sCD163及相關(guān)因子在穩(wěn)定期哮喘炎癥表型中的表達(dá)及臨床意義

李睿 宣立航 胥國文 馮顯莉 曾雪梅

1四川省八一康復(fù)中心內(nèi)科,成都611135;2四川省八一康復(fù)中心門診部,成都611135;3成都市青羊區(qū)黃田壩成飛醫(yī)院呼吸科610091

支氣管哮喘 (哮喘)是一類由多種炎癥細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥反應(yīng)性疾病,根據(jù)誘導(dǎo)痰炎癥細(xì)胞分類可分為嗜酸粒細(xì)胞增多型哮喘(eosinophiis asthma,EA)、中性粒細(xì)胞增多型哮喘(neutrophilic asthma,NA)、粒細(xì)胞缺乏型哮喘 (paucigranulocytic asthma,PA)及混合細(xì)胞型哮喘 (mixed granulocytic asthma,MA)[1],不同的哮喘炎癥表型患者其臨床特征和治療反應(yīng)性具有異質(zhì)性[2]。但是筆者基于常年的臨床經(jīng)驗(yàn),認(rèn)為哮喘患者的氣道炎癥表型在穩(wěn)定期和急性發(fā)作期時(shí)可能存在一定的差異性,對(duì)治療的反應(yīng)性亦有所不同。巨噬細(xì)胞在免疫反應(yīng)調(diào)整中處于中心位置,與各種免疫細(xì)胞之間均存在密切聯(lián)系[3]。IL-6、IL-8等典型的抗炎介質(zhì)可通過與單核-巨噬細(xì)胞膜表面的CD163 蛋白結(jié)合,調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[4]。CD163作為活化的M2型巨噬細(xì)胞特異性表面分子標(biāo)志物,在炎癥反應(yīng)中的生物學(xué)作用已被證實(shí)[5],并且有研究顯示,CD163 可能還參與氣道組織重塑[6]。因此我們推測可溶性CD163 (soluble CD163,sCD163)可客觀、定量的反映氣道炎癥水平?，F(xiàn)研究報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 隨機(jī)選擇2016年1月至2018年10月期間在成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬四川省康復(fù)醫(yī)院/四川省八一康復(fù)中心內(nèi)科接受治療且符合以下納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)的哮喘病患者172 例,作為哮喘組,男98例,女74例,年齡(61.74±16.35)歲,年齡范圍為18～82歲。哮喘患者納入標(biāo)準(zhǔn)： (1)成年患者,男女不限;(2)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組制訂的 《支氣管哮喘防治指南》[7]關(guān)于哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn);(3)患者4周內(nèi)無哮喘急性發(fā)作,或者因急性發(fā)作于門診就診或住院的哮喘患者,哮喘穩(wěn)定4周后來院復(fù)查時(shí)采集誘導(dǎo)痰液樣本和血清樣本。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)4周內(nèi)發(fā)生呼吸道感染者;(2)合并肺栓塞,肺間質(zhì)纖維化,活動(dòng)性肺結(jié)核史,肺炎,肺氣腫,血液系統(tǒng)疾病,消化系統(tǒng)疾病,嚴(yán)重心、肝、腎功能不全,惡性腫瘤患者;(3)近半年內(nèi)接受過大手術(shù)治療者。另外,隨機(jī)選擇30例同時(shí)期在四川省八一康復(fù)中心門診進(jìn)行體格檢查且同意做支氣管激發(fā)試驗(yàn)的健康志愿者作為健康組,男15 例,女15 例,年齡 (60.75±18.44)歲,年齡范圍為26～80歲。健康志愿者肺功能檢查正常,支氣管激發(fā)試驗(yàn)陰性;排除入組前4周出現(xiàn)呼吸道感染癥狀以及其他慢性疾病者。2組研究對(duì)象的年齡、性別比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。參與該試驗(yàn)的所有受試對(duì)象均簽署知情同意書,該試驗(yàn)經(jīng)過四川中醫(yī)藥區(qū)域倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(SC20160216)。

1.2研究方法

1.2.1肺功能檢查 采用美國麥加菲肺功能儀測試所有患者的肺部功能指標(biāo),包括第1秒用力呼氣容積 (forced expiratory volume in one second,FEV1)、FVC、FEV1/FVC。

1.2.2誘導(dǎo)痰的收集 FEV1占預(yù)計(jì)值百分比(forced expiratory volume in one second as a percentage of expected value,FEV1%pred)＜60%者霧化吸入0.9%氯化鈉溶液20 min進(jìn)行痰誘導(dǎo),其余受試者則使用4.5%氯化鈉溶液進(jìn)行痰誘導(dǎo)。當(dāng)FEV1%pred下降≥15%超過2次時(shí)或者患者不能耐受時(shí)停止痰誘導(dǎo)。選取誘導(dǎo)痰中的濃稠痰液3～5 ml。保證在2 h內(nèi)完成對(duì)痰液的檢測 (室溫),否則可暫時(shí)儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中。

1.2.3誘導(dǎo)痰的處理 將痰液置于無菌培養(yǎng)皿中,記錄痰細(xì)胞團(tuán)塊體積。加入0.1% DTT 工作液,充分裂解痰細(xì)胞團(tuán)塊。30 min后加入PCS終止裂解反應(yīng)。過濾,收集濾液,顯微鏡下計(jì)數(shù)。全細(xì)胞計(jì)數(shù) (total cell count,TCC)=炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)(活細(xì)胞+死細(xì)胞)×0.02/象限數(shù),細(xì)胞存活率%=活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。制備單層痰細(xì)胞涂片,分別進(jìn)行Chromotrope 2R (C2R 酸)染色和May-Grunwald Giemsa染色。

1.2.4痰涂片炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù) 將痰涂片置于光學(xué)倒置顯微鏡下,隨機(jī)選擇10個(gè)視野,計(jì)數(shù)400個(gè)非鱗狀上皮細(xì)胞的炎癥細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附測定 (enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法測定血清炎癥介質(zhì)水平 采集受試者肘靜脈血3 ml,分別置于EDTA 抗凝管和促凝管中。采用ELISA 試劑盒檢測sCD163、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-8、IL-9、IL-6水平。試劑盒購自加拿大瑞邦公司。所有操作按照試劑盒說明書或儀器操作說明書規(guī)定的步驟進(jìn)行。

1.2.6呼出氣一氧化氮 (fractional exhaled nitric oxide,FeNO)檢測 受試者取坐位,進(jìn)行最大呼氣,將過濾器迅速含入嘴中,呼氣至最大肺活量,采用NIOX 一氧化氮測定儀 (瑞典尼爾斯公司)檢測FeNO (ppb) (1 ppb=1×10-9mo1/L),立即以持續(xù)50 ml/s的速率呼氣10 s,進(jìn)行3次,取平均值。

1.3哮喘患者分組 根據(jù)誘導(dǎo)痰液炎癥細(xì)胞比例進(jìn)行分型,EA 型：嗜酸粒細(xì)胞≥3%,中性粒細(xì)胞＜64%;NA 型：嗜酸粒細(xì)胞＜3%,中性粒細(xì)胞≥64%;MA 型：嗜酸粒細(xì)胞≥3%,中性粒細(xì)胞≥64%;PA 型：嗜酸粒細(xì)胞＜3%,中性粒細(xì)胞＜64%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本資料采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。所有計(jì)量資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),近似正態(tài)分布或正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s 表示。2組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn),多組間比較采用方差分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù) (%)表示,組間比較用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman分析。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.12組受試者一般臨床資料和血清炎性介質(zhì)水平比較 2組受試者的年齡、性別構(gòu)成、吸煙者比例、血清IL-4、IL-9含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=1.460、1.828,P 值均＞0.05)。但是哮喘組患者IL-1β、IL-5、IL-6、IL-8、sCD163水平明顯高于健康組志愿者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t =7.788、5.385、3.144、8.216、11.038,P 值均＜0.05)。見表1。

表1 2組受試者一般臨床資料和血清炎性介質(zhì)水平比較

2.2哮喘患者炎癥分型 對(duì)172例穩(wěn)定期哮喘患者的合格誘導(dǎo)痰標(biāo)本進(jìn)行誘導(dǎo)痰細(xì)胞薄層涂片。其中79 例 (45.93%) 患 者 為 EA 型,83 例(48.26%)患者為PA 型,3例 (1.74%)患者為MA 型,7例(4.07%)患者為NA 型。

2.3不同炎癥表型患者的臨床特點(diǎn) EA 型患者FeNO 值高于其他3個(gè)表型患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F =12.509,P ＜0.05)。4 個(gè)表型患者誘導(dǎo)痰樣本中TCC基本一致,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.900,P ＞0.05)。另外,MA 型患者痰中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他3 個(gè)表型患者,并且MA 型和NA 型患者痰中性粒細(xì)胞百分比高于EA 型和PA 型患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F =695.904、2.890,P 值均＜0.05)。EA 型和MA 型患者誘導(dǎo)痰嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和百分比明顯高于PA 型和NA型患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F =1 080.975、136.314,P 值均＜0.05)。而EA 型和PA 型痰巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)和百分比明顯高于MA 型和NA 型患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F = 23.149、464.899,P 值均＜0.05)。見表2。

2.4不同炎癥表型患者血清炎性介質(zhì)水平比較 經(jīng)ELISA 檢測,EA、PA、MA、NA 組穩(wěn)定期哮喘患者外周血清中IL-1β、IL-4、IL-9水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F =2.378、2.378、0.648,P 值均＞0.05);而NA 組患者血清IL-6 和IL-8 水平明顯高于其他3個(gè)表型患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F =2.890、12.329,P 值均＜0.05)。PA 組患者血清IL-5水平明顯低于其他3個(gè)表型患者,而sCD163水平卻高于其他3個(gè)表型患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F =21.182、14.506,P 值均＜0.05)。見表3。

2.5各炎癥介質(zhì)與哮喘患者臨床特性的相關(guān)性分析 如表4所示, (1)血清IL-1β、IL-6、IL-8水平與FeNO 呈負(fù)相關(guān) (r =-0.439、-0.571、-0.372,P 值均＜0.05);sCD163 水平與FeNO呈正相關(guān) (r=0.364,P ＜0.05)。 (2)IL-1β、IL-6、IL-8與痰中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均呈正相關(guān) (r=0.374、0.264、0.325,P 值均＜0.05)。(3)IL-5與痰嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān) (r=0.298,P ＜0.05),而IL-6、IL-8、sCD163與痰嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.329、-0.201、-0.411,P 值均＜0.05)。(4)除了IL-1β和IL-5以外,其余各血清炎癥介質(zhì)水平與痰巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)均呈正相關(guān)(r=0.369、0.409、0.189、0.473、0.322,P值均＜0.05)。見表4。

3 討論

表2 比較4個(gè)表型患者的臨床特點(diǎn) (±s)

表2 比較4個(gè)表型患者的臨床特點(diǎn) (±s)

注：EA 為嗜酸粒細(xì)胞增多型哮喘;PA 為粒細(xì)胞缺乏型哮喘;MA 為混合細(xì)胞型哮喘;NA 為中性粒細(xì)胞增多型哮喘;FeNO 為呼出氣一氧化氮;TCC為全細(xì)胞計(jì)數(shù);與EA 型患者比較,a P ＜0.05;與PA 型患者比較,b P ＜0.05;與MA 型患者比較,c P ＜0.05;1 ppb=1×10-9/mol/L

表型 例數(shù) FeNO(ppd)TCC(×106/ml)痰中性粒細(xì)胞痰嗜酸粒細(xì)胞痰巨噬細(xì)胞(×106/ml) (%)(×106/ml) (%)(×106/ml) (%)EA 79 47.15±14.86 3.60±1.47 0.05±0.01 2.59±0.84 0.54±0.09 15.38±7.14 2.31±0.64 77.70±8.45 PA 83 34.22±13.45a 3.12±1.28 0.01±0.00a 2.48±0.86 0.01±0.00a 0.20±0.06a 2.46±0.75 95.16±3.18a MA 3 35.19±9.26a 3.84±0.90 4.79±1.24ab 3.15±0.43ab 0.56±0.03b 7.61±2.17ab 0.91±0.20ab 17.42±3.26ab NA 7 31.73±10.95a 3.09±0.97 1.41±0.73abc 3.36±0.51ab 0.01±0.00abc 0.10±0.01ac 0.43±0.12abc 20.63±5.14ab F 值 12.509 1.900 695.9 2.890 1 080.975 136.314 23.149 464.899 P 值 ＜0.001 0.132 ＜0.001 0.037 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表3 比較4個(gè)表型患者血清IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、sCD163水平的差異 (ng/L,±s)

表3 比較4個(gè)表型患者血清IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、sCD163水平的差異 (ng/L,±s)

注：EA 為嗜酸性粒細(xì)胞增多型哮喘;PA 為粒細(xì)胞缺乏型哮喘;MA 為混合細(xì)胞型哮喘;NA 為中性粒細(xì)胞增多型哮喘;sCD163為可溶性CD163;與EA 型患者比較,a P ＜0.05;與PA 型患者比較,b P ＜0.05;與MA 型患者比較,c P ＜0.05

表型 例數(shù) IL-1β IL-4 IL-5 IL-6 IL-8 IL-9 sCD163 EA 79 1 079.57±512.79 227.05±79.35 25.46±4.87 2.59±0.84 18 192.31±6 114.03 357.83±121.89 23.78±6.21 PA 83 1 327.12±689.83 198.57±62.69 19.39±5.52a 2.48±0.86 16 487.18±5 319.26 338.94±95.73 29.85±5.70a MA 3 1 176.60±534.25 215.33±60.47 30.65±3.84ab 3.15±0.43ab 20 074.63±2 745.89 372.53±51.73 25.44±3.94b NA 7 1 346.58±499.62 192.74±49.83 22.76±4.15c 3.36±0.51ab 29 756.32±3 254.18ab 379.50±79.64 27.13±3.65a F 值 2.378 2.378 21.182 2.890 12.329 0.648 14.506 P 值 0.072 0.072 ＜0.001 0.037 ＜0.001 0.585 ＜0.001

哮喘屬于一類氣道慢性變態(tài)反應(yīng)性炎癥性、且具有典型的異質(zhì)性呼吸道疾病,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。2009年,全球哮喘防治指南首次引入炎癥表型的概念,根據(jù)氣道內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤的種類,將哮喘患者分為EA 型、NA 型、PA 型和MA 型[8]。但是穩(wěn)定期和急性發(fā)作期的炎癥表型通常是不一致的,因此單純依靠患者表型評(píng)估對(duì)治療的反應(yīng)性以及判斷預(yù)后可能敏感性欠佳。

表4 血清炎癥介質(zhì)與誘導(dǎo)痰中各炎癥細(xì)胞之間的相關(guān)性

除了嗜酸粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞以外,單核/巨噬細(xì)胞在哮喘發(fā)作的過程中也發(fā)揮著重要作用。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,輔助性T 細(xì)胞 (T helper cell,Th)亞群失衡是誘發(fā)哮喘的重要機(jī)制之一[9]。IL-4、IL-5、IL-9等都屬于典型的Th2細(xì)胞因子,可以促使嗜酸粒細(xì)胞浸潤,大量釋放組織胺類物質(zhì),從而誘發(fā)哮喘。但是近幾年,越來越多的研究證實(shí)固有免疫應(yīng)答也是哮喘發(fā)作的主要原因之一。Alvarado-Vazquez等[10]通過建立哮喘小鼠模型,發(fā)現(xiàn)肺泡灌洗液中M1型巨噬細(xì)胞的計(jì)數(shù)升高,而M2型巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)降低,兩者呈負(fù)相關(guān)。提示M2型巨噬細(xì)胞在抑制哮喘氣道炎癥發(fā)展中可能扮演重要角色。巨噬細(xì)胞是最重要的固有免疫細(xì)胞,在不同的微環(huán)境中可被誘導(dǎo)為MA 型和M2型兩種不同表型。而M2 型巨噬細(xì)胞主要參與Th2反應(yīng),例如在免疫系統(tǒng)疾病、變態(tài)反應(yīng)中對(duì)抗促炎反應(yīng)和細(xì)胞免疫應(yīng)答,從而減輕炎性浸潤和組織損傷[11]。CD163是表達(dá)于巨噬細(xì)胞表面的清道夫受體之一,是M2型巨噬細(xì)胞活化的重要標(biāo)志分子。其胞外段可被酶水解進(jìn)入外周循環(huán)中成為sCD163片段,利用ELISA 方法可進(jìn)行檢測。范春紅等[12]證實(shí),重癥肺炎者血清sCD163 水平可迅速升高,并且與患者預(yù)后密切相關(guān),提示sCD163可能參與呼吸道炎癥反應(yīng)。Zhi等[13]也提出sCD163可作為哮喘治療的潛在靶點(diǎn)。

為了探討炎癥細(xì)胞和炎性介質(zhì)在哮喘中的作用機(jī)制以及關(guān)聯(lián)意義,我們采用ELISA 法檢測了哮喘患者外周血清中sCD163以及相關(guān)重要IL 分子的水平。發(fā)現(xiàn)哮喘患者IL-1β、IL-5、IL-6、IL-8及sCD163 水平明顯高于健康志愿者,而且sCD163水平與FeNO 呈正相關(guān)。FeNO 是反應(yīng)哮喘患者氣道炎癥程度的重要指標(biāo)之一,說明sCD163有可能也參與了早期氣道炎性浸潤和組織損傷過程。除此以外,我們還發(fā)現(xiàn),血清sCD163水平與誘導(dǎo)痰樣本中嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān),且在PA 型患者中的水平最高,而在EA 型患者中的水平最低。因此我們推測血清中CD163水平可反應(yīng)氣道內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞的炎癥水平,嗜酸粒細(xì)胞大量分泌通過促使某些炎性介質(zhì)的釋放,刺激M2型巨噬細(xì)胞活化,使血清中sCD163水平降低。但是具體的調(diào)控機(jī)制需要后續(xù)從細(xì)胞和分子水平進(jìn)一步證實(shí)。

除此以外,IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9等都是哮喘炎癥反應(yīng)中重要的促炎因子。IL-1β、IL-4、IL-5、IL-9 都是由單核-巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,可以促進(jìn)Th2 細(xì)胞分化,刺激嗜酸粒細(xì)胞增殖、活化,進(jìn)而分泌多種炎癥介質(zhì)引起氣道慢性炎癥[14]。但是本項(xiàng)研究中并未發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-4與哮喘患者炎癥表型有關(guān),可能由于穩(wěn)定期哮喘患者M(jìn)A 型和NA 型較為少見,導(dǎo)致納入研究的患者人數(shù)太少有關(guān)。但是MA 型患者血清IL-5水平明顯高于其他3種類型患者,且與痰嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)。據(jù)推測可能由于IL-5對(duì)嗜酸粒細(xì)胞的刺激和活化作用可能是特異性的,對(duì)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞并沒有趨化影響。另外,IL-9屬于一類多效性細(xì)胞因子,可以促進(jìn)肥大細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞的分化和成熟,對(duì)嗜酸粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的作用較弱。IL-6和IL-8是由單核/巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等產(chǎn)生的、常見的經(jīng)典的炎癥介質(zhì),對(duì)白細(xì)胞有極強(qiáng)的趨化、聚集活性,可顯著誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的吞噬、脫顆粒等作用[15]。在本項(xiàng)研究中,我們也發(fā)現(xiàn),IL-6、IL-8水平與中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān),但是與嗜酸粒細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)?？赡苡捎贗L-6、IL-8可促使巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致巨噬細(xì)胞對(duì)嗜酸粒細(xì)胞的吞噬能力增加。

綜上所述,哮喘患者在穩(wěn)定期時(shí)血清sCD163水平較健康志愿者明顯升高,可能參與了哮喘的發(fā)病過程,并且與炎癥細(xì)胞和炎性介質(zhì)之間存在一定關(guān)聯(lián)。但是不同炎癥表型的哮喘患者其炎癥細(xì)胞和炎性介質(zhì)的水平也存在較大差異,血清sCD163在EA 患者中表達(dá)水平相對(duì)較低,因此更傾向于抑制氣道內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞性的炎性介質(zhì)浸潤,為進(jìn)一步研究巨噬細(xì)胞及其他炎癥細(xì)胞在哮喘中的作用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突