竹葉提取物對(duì)肉雞早期血液生化和機(jī)體抗氧化功能的影響

沈明明,賈明輝,謝澤晨,李安祺,韓紅麗,王 恬,張莉莉

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

氧化還原狀態(tài)的平衡是肉雞機(jī)體健康發(fā)育的基礎(chǔ),在正常生理?xiàng)l件下,機(jī)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)可以維持活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)產(chǎn)生和消除的平衡。然而,現(xiàn)代肉雞生產(chǎn)中存在許多應(yīng)激因素,如免疫應(yīng)激、熱應(yīng)激、運(yùn)輸應(yīng)激等,這些都會(huì)導(dǎo)致機(jī)體氧化還原狀態(tài)失衡[1]。肉雞機(jī)體抗氧化系統(tǒng)無法消除過量的ROS或RNS,導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)受損,引起脂質(zhì)過氧化物丙二醛產(chǎn)生,進(jìn)一步造成組織損傷,肉品質(zhì)變差,生長(zhǎng)發(fā)育受阻等等[2]。此外,雞肉中不飽和脂肪酸較高,相比其他肉產(chǎn)品更容易受到氧化,因而現(xiàn)代畜牧生產(chǎn)中基礎(chǔ)日糧中添加天然或合成的抗氧化劑來提高機(jī)體抗氧化能力。然而,消費(fèi)者對(duì)動(dòng)物食品中使用合成抗氧化劑的安全性提出了質(zhì)疑。因此,飼料添加天然植物提取物來提高動(dòng)物機(jī)體抗氧化能力,以期改善肉雞健康并為人類提供安全放心肉產(chǎn)品在現(xiàn)代肉雞生產(chǎn)中引起了極大的關(guān)注。

竹子廣泛分布于世界各地,竹葉在我國(guó)有悠久的藥用和食用歷史,是一味著名的清熱解毒藥。竹葉成分復(fù)雜,隨著研究的深入,科研工作者在竹葉成分的提取與工藝優(yōu)化方面取得一定的進(jìn)展[3-5]。張英[6]結(jié)合竹葉中黃酮類化合物存在的特點(diǎn),開發(fā)出富含黃酮、多酚和多糖等生物活性成分的竹葉提取物(Bamboo leaf extract,BLE)。近些年,人們?cè)谥袢~提取物的生物學(xué)功能方面做了大量研究。王媛媛等[7]和倪向梅等[8]研究報(bào)道竹葉提取物具有優(yōu)良的抗菌、抑菌活性,在低濃度下仍然有效抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌增殖。此外,竹葉提取物還具有優(yōu)良的抗氧化功能。體外試驗(yàn)表明,竹葉提取物可有效清除自由基,減少低密度脂蛋白氧化,抑制過渡態(tài)金屬離子和自由基誘導(dǎo)的高聚物的惡化[9]。同樣有研究報(bào)道竹葉提取物對(duì)超氧陰離子自由基、羥自由基和有機(jī)自由基均有超強(qiáng)的清除作用,可作為天然抗氧化劑開發(fā)利用[10-12]。體內(nèi)研究表明竹葉提取物可提高機(jī)體抗氧化酶表達(dá),減少脂質(zhì)過氧化,緩解乙醇誘導(dǎo)的急性胃粘膜損傷[13]。此外,竹葉提取物可提高肝糖原含量,降低天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性和丙二醛含量,降低CCl4誘導(dǎo)的肝損傷作用[14]。竹葉提取物同時(shí)具有防腐、降脂、抗衰老作用,目前竹葉提取物已被廣泛利用到保健品、藥品和化妝品等領(lǐng)域,但關(guān)于竹葉提取物在畜牧生產(chǎn)中的研究比較少,而竹葉提取物作為食品添加劑在體內(nèi)抗氧化機(jī)理更未見報(bào)道,因此,本研究以白羽肉雞為動(dòng)物模型,在日糧中添加竹葉提取物,研究其作為食品添加劑對(duì)機(jī)體健康狀態(tài)及抗氧化能力的影響,為竹葉提取物作為抗氧化劑在食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

愛拔益佳(Arbor Acres,AA)肉雞,1日齡,雄性,256只 安徽和威集團(tuán);竹葉提取物(Bamboo leaf extract) 有效成分:總黃酮含量70 mg/g,總多酚含量50.42 mg/g,浙江新篁生物技術(shù)有限公司;總膽固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Alanine transaminase,ALT)、總蛋白(Total protein,TP)、血糖(Glucose,GLU)、尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)試劑盒 上?？迫A生物工程有限公司;總抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性、丙二醛(Malondialdehyde,MDA) 南京建成生物工程研究所。

Model PRO 200 double insulated勻漿機(jī) 美國(guó)Pro-Science公司;VITALAB Selecta E 全自動(dòng)生化分析儀 荷蘭MERK公司;B10-RAD680酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與日糧配方設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用隨機(jī)單因子實(shí)驗(yàn),選擇體重相近、1日齡的AA雄性肉雞256只,隨機(jī)分為4組,每組8個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)8只雞。試驗(yàn)周期為21 d。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧,樣品組在每千克基礎(chǔ)日糧中分別添加0.10%、0.20%和0.40% 竹葉提取物。試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧配方參照NRC1994《家禽的營(yíng)養(yǎng)需要量》,日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)成分表Table 1 Basic diet formula and nutrient composition list

1.2.2 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)雞在室內(nèi)同一飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下進(jìn)行,采用3層疊籠飼養(yǎng)。試驗(yàn)前對(duì)育雛舍及器具進(jìn)行消毒。每日喂料2次,持續(xù)光照,試驗(yàn)期內(nèi)自由采食和飲水。飲水器與料槽每日清洗1次,肉雞免疫接種與雞舍消毒均按常規(guī)進(jìn)行。

1.2.3 樣品采集 試驗(yàn)第21 d每個(gè)重復(fù)取1只肉雞(體重接近該重復(fù)平均體重)頸靜脈采血,4 ℃、3500 r/min離心10 min制備血清,血清置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ怆u放血致死后剖開腹腔,取肝臟和胸肌組織于凍存管中保存在液氮中備用。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定

1.2.4.1 血清生化測(cè)定 取保存于-20 ℃的血清,4 ℃解融后利用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定TC、TG、TP、GLU、BUN含量和AST、ALT活力。

1.2.4.2 抗氧化指標(biāo)測(cè)定 取保存于液氮中的肝臟組織0.5 g加入4.5 mL 0.9%生理鹽水在冰水浴條件下利用勻漿,制備20%組織勻漿液(肌肉勻漿液制備同肝臟);隨后勻漿液在4000 r/min條件下離心10 min,取上清液,迅速保存在-20 ℃。主要測(cè)定血清、肝臟和肌肉中MDA和GSH含量,測(cè)定血清、肝臟和肌肉中T-SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性,以及T-AOC活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用完全隨機(jī)化設(shè)計(jì),以重復(fù)為實(shí)驗(yàn)單位。所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016進(jìn)行初步處理,采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),LSD進(jìn)行多重比較,以P<0.01為差異極顯著,P<0.05為差異顯著判斷標(biāo)準(zhǔn),數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹葉提取物對(duì)肉雞早期血液生化的影響

丁紅秀等[15]和付彥君等[16]研究證實(shí)竹葉提取物可降低高脂血癥小鼠血清膽固醇水平。大量研究證實(shí)植物源性黃酮、多酚類物質(zhì)具有降脂和降膽固醇作用,例如染料木黃酮[17]和山楂葉黃酮[18]均可以改善肉雞脂代謝和膽固醇代謝來降低血清TC 和TG 含量。由表2可知,與對(duì)照組相比,添加0.10%、0.20%和0.40%竹葉提取物對(duì)肉雞前期血清中TC 含量分別降低了3.28%、17.01%和9.55%,其中0.2% 竹葉提取物組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。本研究結(jié)果表明,添加竹葉提取物顯著降低了肉雞血清TC 含量,TG 有降低的趨勢(shì);這可能是竹葉黃酮發(fā)揮著作用。

表2 竹葉提取物對(duì)肉雞早期血液生化的影響Table 2 Effects of bamboo leaf extract on early blood biochemistry in broiler chickens at early age

家禽代謝中一項(xiàng)重要指標(biāo)是BUN,可以反映機(jī)體蛋白質(zhì)代謝和氨基酸之間的平衡狀況,同樣側(cè)面反映機(jī)體腎臟、膀胱的健康狀態(tài)。由表2可知,添加0.10%、0.20%和0.40%竹葉提取物可顯著降低肉雞前期血清中BUN含量,分別降低33.33%、37.68%和46.38%(P<0.05),0.4% 組極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。吳紅燕等[19]報(bào)道在蛋雛雞日糧中添加竹葉黃酮可顯著降低雛雞血清BUN 和尿酸含量,說明竹葉黃酮對(duì)腎臟排除代謝廢物具有一定的促進(jìn)作用。由表2可知,添加竹葉提取物對(duì)肉雞前期血清TG、ALT、AST、TP和GLU 無顯著影響(P>0.05),0.10%、0.20%和0.40%竹葉提取物對(duì)ALT有降低的趨勢(shì),分別降低4.73%、11.89%和28.11%;對(duì)TP 有升高的趨勢(shì),0.20%和0.40%添加組分別提高6.47%和8.30%。肝臟損傷時(shí),血液中AST 和ALT 會(huì)急劇升高。張師等[20]研究表明竹葉提取物可以顯著緩解肝損傷引起的小鼠血清AST 和ALT 活性的升高,本研究中,添加竹葉提取物對(duì)血清中AST 和ALT 有降低的趨勢(shì),可見竹葉提取物對(duì)肝臟具有一定的保護(hù)作用?；谝陨辖Y(jié)果可知,日糧添加竹葉提取物可提高肉雞對(duì)體內(nèi)氨基酸和氨的合成利用率,進(jìn)而促進(jìn)體蛋白合成,在一定程度上改善機(jī)體氨基酸代謝。

2.2 竹葉提取物對(duì)肉雞早期機(jī)體抗氧化能力的影響

在動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞中,ROS不斷地通過酶促反應(yīng)和非酶促反應(yīng)產(chǎn)生,每日約有1%～3%的攝入氧被轉(zhuǎn)化為超氧陰離子及其衍生物[21]。ROS會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞內(nèi)幾乎所有的大分子物質(zhì)如DNA、蛋白質(zhì)和脂類等的結(jié)構(gòu)和功能造成損傷并且引起一系列的氧化應(yīng)激疾病。正常生理?xiàng)l件下,動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的ROS水平會(huì)被維持在極低的無害水平,然而現(xiàn)代集約化畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)激因子往往使機(jī)體產(chǎn)生大量的自由基,導(dǎo)致機(jī)體氧化還原狀態(tài)失衡,進(jìn)一步引發(fā)各種生理疾病。

T-AOC是衡量機(jī)體或組織整體抗氧化能力的指標(biāo),反映體內(nèi)氧化物和抗氧化物質(zhì)的平衡狀態(tài)。由表3～表5可知,竹葉提取物對(duì)肉雞早期肌肉和肝臟T-AOC無顯著影響,但0.10%、0.20%和0.40%竹葉提取物組血清T-AOC分別提高了10.28%、13.83%和4.08%,基于此結(jié)果推測(cè)添加竹葉提取物對(duì)肉雞整體抗氧化狀態(tài)有一個(gè)相對(duì)的提高。

表3 竹葉提取物對(duì)肉雞早期胸肌抗氧化能力影響Table 3 Effects of bamboo leaf extract on antioxidant capacity of breast meat in broiler chickens at early age

表5 竹葉提取物對(duì)肉雞早期血清抗氧化能力的影響Table 5 Effect of bamboo leaf extract on serum antioxidant capacity in broiler chickens at early age

CAT、SOD和GSH-Px是體內(nèi)重要的抗氧化物酶。CAT可以催化過氧化氫分解,減少體內(nèi)羥自由基的產(chǎn)生;GSH-Px可以清除細(xì)胞代謝過程中脂質(zhì)過氧化物和羥自由基,可減少細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸的過氧化作用[22]。SOD是細(xì)胞內(nèi)重要的超氧離子清除酶,對(duì)于維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用。據(jù)報(bào)道竹葉提取物具有類SOD活性[23],日糧添加竹葉提取物使肉雞前期胸肌、肝臟和血清SOD有升高的趨勢(shì)。由表3～表5可知,添加0.10%、0.20%和0.40%竹葉提取物對(duì)胸肌和血清中SOD分別提高11.01%、14.18%、14.05%和8.55%、4.39%、13.11%;此外,0.10%和0.20% 組對(duì)肝臟SOD活性提高3.46%、8.20%。同時(shí),竹葉提取物對(duì)肝臟和血清GSH-Px 活性具有一定的提升作用,由表4和表5可知,與對(duì)照組相比,0.10%和0.20% 竹葉提取物組對(duì)肉雞肝臟和血清中GSH-Px活性分別提高5.96%、2.81%和5.82%、4.90%;其中0.10%竹葉提取物組血清GSH-Px顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。章榮華等[24]研究表明竹葉提取物可顯著提高老齡大鼠血清中SOD和GSH-Px酶活性,可提高機(jī)體抗氧化功能,邵瑩等[25]研究證實(shí)心肌缺血-再灌注損傷小鼠補(bǔ)充竹葉提取物后,血清SOD和GSH-Px酶活性顯著提高(P<0.05),可見竹葉提取物可通過提高機(jī)體抗氧化能力達(dá)到抗炎作用。關(guān)于竹葉提取物對(duì)肉雞抗氧化物酶活性影響的研究目前尚未報(bào)道,但大量研究表明天然植物提取物,如金盞菊提取物[26]、銀杏葉提取物[27]和青蒿素[28]等具有抗氧化活性的物質(zhì)均可以提高肉雞機(jī)體SOD、GSH-Px酶活性,而本研究中日糧添加竹葉提取物并未對(duì)抗氧化酶活性產(chǎn)生顯著影響,這可能是由于試驗(yàn)前期肉雞采食量少而使得攝入體內(nèi)的竹葉提取物少導(dǎo)致的,但血清總抗氧化能力提高,說明竹葉提取物可能改善非抗氧化酶系統(tǒng)。

表4 竹葉提取物對(duì)肉雞早期肝臟抗氧化能力的影響Table 4 Effects of bamboo leaf extract on antioxidant capacity of liver in broiler chickens at early age

GSH 是體內(nèi)重要的非酶類抗氧化物質(zhì),與SOD、CAT 和GSH-Px 等共同維持機(jī)體氧化還原狀態(tài)。MDA 是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一,常用來衡量機(jī)體或組織氧化應(yīng)激程度。由表3和表4可知,與對(duì)照組相比,添加0.10%、0.20%和0.40%竹葉提取物可提高胸肌和肝臟GSH 含量,分別提高13.08%、31.22%、20.25%和1.48%、38.52%、62.22%;其中0.20%和0.40% 組肝臟GSH 含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05),本研究結(jié)果說明竹葉提取物促進(jìn)非抗氧化酶物質(zhì)合成。Elisabeth等[29]闡明許多親電子復(fù)合物包括多酚類和植物衍生類成分是Nrf2-Keap1 信號(hào)通路的觸發(fā)因子;同樣有研究證實(shí)肉雞日糧中添加植物提取物可以激活Nrf2 信號(hào)通路來促進(jìn)GSH 的合成與再生[30-31],本研究中GSH 含量有所提高可能與竹葉提取物激活該通路有關(guān)。此外,由表4和表5可知,日糧添加0.10%、0.20%和0.40%竹葉提取物使肉雞早期肝臟和血清MDA 含量分別降低11.11%、10.10%、7.07%和11.18%、14.59%和4.05%。Gong等[32]等在體外研究中證實(shí)竹葉提取物對(duì)自由基具有較強(qiáng)的清除作用,同樣有研究報(bào)道,竹葉提取物可降低心肌缺血-再灌注損傷大鼠血清MDA 含量[33]。除此之外,據(jù)報(bào)道日糧添加黃酮類或多酚植物提取物可能通過增強(qiáng)供氫能力來提高肉雞自由基清除能力,降低脂質(zhì)氧化[34],同時(shí),多酚類可有效抑制硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)的形成[35]。因此,結(jié)合本研究結(jié)果推測(cè),竹葉提取物降低機(jī)體MDA 含量可能是竹葉黃酮和多酚作用的結(jié)果。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)肉雞早期日糧中添加一定劑量竹葉提取物可以通過提高機(jī)體抗氧化物酶的表達(dá)和非酶類抗氧化物的生成來提高抗氧化能力,同時(shí)清除機(jī)體自由基減少脂質(zhì)過氧化物的生成來緩解氧化應(yīng)激,在一定程度上改善肉體機(jī)體健康狀態(tài),進(jìn)而改善雞肉品質(zhì),可作為食品抗氧化劑使用,研究成果為竹葉提取物作為抗氧化劑在食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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