清澗紅棗乳酸菌發(fā)酵飲料工藝優(yōu)化

王 鑫,馬芙俊,李雅麗,吳逸民,段盛林,王維崗,李 兵,朱守創(chuàng),*

(1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,河北邯鄲 056038; 2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京 100015; 3.功能主食創(chuàng)制與慢病營養(yǎng)干預(yù)北京市重點實驗室,北京 100015; 4.清澗北國棗業(yè)有限責(zé)任公司,陜西榆林 718300)

紅棗又名華棗,是鼠李科棗屬植物棗樹的果實,原產(chǎn)自我國,是中國北方栽培的主要品種之一[1]。陜北黃河沿岸是我國棗栽培的起源地,是陜西紅棗主要產(chǎn)區(qū)和最大優(yōu)良制干棗基地,栽培歷史悠久,品種多樣,有著“陜北大紅棗”的美譽之稱。清澗縣的土壤和氣候是紅棗天然獨厚的自然生長條件,其主栽區(qū)是以黃河兩岸和無定河兩岸為代表的縣內(nèi)東區(qū)土石山區(qū)[2]。在黃河流域地帶培育的清澗紅棗果大核小、可食部分較多、果實蛋白含量高,富含VC等多種營養(yǎng)成分,是良好的藥用和滋補品[3-6]。早在古代中國的農(nóng)書《齊民要術(shù)》中所論的42種果品中,紅棗位居榜首。古代醫(yī)書《本草綱目》中記載紅棗“熟則可食,干則可補,豐儉可以濟時,疾苦可以備藥,輔助糧食以養(yǎng)民生”,“干紅棗潤心肺、止咳、補五臟、治虛損、除腸胃癖氣”。棗還被稱為果品中的“補品王”,具有補中益氣、養(yǎng)血安神、生津補血、安中養(yǎng)脾、護肝養(yǎng)腎以及增強人體免疫力等醫(yī)療保健功能,深受消費者的喜愛[7-9]。但由于其營養(yǎng)豐富、含水量高等特點,采后極易被病原菌侵染發(fā)生軟化、酒化甚至腐爛,因其不耐貯藏,急需開展棗深加工技術(shù)、提高綜合利用價值[10-13]。

近年來,乳酸菌發(fā)酵型飲料是飲料發(fā)展的一種新趨勢,在健康需求、美味提升、消費習(xí)慣等方面都具有廣泛前景。益生菌生理功能對人體腸道功能的改善應(yīng)用和免疫調(diào)節(jié)的良好效果得到了廣泛認同,而發(fā)酵乳制品仍是當前益生菌的重要來源。我國于20世紀90年代開始研究果蔬乳酸飲料,雖時有蘋果、紅棗、核桃、南瓜、胡蘿卜等乳酸飲料的研究見諸各學(xué)術(shù)期刊,但是,乳酸發(fā)酵果蔬飲料未見全國性品牌,地方性品牌也極少?，F(xiàn)在果蔬發(fā)酵乳酸飲料還處于實驗室階段,少數(shù)申請了專利技術(shù),成果轉(zhuǎn)化不明顯[14-18]。根據(jù)棗含糖量高的特點,利用乳酸菌發(fā)酵使其中的一部分糖轉(zhuǎn)化成乳酸,控制好發(fā)酵程度,既起防腐作用,又可改善棗的風(fēng)味,得到口感獨特、營養(yǎng)豐富的發(fā)酵棗飲料。乳酸本身酸味柔和,在賦予食品酸味的同時,還有助于消化[15-17,19-22]。

此外,紅棗中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量豐富,而環(huán)磷酸腺苷(cAMP)是細胞內(nèi)參與調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝和生物學(xué)功能的重要物質(zhì),對心腦血管疾病具有良好治療效果。目前將乳酸菌復(fù)配應(yīng)用于紅棗汁發(fā)酵的飲料,在市面銷售上很少見[23-26]。因此,本研究以紅棗為原料,制備出紅棗棗清汁,通過乳酸菌發(fā)酵制備出一款風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富、活菌含量高的健康飲品,旨在提高陜北清澗紅棗的經(jīng)濟價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅棗(清澗紅棗) 市售;發(fā)酵菌種(干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌) 江蘇微康生物科技有限公司;果膠酶、纖維素酶 北京衛(wèi)諾恩生物技術(shù)有限公司;碳酸氫鈉 天津紅依食品有限公司;MRS瓊脂培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;磷酸氫二銨 江蘇克倫多食品配料有限公司;環(huán)磷酸腺苷標準品 純度≥98%,北京索萊寶科技有限公司;甲醇 色譜純,北京邁瑞達科技有限公司;磷酸二氫鉀 色譜純,上海安普實驗科技股份有限公司。

ISO9001型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;FE20型pH計 梅特勒儀器上海有限公司;PAL-1 型數(shù)顯手持式折光糖度儀 日本ATAGO;GHP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;D2010W型電動攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;LD4-40型低速離心機 北京京立離心機有限公司;HC-3618R型高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;DL-CJ2NDI型超凈工作臺 北京松聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;SPX-150B型生化培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司;LC-6AD型高效液相色譜儀 島津(香港)有限公司;VORTEX-5型漩渦混勻器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 棗清汁的制備 工藝流程:清澗紅棗(干棗)→揀選、清洗→預(yù)煮(95 ℃、10 min)→去核→加水打漿→pH調(diào)至4.5→酶解(50 ℃、1 h)→滅酶(95 ℃、10 min)→冷卻、離心分離(室溫下3000 r/min、5 min)→取上清液pH調(diào)節(jié)4.5→滅菌(95 ℃、10 min)取得清汁備用。

操作要點:挑選水分約22%～25%、無腐爛變質(zhì)、無病蟲害的干棗,用流動的清水盡可能清除掉干棗表面的雜質(zhì);紅棗與水1∶2.5 g/g在95 ℃條件下水浴10 min后去除棗核,加入預(yù)煮水進行打漿,定容紅棗與水質(zhì)量比1∶4 g/mL。用1 mol/L碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH至4.5,分別添加0.125%果膠酶和0.125%纖維素酶,50 ℃酶解1 h。升溫至95 ℃,滅酶5 min。在室溫條件下,3000 r/min離心5 min,收集上清液。用0.5 mol/L磷酸氫二銨調(diào)節(jié)pH至4.5,95 ℃條件下滅菌10 min制得清汁備用。

1.2.2 接種及發(fā)酵 在無菌條件下將供試菌種按照一定比例接入滅菌棗清汁,于37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng),觀察棗清汁在一定的初始可溶性固形物含量條件下發(fā)酵一定時間的pH及口感變化,當發(fā)酵飲料pH降到3.5時停止發(fā)酵。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 發(fā)酵時間對棗清汁pH和感官評價的影響 控制變量為接種菌種分別為干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌,接菌量均為0.01%,初始可溶性固形物含量為13.5%,按1.2.2所述的試驗方法進行棗清汁乳酸菌發(fā)酵。通過發(fā)酵時間為0、12、24、48、72、96 h,以感官評價為評價指標,考察其對紅棗乳酸菌飲料品質(zhì)的影響,確定最適發(fā)酵時間。

1.2.3.2 棗清汁初始可溶性固形物含量對發(fā)酵飲料pH的影響 控制變量為乳酸發(fā)酵飲料接種菌種分別為干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌,接菌量為0.01%,發(fā)酵時間48 h。設(shè)定棗清汁初始可溶性固形物含量為12.5%、13.5%、14.5%、15.5%,按1.2.2所述的試驗方法進行棗清汁乳酸菌發(fā)酵。

表1 發(fā)酵工藝因素水平表Table 1 Level table of fermentation process factors

1.2.3.3 發(fā)酵菌種和接種量對發(fā)酵飲料pH的影響 結(jié)合前期預(yù)實驗效果及菌種推薦接菌量,分別接種干酪乳桿菌(0.0050%、0.0075%、0.0100%)、植物乳桿菌(0.00125%、0.00250%、0.00500%)、鼠李糖乳桿菌(0.00125%、0.00250%、0.00500%);發(fā)酵時間為48 h;初始可溶性固形物含量為13.5%,按1.2.2所述的試驗方法進行棗清汁乳酸菌發(fā)酵。

1.2.4 乳酸菌發(fā)酵飲料發(fā)酵工藝正交優(yōu)化試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上進行發(fā)酵工藝L8(41×24)正交試驗,選取發(fā)酵時間、棗清汁初始可溶性固形物含量、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌菌種作為因素,發(fā)酵時間取4個水平,初始可溶性固形物含量及三個菌種各取2水平,分別以pH、感官評分為考察指標,得出棗清汁乳酸菌發(fā)酵的最佳發(fā)酵工藝條件。

1.2.5 檢測分析方法 pH:采用FE20型pH計直接測定;可溶性固形物:采用手持式折光糖度儀直接測定;乳酸菌活菌數(shù):按照GB 4789.35-2016規(guī)定執(zhí)行[27];總酸按照GB 12456-2008規(guī)定執(zhí)行(以乳酸計),采用酸堿滴定法[28];還原糖按照GB 5009.7-2016規(guī)定執(zhí)行,采用直接滴定法[29]。

1.2.6 感官評價 邀請10名感官評價者參照表2的感官評價標準,分別從色澤、口感、香氣和澄清度為評分項目,按評分要求在給定的分數(shù)內(nèi)逐項打分后,滿分為100分,四舍五入,以整數(shù)標度,取其平均值作為評分結(jié)果[30]。

表2 發(fā)酵紅棗汁的感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria of fermented jujube juice

1.2.7 HPLC測定環(huán)磷酸腺苷含量 對比清澗紅棗提取的棗清汁中環(huán)磷酸腺苷含量和正交優(yōu)化得出的清澗紅棗乳酸菌發(fā)酵飲料的環(huán)磷酸腺苷含量,考察乳酸菌發(fā)酵條件對環(huán)磷酸腺苷含量的影響,對發(fā)酵終產(chǎn)品進行評判。

1.2.7.1 環(huán)磷酸腺苷含量分析 LC-6AD高效液相色譜儀中色譜柱:XTERRA? MS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:甲醇:0.05 mol/L磷酸二氫鉀(20∶80,V/V);流速:0.5 mL/min;檢測波長為:254 nm;柱溫:40 ℃,進樣量為10 μL[31-32]。

1.2.7.2 標準系列溶液的配制 用超純水溶解配制100 μg/mL的環(huán)磷酸腺苷標準溶液,再稀釋配制成1、3、5、10、15 μg/mL標準系列溶液,取各濃度標準溶液過0.22 μm有機濾膜,待測,均臨用新配。

1.2.7.3 試樣前處理及測定 分別準確吸取1 mL棗清汁和發(fā)酵棗汁于10 mL容量瓶,用超純水定容,搖勻移至15 mL離心管,漩渦震蕩混勻,經(jīng)高速離心后過0.22 μm微孔濾膜進樣,分析測定環(huán)磷酸腺苷峰面積色譜圖,并計算出棗清汁與發(fā)酵棗汁中環(huán)磷酸腺苷含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗樣品均重復(fù)3次,結(jié)果以(平均值±標準差)的形式表示。采用Microsoft Excel和Origin 8.6軟件處理實驗數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計分析、作圖,差異顯著性分析。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵單因素實驗

2.1.1 發(fā)酵時間對乳酸菌發(fā)酵飲料pH及感官評價的影響 由圖1可知,隨著發(fā)酵時間延長,三種不同菌種發(fā)酵飲料的pH均呈現(xiàn)先快后慢的下降趨勢。植物乳桿菌在發(fā)酵前24 h,pH降低速度明顯快于其他兩菌種。但發(fā)酵至48 h,三菌種發(fā)酵飲料pH均無顯著差異。在48～96 h之間,三菌種發(fā)酵飲料pH下降速度明顯降低。分析原因可能是植物乳桿菌能高效利用棗汁中的碳源產(chǎn)酸,區(qū)別于其他兩種乳酸菌的產(chǎn)酸量比較高。結(jié)合感官評價和pH,綜合選擇發(fā)酵終止時間為48 h為宜。

圖1 發(fā)酵時間對發(fā)酵飲料pH影響Fig.1 Effect of fermentation time on pH of fermented beverage

對三種不同菌種發(fā)酵48 h發(fā)酵飲料進行感官評價,結(jié)果見表3。結(jié)果表明,干酪乳桿菌發(fā)酵飲料無論從色澤、口感、香氣、澄清度得分都很高。植物乳桿菌發(fā)酵飲料在口感、香氣、澄清度方面得分較高,但發(fā)酵飲料顏色欠佳,試驗中發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌樣品顏色暗紅,分析原因可能是植物乳桿菌菌種在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了還原性糖類物質(zhì),經(jīng)過37 ℃ 48 h培養(yǎng),發(fā)生了美拉德褐變反應(yīng)。而鼠李糖乳桿菌發(fā)酵飲料在色澤、口感、香氣方面得分均較高,但樣品澄清度欠佳。綜合分析,干酪乳桿菌菌種作為主要發(fā)酵菌種,同時復(fù)配小比例植物乳桿菌及鼠李糖乳桿菌,在保持產(chǎn)品較佳色澤及澄清度前提下使得產(chǎn)品整體風(fēng)味更加豐富飽滿。

表3 乳酸菌發(fā)酵飲料感官評價結(jié)果(分)Table 3 Sensory evaluations ofLactobacillus fermented beverage(scores)

2.1.2 棗清汁初始可溶性固形物含量對乳酸菌發(fā)酵飲料pH影響 由圖2可知,隨著棗清汁初始可溶性固形物含量提高,干酪乳桿菌發(fā)酵飲料pH變化不顯著(P>0.05)。但植物乳桿菌及鼠李糖乳桿菌發(fā)酵飲料pH呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。說明初始可溶性固形物含量過低及過高均不利于兩菌種進行發(fā)酵。綜上所述,初步篩選初始可溶性固形物含量13.5%和14.5%。

圖2 初始可溶性固形物含量對發(fā)酵飲料pH影響Fig.2 Effects of initial soluble solid contentson the pH of fermented beverage

2.1.3 發(fā)酵菌種及添加量對乳酸菌發(fā)酵飲料pH影響 由圖3可知,經(jīng)過48 h發(fā)酵,三菌種發(fā)酵飲料pH均隨菌種添加量增加而降低。干酪乳桿菌菌種添加量為0.0050%、0.0075%、0.0100%時經(jīng)過48 h發(fā)酵,發(fā)酵飲料pH分別為4.05、3.82、3.65,即干酪乳桿菌發(fā)酵飲料pH隨菌種添加量增加而顯著降低(P<0.05)。而干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌發(fā)酵飲料pH隨著菌種添加量增加沒有顯著變化(P>0.05),即植物乳桿菌與鼠李糖乳桿菌在添加量分別為0.00125%、0.00250%、0.00500%時經(jīng)過48 h發(fā)酵,發(fā)酵飲料pH差異不顯著(P>0.05)。因此,選定干酪乳桿菌添加量0.0075%和0.0100%,植物乳桿菌添加量0.00250%和0.00125%,鼠李糖乳桿菌添加量0.0025%和0.00125%作為正交實驗考察因素。

圖3 發(fā)酵菌種及添加量對發(fā)酵飲料pH影響Fig.3 Effects of fermentation strain and additionamount on pH of fermented beverage注:不同小寫字母相同菌株不同添加量水平差異顯著,P<0.05。

2.2 清澗紅棗乳酸菌發(fā)酵飲料發(fā)酵工藝正交優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行L8(41×24)正交試驗,以48 h發(fā)酵飲料pH及感官評分為指標,正交試驗結(jié)果如表4所示。

表4 正交試驗結(jié)果及極差分析Table 4 Orthogonal experimental results and range analysis

通過R值計算,以pH為考察指標時,RA>RB>RD>RE>RC,即發(fā)酵時間>初始可溶性固形物含量>植物乳桿菌添加量>鼠李糖乳桿菌添加量>干酪乳桿菌添加量,通過各因素對感官評價得分影響為RA>RC>RD=RE>RB,即發(fā)酵時間>干酪乳桿菌添加量>植物乳桿菌添加量=鼠李糖乳桿菌添加量>初始可溶性固形物含量。結(jié)合2.1.1結(jié)果,干酪乳酸菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌發(fā)酵48 h時,pH分別為3.61、3.56、3.55,此時產(chǎn)品感官得分較高。pH過高說明發(fā)酵速度太慢,pH過低口感會變差。因此選定pH在3.55～3.61范圍內(nèi)的組合為宜,即A2B1C1D2E2和A2B2C2D1E1。以感官評定得分為指標時,RA>RC>RD=RE>RB,即發(fā)酵時間>干酪乳桿菌>植物乳桿菌=鼠李糖乳桿菌>初始可溶性固形物含量,得出最佳工藝方案是A2B1C1D2E2,此時感官得分最高。結(jié)合pH和感官評定結(jié)果,得出最佳工藝方案是A2B1C1D2E2,即添加干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖的比例為6∶1∶1。

2.3 HPLC測定環(huán)磷酸腺苷含量

2.3.1 含量的測定 由圖5可以看出,環(huán)磷酸腺苷標準品保留時間是8.5 min左右,以不同標準系列濃度為橫坐標,標準系列濃度峰面積為縱坐標,繪制標準曲線結(jié)果見圖4。本測定方法的線性回歸方程為:y=24082x-5349.3,決定系數(shù)R2=0.9998。表明環(huán)磷酸腺苷標準品的濃度與峰面積良好線性關(guān)系,濃度與峰面積之間呈現(xiàn)顯著相關(guān)性。

圖4 環(huán)磷酸腺苷標準曲線圖Fig.4 Standard curve of cAMP

圖5 環(huán)磷酸腺苷標品HPLC色譜圖 Fig.5 HPLC chromatogram of standard cAMP

2.3.2 發(fā)酵前后環(huán)磷酸腺苷含量變化 由圖6、圖7可以看出,環(huán)磷酸腺苷作為棗中最具代表性的功能性成分,在棗汁發(fā)酵過程中,環(huán)磷酸腺苷含量無明顯變化差異,棗清汁發(fā)酵前含量25.3 μg/mL,發(fā)酵后環(huán)磷酸腺苷含量為21.4 μg/mL,說明本研究中復(fù)合菌種發(fā)酵的條件、微生物代謝過程等因素較好地保留了發(fā)酵棗清汁的環(huán)磷酸腺苷。

圖6 原清汁中環(huán)磷酸腺苷測定液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatograpm of cAMP in raw juice

圖7 發(fā)酵紅棗飲料中環(huán)磷酸腺苷測定液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatograpm of cAMP in fermented jujube juice

2.4 紅棗發(fā)酵飲料相關(guān)指標

測得紅棗發(fā)酵飲料pH3.61,可溶性固形物含量13.5%,乳酸菌活菌數(shù)≥1.5×108CFU/mL,總酸8.99 g/kg,還原糖10.46 g/100 g,符合國家輕工業(yè)局推薦性行業(yè)標準-果蔬發(fā)酵汁(QB/T 5356-2018)。

3 結(jié)論

試驗研究結(jié)果表明,采用干酪乳桿菌∶植物乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌=6∶1∶1 (m/m)復(fù)配發(fā)酵清澗紅棗清汁的最優(yōu)工藝為:初始可溶性固形物為13.5%,發(fā)酵溫度為37 ℃,棗清汁pH為4.5,發(fā)酵時間48 h和菌種接菌量為0.01%,在此條件下得到發(fā)酵棗清汁,各項檢測指標均符合標準QB/T 5356-2018果蔬發(fā)酵汁。通過HPLC對棗中主要營養(yǎng)成分環(huán)磷酸腺苷含量的分析,相較于發(fā)酵前的棗清汁相比,經(jīng)過復(fù)配發(fā)酵后,其主要營養(yǎng)成分得到了較好地保留。

隨著生活水平的逐漸提高,天然果蔬汁的乳酸菌發(fā)酵制品越來越受到人們的關(guān)注和喜愛。而本試驗研究利用乳酸菌復(fù)配直接發(fā)酵生產(chǎn)清澗紅棗乳酸菌飲料的工藝流程,既適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)又適合小工廠生產(chǎn),加大了清澗紅棗的基礎(chǔ)研究,具有廣闊的市場前景。