2=0.9988）。當(dāng)澳洲堅果青皮總黃酮濃度為105.11 mg/L時，吸光值為0.2717（3組平行試驗分別為0.267、0.276、0.272），經(jīng)總抗氧化還原能力標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的Trolox濃度為199.92 mg/L，即澳洲堅果青皮總黃酮濃度為105.11 mg/L時，其總抗氧化還原能力相當(dāng)于199.92 mg/L的Trolox。因此，澳洲堅果青皮總黃酮總抗氧化還原能力約為Trolox的1.90倍。

3? 討論

總黃酮是一類天然活性物質(zhì)，有研究表明黃酮類化合物具有多種生物活性，如抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等[24]。總黃酮的提取是研究其生物活性以及后續(xù)純化、分離和結(jié)構(gòu)鑒定的基礎(chǔ)，從而廣受科研工作者關(guān)注。本研究采用L9（34）正交試驗對超聲輔助提取澳洲堅果青皮總黃酮工藝進(jìn)行優(yōu)化，并采用了總抗氧化還原能力和對ABTS自由基清除能力評價其抗氧化能力。

在單因素實驗基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗，通過極差分析得出影響超聲輔助提取澳洲堅果青皮總黃酮的因素依次為：提取時間、乙醇濃度、提取溫度、料液比。優(yōu)化的最佳超聲輔助提取工藝條件為：提取時間45 min、乙醇濃度50%、提取溫度50 ℃、料液比1∶60（g/mL）。在此條件下，總黃酮提取量為（1638.59±44.26） mg/100 g。通過總抗氧化實驗發(fā)現(xiàn)，澳洲堅果青皮總黃酮對ABTS自由基的清除能力約為Trolox的2.48倍，總抗氧化還原能力約為Trolox的1.90倍，表明澳洲堅果青皮總黃酮具有較強的抗氧化能力。

本研究結(jié)果表明超聲輔助提取澳洲堅果青皮總黃酮是一種行之有效的方法，為澳洲堅果青皮綜合利用、開發(fā)多種類澳洲堅果產(chǎn)品以及延伸澳洲堅果加工產(chǎn)業(yè)鏈提供了借鑒作用，也為我國云南、廣西和貴州等澳洲堅果主產(chǎn)區(qū)的澳洲堅果青皮處理提供了數(shù)據(jù)支撐。同時，為后續(xù)純化、分離及鑒定等奠定了基礎(chǔ)。

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