激素對(duì)AECOPD 患者誘導(dǎo)痰sIg A變化的影響

宋甲富 徐采云 李家樹 趙媛 李春華

1徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港市第一人民醫(yī)院呼吸科222000;2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港市第一人民醫(yī)院危重癥醫(yī)學(xué)科222000;3徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港市第一人民醫(yī)院病理科222000

分泌型免疫球蛋白A (secretory immunoglobulin A,sIg A)是支氣管黏膜免疫的主 要 成 分, 是 由 2 個(gè) 免 疫 球 蛋 白 A(immunoglobulin A,Ig A)單體、J鏈與多聚免疫球蛋白受體 (polymeric immunoglobulin receptor,PIg R)結(jié)合而成,具體形成機(jī)制為黏膜下淋巴組織合成并分泌Ig A 單體及J鏈,2個(gè)Ig A 單體通過與J鏈連接進(jìn)一步通過胞吞方式進(jìn)入支氣管上皮細(xì)胞,然后再與支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)的PIgR 結(jié)合就形成所謂的PIgR-Ig A 復(fù)合體,進(jìn)一步分泌到支氣管上皮細(xì)胞形成sIg A (包含兩個(gè)Ig A 單體,J鏈和來自PIgR 的分泌片段 (secretory component,SC)。既往認(rèn)為sIg A 直接與細(xì)菌、病毒等病原微生物結(jié)合而發(fā)揮抗感染作用。但近年來發(fā)現(xiàn),sIg A在COPD的發(fā)生、發(fā)展過程中亦起到重要作用。

COPD 是以持續(xù)氣道炎癥和不可逆的氣流受限為特點(diǎn),發(fā)病機(jī)制至今不是十分明確,目前認(rèn)為吸煙是其發(fā)生的重要原因,但是這一原因不能解釋戒煙后炎癥的持續(xù)進(jìn)展和氣道的繼續(xù)重塑。2001年P(guān)ilette等[1]首先報(bào)道了COPD 患者氣道表面的SC較正常人顯著減少;緊接著Polosukhin等[2]證實(shí)COPD 患者支氣管上皮PIgR 表達(dá)也減少,這就證明了sIg A 可能與COPD 存在一定關(guān)系;研究人員進(jìn)一步利用原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)現(xiàn)來自于COPD患者的支氣管上皮細(xì)胞相比正常人所表達(dá)PIgR 亦顯著減少,來自正常人的支氣管上皮細(xì)胞分化良好,能夠顯著增加PIgR 的表達(dá),而sIg A 也可以通過轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β信號(hào)通路促進(jìn)支氣管上皮分化[2-3],這也就說明sIg A 可能參與了COPD 的發(fā)展。2016年Richmond 等[4]利用基因敲除技術(shù)證實(shí)PIg R 基因敲除后的小鼠 (氣道先天缺乏sIg A)經(jīng)脂多糖刺激可以發(fā)展形成肺氣腫模型,進(jìn)一步證實(shí)sIg A 不但參與了COPD 的發(fā)展同樣參與了COPD 的發(fā)生。

盡管目前研究對(duì)sIg A 在COPD 的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用有所認(rèn)識(shí),但是對(duì)其在急性加重期的表達(dá)及變化情況仍然知之甚少,且急性加重是COPD 疾病發(fā)展過程中的重要事件,每次急性加重都會(huì)導(dǎo)致第1秒用力呼氣容積 (forced expiratory volume in one second,FEV1)的下降和死亡的發(fā)生且消耗大量的醫(yī)療資源[5],因此對(duì)COPD 急性加重 (acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD)的關(guān)注意義重大。sIg A 的生成分泌和PIgR 的表達(dá)直接相關(guān),從基因水平考慮某些炎癥因子如腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)、干擾素γ (interferon γ,IFN-γ)、IL-4、能夠刺激PIgR 基因的啟動(dòng)子區(qū)域從而增加PIgR 表達(dá)[6]。既往我們的研究發(fā)現(xiàn)即使是吸入激素也能夠降低氣道sIg A 的表達(dá)[7],而激素的使用又是縮短急性加重病程和提高治療成功率的重要手段;AECOPD 經(jīng)激素抗炎治療后,炎癥因子 (TNF-α、IFN-γ、IL-4)下降,因此推測(cè)激素可能通過下調(diào)炎癥因子減少sIg A 的表達(dá)。中性粒細(xì)胞對(duì)COPD 患者氣道sIg A 分泌的影響是雙重的,一方面低濃度可以通過分泌炎癥因子促進(jìn)sIg A 的分泌,另一方面高濃度又可以通過釋放蛋白酶水解PIg R/SC復(fù)合物降低sIg A 的表達(dá)[8],先前很多研究發(fā)現(xiàn)COPD 患者經(jīng)過治療后炎癥因子下降,中性粒細(xì)胞總數(shù)下降,這就使得我們對(duì)AECOPD 患者sIg A 的變化趨勢(shì)難以確定,所以設(shè)計(jì)本試驗(yàn)觀察sIg A 在COPD 急性加重過程中表達(dá)趨勢(shì)及其與炎癥細(xì)胞、炎癥因子以及激素使用劑量的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選擇連云港市第一人民醫(yī)院呼吸科2017 年1 月 至2018 年12 月 共44 例 確 診AECOPD 患者。本研究符合人體試驗(yàn)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并通過連云港市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(LW201611001),研究對(duì)象知情同意并簽署知情同意書。入組標(biāo)準(zhǔn)：符合慢性阻塞性肺疾病全球創(chuàng)議[9]2017 AECOPD 定義 (呼吸系統(tǒng)癥狀出現(xiàn)急性加重,典型表現(xiàn)為呼吸困難加重,咳嗽加劇,痰量增多或者痰液呈膿性,超出日常變異,并且導(dǎo)致需要改變藥物治療),自愿加入臨床試驗(yàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：拒絕參加臨床試驗(yàn),誘導(dǎo)痰失敗,合并肺炎,治療期間加重。

1.2方法

1.2.1AECOPD 的處理及治療 所有患者開始給予甲潑尼龍(40 mg 靜滴,1次/d)抗炎治療,允許病情好轉(zhuǎn)后更換為強(qiáng)的松口服,允許患者臨時(shí)使用氫化可的松治療,給予頭孢唑肟 (3 g 靜滴,1次/12 h)抗感染治療,復(fù)方異丙托溴銨(2.5 ml霧化吸入2次/d),吸入用布地奈德溶液(2 mg霧化吸入2次/d),茶堿緩釋片(0.2 g口服2次/d)。分別在第2天、第4天和第10天收集患者誘導(dǎo)痰,且在第2、4、6、8、10天5個(gè)時(shí)間點(diǎn)行床邊肺功能FEV1檢測(cè)(圖1)。

1.2.2AECOPD 治療療程 當(dāng)達(dá)到出院標(biāo)準(zhǔn)時(shí)給予辦理出院,因需要收集第10天誘導(dǎo)痰,因此住院時(shí)間最少10 d。具體出院標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床醫(yī)師認(rèn)為患者可以適應(yīng)家庭醫(yī)療;(2)患者能夠使用吸入裝置;(3)如果患者以前沒有臥床,需能在室內(nèi)行走; (4)患者能夠進(jìn)食,且睡眠不受呼吸困難影響;(5)患者臨床穩(wěn)定12～24 h。 (6)動(dòng)脈血?dú)夥治龇€(wěn)定12～24 h。

1.2.3AECOPD 治療轉(zhuǎn)歸 好轉(zhuǎn)：達(dá)到出院標(biāo)準(zhǔn);惡化：不能達(dá)到出院標(biāo)準(zhǔn),疾病加重出院;死亡：呼吸心跳停止。

1.2.4誘導(dǎo)痰 利用3%鹽水霧化吸入,囑患者每隔5 min深吸氣后呼氣呼至2/3時(shí)咳痰(咳痰前先漱口),收集大概1 ml左右痰液終止。誘導(dǎo)痰盡量2 h內(nèi)處理,如果不能及時(shí)處理,放4 ℃冰箱冷藏24 h 內(nèi)處理。如果患者痰量較多,直接收集,無需霧化誘導(dǎo)。

1.2.5誘導(dǎo)痰處理及細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類 (1)裂解：選取痰標(biāo)本稱重 (g),加入重量數(shù)值4 倍(ml)的黏液裂解劑0.1%二硫蘇糖醇。37 ℃水浴10 min,同時(shí)震蕩器進(jìn)行震蕩充分裂解。較濃的痰栓需要增加裂解時(shí)間。(2)震蕩：充分使痰液與裂解劑混勻,促進(jìn)裂解。(3)過濾：使用48目尼龍網(wǎng),將充分裂解的痰液過濾,去除雜質(zhì)。(4)牛鮑計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)每毫升痰的總細(xì)胞數(shù),濾液1 000 r/min離心5 min,離心半徑10 cm,留取上清液,-80 ℃凍存待測(cè),細(xì)胞沉淀涂片后行HE 染色,光鏡下對(duì)400個(gè)非上皮細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。

1.2.6FEV1測(cè)定 囑患者深吸氣,最大、最快速度呼氣,記錄FEV1連續(xù)3次,取平均值。

1.2.7炎癥因子及sIg A 的測(cè)定 TNF-α、IL-8、嗜酸粒細(xì)胞陽離子蛋白 (eosinophil cationic protein,ECP)、IL-4、IFN-γ、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)及sIg A 均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定,試劑盒購(gòu)買自上海蘭基生物有限公司。

圖1 導(dǎo)痰sIg A 與炎癥因子變化 A：sIg A;B：MMP-9;C：IFN-γ;D：IL-8;E：ECP;F：TNF-α

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,資料以±s 表示,多組間總體均數(shù)比較在方差齊時(shí)采用單因素方差分析one-way ANOVA方差不齊時(shí)用Welch 校正檢驗(yàn),兩兩比較方差齊時(shí),用LSD,方差不齊時(shí)用Tamhane,P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。激素與sIg A 變化值相關(guān)性采用直線相關(guān)。

2 結(jié)果

收集44 例患者,男28 例,女16 例,年齡(67.23±18.50)歲,Ⅰ型呼吸衰竭18例,Ⅱ型呼吸衰竭26例。

為了驗(yàn)證炎癥因子對(duì)sIg A 的影響,本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了與PIgR 表達(dá)有關(guān)的TNF-α、IL-4、IFN-γ。同時(shí)檢測(cè)了其他炎癥因子如中性粒細(xì)胞趨化因子IL-8,中心粒細(xì)胞分泌的炎癥因子MMP-9,以及嗜酸粒細(xì)胞相關(guān)炎癥因子ECP,發(fā)現(xiàn)第4天誘導(dǎo)痰炎癥因子TNF-α、ECP、IL-4、IFN-γ、MMP-9顯著低于第2天,而第10天與第4天炎癥因子水平比較均未見顯著性改變,sIg A 在第10天的表達(dá)水平明顯高于第4天,且第4天亦顯著高于第2天(圖1)。

第10天中性粒細(xì)胞總數(shù)較第4天無顯著下降,細(xì)胞總數(shù)和嗜酸粒細(xì)胞數(shù)也未見顯著改變,而第4天與第2天比較,上述指標(biāo)均顯著降低(圖2)。

圖2 誘導(dǎo)痰炎癥細(xì)胞變化

FEV1在第2、4、6、8、10 天5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

為了驗(yàn)證激素使用量和sIg A 濃度改變的關(guān)系,分析發(fā)現(xiàn)第4天至第10天激素使用劑量 (換算為強(qiáng)的松劑量)與這期間sIg A 濃度變化值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.794,P ＜0.05);進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)第2天至第10天激素使用量與同期sIg A 濃度變化值亦呈負(fù)相關(guān)(r=-0.591,P ＜0.05)。

3 討論

我們的研究結(jié)果表明AECOPD 誘導(dǎo)痰sIg A含量處于較低水平,給予抗感染、解痙、平喘治療后濃度較前顯著增高。但是sIg A 在急性加重期治療的過程中水平的變化具體機(jī)制不清,本課題發(fā)現(xiàn)激素的使用劑量與氣道局部sIg A 的含量改變相關(guān)。

圖3 FEV1 的變化

入院第4天sIg A 含量較第2天明顯升高,這時(shí)伴隨著與PIgR 合成相關(guān)炎癥因子 (TNF-α、IFN-γ、IL-4)的下降和中性粒細(xì)胞的下降。上述炎癥因子能夠通過作用于PIgR 的啟動(dòng)子區(qū)域增加PIg R 表達(dá)[10],因此炎癥因子的下降應(yīng)該導(dǎo)致PIgR 表達(dá)的進(jìn)一步降低,從而導(dǎo)致sIg A 分泌量的下降,但結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)sIg A 較前上升,因此我們認(rèn)為sIg A 水平在第4天的上升與中性粒細(xì)胞的快速下降有關(guān),因?yàn)橹行粤＜?xì)胞快速下降可以減少蛋白酶的分泌從而減少對(duì)PIgR/SC 復(fù)合物的水解作用[8]。

有研究顯示誘導(dǎo)痰IFN-γ、IL-8等炎癥因子在治療前期下降明顯,治療后期未再進(jìn)一步下降[11],這與我們的研究結(jié)果一致,也說明激素對(duì)AECOPD 炎癥治療作用有限。

在試驗(yàn)第4天至第10天,激素治療并沒有進(jìn)一步的改變氣道炎癥,而sIg A 水平仍然不斷上升,考慮AECOPD 恢復(fù)過程中支氣管上皮修復(fù)促進(jìn)PIg R 表達(dá),進(jìn)一步導(dǎo)致sIg A 的合成增加,而sIg A 又可以促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞分化及修復(fù)形成良性循環(huán)[2-3]。但是我們也發(fā)現(xiàn)第4天至第10天的激素使用量與這期間的sIg A 變化值呈負(fù)相關(guān),進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)第2天至第10天的激素劑量和第10天與第2天的變化值亦呈負(fù)相關(guān),這說明激素的使用影響sIg A 的上升。

激素通過抑制NF-κB信號(hào)通路起到抗炎作用,而NF-κB信號(hào)通路的抑制恰恰導(dǎo)致PIgR 表達(dá)減少[10],后者是sIg A 形成的必要條件,這也許能夠解釋為什么激素會(huì)對(duì)sIg A 生成產(chǎn)生不利影響。

TORCH 試驗(yàn)首先報(bào)道了吸入糖皮質(zhì)激素(inhaled corticosteroids,ICS)可以增加肺炎發(fā)生率[12],隨后的研究發(fā)現(xiàn)ICS同樣可以增加肺結(jié)核發(fā)生率[13],考慮原因可能是ICS能夠降低氣道黏膜局部免疫力,而sIg A 是氣道黏膜免疫最重要的免疫球蛋白,既往我們的研究發(fā)現(xiàn)即使是吸入3個(gè)月的沙美特羅替卡松吸入劑 (50/250μg)亦能夠顯著減低誘導(dǎo)痰sIg A 的含量[7],本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)AECOPD 患者更長(zhǎng)時(shí)間的全身激素使用也對(duì)sIg A 的分泌構(gòu)成不利影響。

REDUCE[14]研究結(jié)果提示AECOPD 短療程激素與長(zhǎng)療程激素療效相當(dāng),且高血壓、高血糖等不良反應(yīng)顯著減少,因此GOLD 對(duì)于AECOPD 患者推薦短療程激素,亦有相關(guān)研究提示提高sIg A含量可以延緩COPD 急性加重[15],因此本課題結(jié)果進(jìn)一步支持AECOPD 患者更適合短療程激素治療。

AECOPD 肺功能的檢測(cè)提示在治療的第2天以后FEV1未見顯著上升,與Leuppi等[14]的研究結(jié)果一致。這說明FEV1的檢測(cè)在AECOPD 意義不大。當(dāng)然我們沒有檢測(cè)FVC、MVV 等其他指標(biāo),這是需要進(jìn)一步改進(jìn)的地方。

總之,AECOPD 患者經(jīng)治療后其誘導(dǎo)痰sIg A濃度可以得到提高,可能與中性粒細(xì)胞炎癥的下降相關(guān)。更多激素使用量并沒有進(jìn)一步降低中性粒細(xì)胞炎癥,反而影響sIg A 的升高。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突