方格星蟲纖溶酶抗血栓作用研究

黃曉亮,李福森,陳銘潔,謝國濤,蒙湄方,李映新

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,廣西南寧 530021)

方格星蟲(Sipunculusnudus)亦稱光裸方格星蟲,俗稱“沙蟲”,為星蟲動(dòng)物門(Sipuncula)、星蟲綱(Sipunculidea)、方格星蟲屬(Sipunculus),其中以廣西北部灣海域的自然資源最豐富。方格星蟲營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)脆嫩、鮮美甘甜,有滋陰降火之功效,東南沿海居民稱其為“海洋冬蟲夏草”,具有藥食兩用的價(jià)值[1-3]。過去國內(nèi)外研究方格星蟲主要集中在生長、生殖、生理、生態(tài)等方面,藥用價(jià)值的研究較少,但近幾年來,關(guān)于其有效成分及藥理作用的報(bào)道也逐年增加。目前主要發(fā)現(xiàn)方格星蟲富含多糖、多肽等成分,具有抗疲勞、抗氧化、抗病毒、提高免疫力等藥理活性[4-5]。

方格星蟲纖溶酶(SNFE)是本課題組從方格星蟲內(nèi)臟中提取分離的一種絲氨酸蛋白酶(專利號(hào):ZL201010210919.5),相對(duì)分子質(zhì)量33.25 kD,在對(duì)其開展的一系列研究中發(fā)現(xiàn),SNFE兼具激酶及直接溶解纖維蛋白的活性,在體外具有良好的溶栓和抑制二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)的血小板聚集作用,在體內(nèi)能延長小鼠的出血時(shí)間和凝血時(shí)間,顯示其在抗血栓方面具有良好的研究和應(yīng)用前景[6-8]。

角叉菜膠誘導(dǎo)的鼠科動(dòng)物血栓模型是研究抗栓藥物常用的一種動(dòng)物模型,利用角叉菜膠強(qiáng)烈的致炎作用刺激炎癥因子釋放從而損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,進(jìn)而破壞正常血管內(nèi)皮維持凝血和纖溶的動(dòng)態(tài)平衡的功能引發(fā)血栓[9-10]。該實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)簡單,且血栓出現(xiàn)在尾部,易于觀察和測(cè)量,適合對(duì)血栓形成或者溶解過程的動(dòng)態(tài)觀察[11-12]。

本文通過在體外測(cè)定SNFE對(duì)花生四烯酸(AA)誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制率,在體內(nèi)建立角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠靜脈血栓模型,觀察SNFE對(duì)黑尾發(fā)生率、黑尾相對(duì)長度以及對(duì)凝血四項(xiàng)指標(biāo),即血漿凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)以及纖維蛋白原(FIB)的影響,初步評(píng)價(jià)SNFE的抗血栓用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

8周齡SPF級(jí)SD大鼠(體重(200±20) g,雌雄不限)、4周齡SPF級(jí)昆明小鼠(體重(20±2) g,雄雌各半) 動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(桂)2014-0002,動(dòng)物使用許可證:SYXK(桂)2014-0003,廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;花生四烯酸(100 mg)、角叉菜膠(25 g) Sigma公司,阿司匹林腸溶片 亞寶藥業(yè);凝血酶原時(shí)間(PT)測(cè)定試劑盒、活化部分凝血酶時(shí)間(APTT)測(cè)定試劑盒、凝血酶時(shí)間(TT)測(cè)定試劑盒、纖維蛋白原(FIB)測(cè)定試劑盒 上海太陽生物技術(shù)有限公司。

ME204E電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;560CA全血小板聚集儀 美國Chrono-Log公司;MC-100血凝儀 德國美創(chuàng)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SNFE的提取及活性測(cè)定 提取方法參照文獻(xiàn)[6],酶活力測(cè)定按照纖維蛋白平板法,以尿激酶為對(duì)照,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,Y(溶酶圈面積)=0.0012X(酶活力)+0.5667(r=0.9986),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力為50 IU/mg。SNFE凍干粉存于-20 ℃冰箱保存,臨用前根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需濃度用生理鹽水配制使用。

1.2.2 SNFE對(duì)花生四烯酸誘導(dǎo)血小板聚集的影響 大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈采血,全血用枸櫞酸鈉抗凝并以800 r/min離心10 min,吸取上層血漿為富血小板血漿(PRP),繼續(xù)以3000 r/min離10 min,取上層液為貧血小板血漿(PPP)。在測(cè)試杯中加入攪拌珠、280 μL的PRP及高、低濃度的10 μL SNFE溶液;陽性對(duì)照組以等體積的阿司匹林溶液(0.50 mg/mL)加入;空白對(duì)照組以等體積的生理鹽水加入。孵育3 min后,放入測(cè)試通道,加10 μL的花生四烯酸(AA)至終濃度為0.2 mmol/L,PPP調(diào)零并用血小板聚集儀測(cè)定空白對(duì)照管和給藥管血小板5 min內(nèi)的最大聚集率(PAGM),每個(gè)濃度設(shè)5管平行對(duì)照。并按下述公式計(jì)算藥物對(duì)血小板聚集的抑制率(AIP)。

AIP(%)=(PAGM空白對(duì)照組-PAGM給藥組)/PAGM空白對(duì)照組×100

1.2.3 SNFE對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)血栓的影響 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后,隨機(jī)分成空白組、模型組、阿司匹林組(10 mg/kg)、SNFE低劑量組(4000 IU/kg)、SNFE高劑量組(8000 IU/kg),每組10只。除給藥組外,空白組和模型組給予生理鹽水,按照0.2 mL/10 g的容積每天上午灌胃給藥一次,每7 d稱體重一次并調(diào)整給藥量。灌胃第12 d,除空白組外,腰背部皮下按照0.1 mL/10 g注射0.8%角叉菜膠。繼續(xù)給藥2 d,在此期間觀察造模后24及48 h形成黑尾情況(尾靜脈血栓造模成功的判定方法:尾部形成暗紅色血栓),記錄形成黑尾的小鼠只數(shù),并用直尺測(cè)量鼠尾長度及血栓的長度(從鼠尾末端到形成暗紅色血栓前沿的長度),按照血栓形成相對(duì)長度=尾部血栓長度/鼠尾長度,計(jì)算小鼠血栓形成相對(duì)長度。末次藥后2 h行拔眼球采血0.5～0.8 mL,用3.8%枸櫞酸鈉抗凝(9∶1)處理,3000 r/min 離心15 min,取上層血漿。按照試劑盒說明,采用全自動(dòng)血凝儀測(cè)定血漿凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)及纖維蛋白原(FIB)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 SNFE對(duì)花生四烯酸誘導(dǎo)血小板聚集的影響

AA途徑是血小板聚集的三個(gè)途徑之一,表1結(jié)果表明,與空白組比較,SNFE高、低劑量組均能降低AA誘導(dǎo)的血小板5 min內(nèi)最大聚集率,且高劑量組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),低劑量組SNFE雖然也有抑制作用,但效果不顯著,說明SNFE和納豆激酶一樣[11],對(duì)AA誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制作用具有一定量效關(guān)系。環(huán)氧化酶抑制劑阿司匹林直接阻斷AA途徑,效果最為顯著,高于SNFE組的抑制效果(P<0.01),推測(cè)可能是因?yàn)镾NFE對(duì)AA途徑的作用是間接作用而非直接作用。

表1 SNFE對(duì)AA誘導(dǎo)血小板聚集率的影響(n=5)Table 1 Effect of SNFE on plateletaggregation induced by AA(n=5)

2.2 SNFE對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠尾靜脈血栓的影響

注射角叉菜膠24 h后,僅個(gè)別小鼠尾巴尖部開始有約0.3～0.5 cm暗紅色血栓形成,大部分小鼠沒有黑尾出現(xiàn),故未做統(tǒng)計(jì)。48 h后,注射角叉菜膠的各組大部分均出現(xiàn)從尾尖到尾根延伸的不同長度黑尾,界限明顯,通過直尺直接體表測(cè)量可知血栓長度。其中模型組和SNFE低劑量組的黑尾發(fā)生率(即每組發(fā)生黑尾的小鼠只數(shù)/每組小鼠總只數(shù))為90%,SNFE高劑量組的黑尾發(fā)生率降低至60%;模型組的黑尾相對(duì)長度最長,SNFE高、低劑量組均有不同程度降低,但僅高劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),結(jié)果見表2。

表2 SNFE對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的血栓形成的影響(n=10)Table 2 The effect of SNFE on carrageenaninduced tail-thrombus mice(n=10)

2.3 角叉菜膠致血栓小鼠凝血功能的影響

造模48 h后,模型組小鼠的PT、APTT、TT縮短,與空白組比較,有顯著差異(P<0.05);模型組FIB含量增加,但與空白組比較無顯著差異(P>0.05)。SNFE高、低劑量組的PT、APTT、TT在數(shù)值上均比模型組增加,FIB含量減少,但僅高劑量組的APTT、TT的延長有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或0.05);與空白組比較,SNFE各劑量組APTT以及高劑量組TT無顯著差異(P>0.05),說明SNFE可以使血栓小鼠的部分凝血功能指標(biāo)恢復(fù)正常水平,結(jié)果見表3。

表3 SNFE對(duì)角叉菜膠致血栓小鼠凝血功能的影響(n=10)Table 3 Effect of SNFE on the blood coagulation function of carrageenan-induced thrombosis mice(n=10)

2.4 對(duì)小鼠體重的影響

如表4,喂養(yǎng)14 d內(nèi),各組小鼠飲食及活動(dòng)均正常,無死亡,平均體重均處于逐日增長的狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)分組前,各組小鼠體重?zé)o顯著差異(P>0.05);喂養(yǎng)7 d后的SNFE高劑量組與同期空白組、模型組的體重比較顯著增加(P<0.05)。14 d后的SNFE各組小鼠體重均比同期空白組、模型組的體重顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)增加,說明SNFE對(duì)小鼠有增加體重的作用,其機(jī)理有待研究。

表4 SNFE對(duì)小鼠體重的影響(n=10)Table 4 Effects of SNFE on weights of mice(n=10)

3 討論與結(jié)論

血栓是血液成分在流動(dòng)過程中,在血管或心臟內(nèi)膜表面形成一種半凝塊狀物質(zhì),由不溶性纖維蛋白、沉積的血小板、積聚的白細(xì)胞和陷入的紅細(xì)胞組成。在可變的流體依賴型中,血栓血液中存在相互拮抗的凝血系統(tǒng)和纖維蛋白溶解系統(tǒng)(即抗凝血系統(tǒng))。在正常的生理狀態(tài)下,凝血系統(tǒng)和抗凝血系統(tǒng)保持著動(dòng)態(tài)平衡,即保證血液有潛在的凝固性又保證了血液的流體狀態(tài)。但是,當(dāng)在某些因素作用下,打破了凝血系統(tǒng)和抗凝血系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡,觸發(fā)了凝血過程,血液便在心血管腔內(nèi)凝固,從而形成血栓[12]。因此,血栓的形成與凝血系統(tǒng)和纖維蛋白溶解系統(tǒng)密切相關(guān),許多抗血栓藥物不是具備抗凝血作用,便是具有纖維蛋白溶解活性,而血小板的活化、黏附、聚集是血栓形成的重要步驟[13]。因此,本文首先研究SNFE在體外對(duì)花生四烯酸(AA)誘導(dǎo)血小板聚集的抑制作用,繼而建立血栓模型,測(cè)定SNFE對(duì)凝血系統(tǒng)的影響。

花生四烯酸(AA)是除了ADP外常用的血小板聚集誘導(dǎo)劑,它經(jīng)環(huán)氧化酶途徑在血栓素合成酶作用下生成的代謝產(chǎn)物血栓素A2(TXA2)是血小板強(qiáng)烈的促聚劑[14],而阿司匹林可通過抑制血小板環(huán)氧化酶-1,抑制花生四烯酸的代謝,使TXA2生成減少而抗血栓。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SNFE在體外有抑制AA誘導(dǎo)的血小板聚集作用,但該作用弱于阿司匹林,估計(jì)是SNFE間接影響了AA代謝過程的某個(gè)環(huán)節(jié),有待于后續(xù)實(shí)驗(yàn)給予明確。

角叉菜膠誘導(dǎo)的鼠類血栓模型是研究抗血栓藥物常用模型,其疾病機(jī)理主要利用角叉菜膠的強(qiáng)致炎作用及鼠尾血液循環(huán)較差的特點(diǎn),該實(shí)驗(yàn)不需要進(jìn)行手術(shù)從而避免對(duì)動(dòng)物造成傷害,適用于飲食或預(yù)防性的血栓治療效果觀察[15-17]。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),溫度對(duì)模型成功與否有很大影響,使小鼠處于20 ℃的空調(diào)環(huán)境下,能夠容易形成血栓,而高溫不利于血栓出現(xiàn),可能是由于低溫使尾部血液更易于循環(huán)不暢造成血栓。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M黑尾發(fā)生率為90%,說明造模是成功的,但血栓在造模后48 h才明顯,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[18],濕度對(duì)模型成栓也有很大影響,本實(shí)驗(yàn)成栓時(shí)間晚可能與實(shí)驗(yàn)期間處于夏季高溫,環(huán)境濕度較小有關(guān)。SNFE高劑量組預(yù)防性給藥后造模,黑尾發(fā)生率和黑尾相對(duì)長度均比模型組降低,說明SNFE有一定的抑制血栓形成的作用。

為了探討抗血栓的作用機(jī)理,本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了凝血系統(tǒng)功能指標(biāo),凝血四項(xiàng)即PT、APTT、TT、FIB是檢測(cè)凝血系統(tǒng)功能是否正常最常用的敏感而重要的指標(biāo)。PT和APTT分別反應(yīng)外源性、內(nèi)源性凝血系統(tǒng)狀況(凝血因子含量及活性改變);TT反應(yīng)共同凝血途徑中,纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白的時(shí)間,由于纖維蛋白原的降解產(chǎn)物FDP能使TT延長,因此TT也作為纖溶系統(tǒng)的篩選實(shí)驗(yàn);FIB反應(yīng)纖維蛋白原的含量,而纖維蛋白原是血液中含量最高的凝血蛋白,影響血液的黏度并作為凝血因子直接參與凝血過程[19]。本實(shí)驗(yàn)中,SNFE高劑量組能使APTT、TT延長,甚至使模型小鼠的部分指標(biāo)恢復(fù)正常水平,說明SNFE抑制角叉菜膠誘導(dǎo)的血栓形成作用與影響內(nèi)源性凝血系統(tǒng)及延長纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白的時(shí)間有關(guān)。SNFE灌胃2周不僅沒有影響小鼠體重增長,反而增長比模型組及空白組快,具體機(jī)制還有待于實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述,SNFE體外抑制AA誘導(dǎo)的血小板聚集并且預(yù)防性給藥能抑制角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠血栓形成,其作用機(jī)制與影響內(nèi)源性凝血系統(tǒng)及延長纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白的時(shí)間有關(guān),其他作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入探討。