產(chǎn)絮凝劑菌株P(guān)seudoalteromonas undina JP 的表型特征及基因組學(xué)分析

王玉霞，崔 霞，周海軍，穆 軍

（浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022）

生物絮凝劑因其綠色生態(tài)，無毒無害，活性高，不會引入二次污染，且絮凝的范圍廣，與可能會引起多種環(huán)境和人類健康問題相比的無機絮凝劑和有機合成絮凝劑相比，生物絮凝劑被認為是一種環(huán)境友好型的高效絮凝劑，在污水、廢水的處理和水質(zhì)的凈化中具有很好的發(fā)展前景[1-5]。菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum 作為世界上最受歡迎的海洋雙殼類水產(chǎn)養(yǎng)殖動物之一，其產(chǎn)生的黏附污泥是一種典型的水產(chǎn)養(yǎng)殖副產(chǎn)品廢物。來自中國舟山水產(chǎn)養(yǎng)殖場的菲律賓蛤仔黏附污泥（R.philippinarum conglutination mud，RPM）被報道為一種具有前景的天然生物絮凝劑資源，研究發(fā)現(xiàn)RPM 中含有有效絮凝多糖，其共附生微生物可能是絮凝多糖的產(chǎn)生源。RPM 對不同染料溶液的脫色率均在90%以上，最大絮凝率高達91.8%[6-7]。從RPM 中分離得到的菌株最大絮凝率可達88.14%，最大脫色率可達90.02%[7-8]。

本研究從RPM 中分離篩選得到一株具有高絮凝活性的菌株JP，通過16S rDNA 測序比對、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建以及生理生化特征對其鑒定到種。然后通過Illumina 測序平臺對菌株JP 的全基因組框架進行掃描測序，將測得序列進行基因預(yù)測并注釋到COG、GO、KEGG、NR 和Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫，通過對其代謝功能的分析來揭示其產(chǎn)絮凝劑的分子機制。

1 材料和方法

1.1 產(chǎn)絮凝劑菌株JP 的來源

從具有高絮凝活性的菲律賓蛤仔黏附污泥中分離、篩選、純培養(yǎng)獲得的菌株。

1.2 絮凝率測定

菌株的絮凝率參照MU Jun,et al[6]使用的高嶺土懸浮液法進行測定。配制4 g·L-1的高嶺土懸浮液93 mL，分別加入5 mL 10 g·L-1氯化鈣溶液和2 mL 待測菌株JP 的菌懸液，調(diào)節(jié)pH 至7.5。200 r·min-1攪拌混合液1 min，然后以80 r·min-1攪拌2 min。靜置10 min 后，取液面下1 cm 處懸濁液于便攜式可見分光光度計在550 nm 吸光度下進行光密度值(OD)測定?？瞻讟悠芬? mL 去離子水代替待測樣品進行測定，絮凝率（flocculation rate，F(xiàn)R）計算公式為：

A 和B 分別為空白對照組和待測樣品組的OD550值。

1.3 生理生化性狀測定

菌株JP 的形態(tài)特征、生理生化指標、生長溫度與鹽度范圍、胞外酶活性檢測、碳源的利用測定方法參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[9]、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]以及BAUMANN,et al[11]。

1.4 16S rDNA 測序

將菌株JP 接種到液體培養(yǎng)基中恒溫25 ℃培養(yǎng)10 h 后使用TaKaRa 全基因組提取試劑盒(DNA Extraction Kit Ver.3.0)進行核酸DNA 的提取和純化。利用引物27F(5’-AGA GTTTGATCATGG CTC AG-3’)和1492R(5’-TAC GGTTACCTGTTACGACTT-3’)對菌株抽提的核酸進行PCR 擴增[12]，反應(yīng)體系終體積為20 μL，包含2.0 μL 10×Ex Taq buffer、1.6 μL 2.5 mmol·L-1dNTP mix、5p 引物27F、5p 引物1492F、0.5 μL 模板、0.2 μL Ex Taq 和14.1 μL ddH2O。擴增反應(yīng)程序如下：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，90 s，24個循環(huán)；72 ℃，10 min。擴增結(jié)果以凝膠電泳進行檢測，檢測合格后使用ABI 3730XL 測序儀進行測序，將測序后的序列進行拼接。

1.5 分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將拼接后的序列于EzBioCloud(http://www.ezbiocloud.net)進行blast 比對，將菌株鑒定到種屬水平。菌株JP 的16S rDNA 序列上傳到NCBI 數(shù)據(jù)庫，登錄號為KX702268。菌株JP 于2016 年8 月29 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.12914。選取相似比對結(jié)果中相似度高的模式菌株及外間組模式菌株通過軟件MEGA7 進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，分析其進化關(guān)系。

1.6 菌株JP 的全基因組框架掃描

將菌株JP 純培養(yǎng)后提取基因組DNA，利用1%瓊脂凝膠電泳檢測并收集抽提的DNA。對質(zhì)檢收集后的DNA 進行300～500 bp 片段化，然后使用TruSeqTMDNA Sample Prep Kit 進行文庫構(gòu)建，TruSeq PE Cluster Kit 進行橋式PCR，最后使用TruSeq SBS Kit 利用Illumina 測序技術(shù)對DNA 進行paired-end(PE)測序。將測序得到的原始數(shù)據(jù)進行有效數(shù)據(jù)的統(tǒng)計、序列拼接(SOAPdenovo v2.04 軟件)、序列矯正(GapCloser v1.12 軟件)，得到拼接后的序列，以便進行下一步分析。

1.7 生物信息學(xué)分析

對拼接后的序列進行rRNA/tRNA 的查找(RNAmmer-1.2 和tRNAscan-SE v1.3.1 軟件)、串聯(lián)重復(fù)序列預(yù)測(http://tandem.bu.edu/trf/trf.basic.submit.html)[13]、插入序列預(yù)測(https://www-is.biotoul.fr/)[14]、基因的功能預(yù)測(Glimmer 3.02 軟件)，并將預(yù)測基因的蛋白序列與Nr、genes、string 和GO 數(shù)據(jù)庫進行blastp 比對(BLAST 2.2.28+軟件)，得到預(yù)測基因的功能注釋信息。

2 結(jié)果與討論

2.1 絮凝率、16S 序列比對結(jié)果及進化關(guān)系分析

分離純化的單菌株JP 恒溫25 ℃純培養(yǎng)10 h，測得其絮凝率為80.0%。比對結(jié)果顯示菌株JP 的16S序列與Pseudoalteromonas undina NCIMB 2128T 的序列具有100%相似性。菌株JP 的系統(tǒng)進化發(fā)育樹如圖1，低于80%的值被隱藏，由圖1 可知，菌株JP 與P.undina 聚集在一個分支。

菌株的生理生化指標測定結(jié)果見表1。由表1 可知，菌株JP 為桿狀菌，革蘭氏陰性菌，具有極性鞭毛；生長鹽度耐受范圍與模式菌株相比，由1%～12%提升到了15%；高溫不耐受，37 ℃無法生長；能產(chǎn)生酶有淀粉酶、幾丁質(zhì)酶、精氨酸和酪氨酸；能利用葡萄糖、麥芽糖，而阿拉伯糖、半乳糖、蜜二糖、乳糖、甘露醇、山梨糖醇、檸檬酸鹽、木糖均無法利用。與模式菌株的理化特征比對，結(jié)合16S 序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，菌株JP 被鑒定為P.undina。

表1 菌株JP 的生理生化特征測定結(jié)果Tab.1 The results of biochemical tests of strains JP

2.2 菌株JP 的基因組基本特征

為了深入研究RPM 共附生微生物-產(chǎn)絮凝劑微生物的產(chǎn)絮凝劑分子機制，本研究利用Illumina 技術(shù)對菌株JP 的基因組進行了框架掃描測序，序列拼接為20 個大框架序列，總長度為4 046 116 bp，其中18 個框架序列長度大于1 000 bp，最長框架為885 303 bp，框架N50 為480 011 bp，N90 為113 970 bp，GC 含量為40。將菌株JP 拼接后的序列進行與基因預(yù)測，包含14 個rRNA、87 個tRNA 和3 746 個基因。

2.3 重復(fù)序列預(yù)測

通過TRF(tandem repeat finder)對菌株JP 的基因組進行串聯(lián)重復(fù)序列的在線預(yù)測，共預(yù)測到111 條串聯(lián)重復(fù)序列，44.1%的序列匹配分值為50～100，37.8%的序列匹配分值為101～500，其余匹配分值大于500，表明菌株JP 的基因組中多存在短串聯(lián)重復(fù)序列。通過IS Finder 對菌株JP 的插入序列進行在線預(yù)測，24條潛在的插入序列被篩選出，篩選結(jié)果以E-value(0.001)為標準，IS3 序列家族占絕對優(yōu)勢，僅1 條屬于IS66 家族。

圖2 菌株JP 的基因組CG 圖譜Fig.2 The CG view of P.undina JP

2.4 COG 功能分析

將注釋基因與COG 數(shù)據(jù)庫進行比對，結(jié)果表明2416 個(64.5%)基因具有COG 編號，即具有明確的生物學(xué)功能(圖3)。其中，COG 功能一級分類中參與代謝的蛋白數(shù)最多，高達1 004 個(41.6%)，其次是參與細胞內(nèi)進程和信號傳導(dǎo)功能(33.4%)，以及信息儲存和處理(21.4%)。COG 功能二級分類中，擁有最多功能基因的是類別J(翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生，9.8%)、E(氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝，9.6%)、M (細胞壁/膜/包膜生物發(fā)生，7.4%)和T(信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，7.3%)。類別Q 的功能基因僅占2.2%(次生代謝產(chǎn)物的生物合成、轉(zhuǎn)運和分解代謝)。

圖3 菌株JP 的COG 的功能分類Fig.3 The results of COG second level class in P.undina JP

2.5 GO 功能分析

GO 功能注釋結(jié)果統(tǒng)計如圖4 所示。由圖可知，61.3%(2 295)的預(yù)測基因具有GO 注釋信息。其中，在生物學(xué)過程中，細胞內(nèi)過程、單生物過程和代謝過程占優(yōu)勢；在細胞組分中，細胞部位、細胞膜部位、細胞膜和細胞是優(yōu)勢功能組；在分子功能中，結(jié)合和催化活性占絕對優(yōu)勢。菌株JP 是一株具有絮凝活性的功能性菌株，其生長繁殖代謝是重要的生命活動，其中需要大量的相關(guān)代謝、生物調(diào)控以及代謝產(chǎn)物的運輸?shù)然虮磉_，因此可以合理地解釋菌株JP 的這些功能基因表達占優(yōu)勢地位。

圖4 菌株JP 的GO 功能分類圖Fig.4 Functional classification of GO annotation in P.undina JP

2.6 KEGG 代謝通路分析

將菌株JP 基因組預(yù)測的基因序列與KEGG 數(shù)據(jù)庫進行比對，結(jié)果顯示在菌株JP 基因組中預(yù)測的3 746 個全長基因中，有2 094 個基因（55.9%)匹配到KEGG 數(shù)據(jù)庫中的基因，且在其對應(yīng)的代謝途徑上均進行了定位，共參與了193 條KEGG 的代謝途徑。其中參與代謝途徑的總共535 個基因，參與次生代謝產(chǎn)物的生物合成有240 個基因，參與不同環(huán)境的微生物代謝共有165 個基因。此外，參與碳代謝的有86 個基因，主要包含肽聚糖、脂多糖、氨基糖、核苷酸糖、淀粉、蔗糖、果糖、甘露糖的生物合成與代謝。迄今為止，對于細菌產(chǎn)絮凝劑機制的報道眾說紛紜，但其明確的絮凝基因等仍處于探索中，但是目前已有報道一些胞外絮凝劑多糖的生物合成路徑及關(guān)鍵前體的合成，如纖維素和普魯蘭多糖的合成需要先前體UDP-D-Glucose，黃原膠合成的前體為UDP-Glucose、GDP-mannose 和UDP-glucuronate，可得然膠需要先合成前體UDP-Glucose。本研究中能明確找到這些合成前體，然而關(guān)于目前已經(jīng)明確的eps 合成基因簇并未在注釋的代謝通路中尋找到，但能發(fā)現(xiàn)一些胞外多糖合成酶的關(guān)鍵調(diào)控基因，如纖維素、海藻酸鈉合成最開始需要c-di-GMP 與PilZ 的結(jié)構(gòu)域結(jié)合來激活[16-18]，銅綠假單胞菌中胞外多糖的合成受AlgR 等基因的調(diào)節(jié)[19]。也發(fā)現(xiàn)了一些目前所報道的胞外多糖聚合前的重復(fù)單元合成，如UDP-ManNAcA、dNTP-D-Glu、UDP-3-O-(3-acetyl)-GlcNAc 等，這些重復(fù)單元在相應(yīng)的聚合酶作用下聚合成多糖，多糖通過轉(zhuǎn)運系統(tǒng)等分泌到胞外，形成胞外多糖絮凝劑，使微生物具有絮凝活性[20-23]。

暫未預(yù)測到目前已報道的胞外多糖合成基因簇，有多種原因?qū)е麓私Y(jié)果：一是目前關(guān)于P.undina產(chǎn)絮凝劑這一特征是本實驗室首次研究報道的功能菌株，國內(nèi)外研究者對于該菌種的研究呈現(xiàn)明顯的不足；二是由于考慮到研究原因，并未對菌株JP 進行完整的基因組測序，僅對框架進行掃描，框架之間斷開的序列有可能具有功能基因，因此造成數(shù)據(jù)的部分缺失；三是目前關(guān)于微生物產(chǎn)絮凝劑的合成路線仍處于探索階段，其中的原理與機制大量缺乏，因此造成本研究菌株中預(yù)測不到胞外多糖的合成基因簇；四是該菌株具有類似eps 基因簇的基因所合成的產(chǎn)物承擔該功能。

2.7 NR 功能分析

將菌株JP 組裝后預(yù)測的基因注釋到NR 數(shù)據(jù)庫，97.5%（3 653）的預(yù)測基因在NR數(shù)據(jù)庫具有匹配信息。結(jié)果表明24.6%的E 值位于1×10-180～1×10-100，13.7%位于1×10-100～1×10-50，3.9%位于1×10-50～1×10-30，4.1%位于1×10-30～1×10-5；注釋信息表明79.0%的基因序列具有100%的相似性，20.0%的相似性集中在80%～99%，其中97.8%的預(yù)測基因與Pseudoalteromonas sp.有相似的同源序列，其中35.2%（相對于注釋到Pseudoalteromonas sp.中相似基因的百分比，下同)的預(yù)測基因與P.undina 相似，20.2%的預(yù)測基因與P.tetraodonis相似。菌株JP 與P.undina 同屬一個物種，且與其余3 個物種分類學(xué)地位相近因此大部分基因功能相似是合理的。

2.8 Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫注釋

將菌株JP 的預(yù)測基因注釋到Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫，2 540 個基因在該數(shù)據(jù)庫有注釋信息，占總基因數(shù)的67.8%。對E 值分布進行統(tǒng)計，5.9%基因的E 值位于1×10-10～1×10-5，24.1%位于1×10-30～1×10-5，13.5%位于1×10-50～1×10-30，24.1%位于1×10-100～1×10-50，19.8%位于1×10-180～1×10-100。1.1%的基因序列具有100%的相似性，26.6%的相似性集中在80%～99%，35.3%相似性為60%～79%，24.6%相似性為50%～59%。

2.9 次級代謝產(chǎn)物合成基因簇

通過antiSMASH 對菌株JP 的序列進行次級代謝產(chǎn)物合成基因簇預(yù)測，分別在JP_scaffold2 和JP_scaffold4 序列中各預(yù)測到一個基因簇，分別為鐵載體（siderophore)和細菌素（bacteriocin)合成基因簇。

3 結(jié)論

從RPM 中分離篩選的高絮凝活性菌株JP 通過16S 測序和生理生化指標測定鑒定為P.undina，絮凝活性達到80.0%。通過一系列的預(yù)測對菌株JP 的基因組進行了初步分析，一共預(yù)測到了87 個tRNA，14個rRNA，111 條串聯(lián)重復(fù)序列，24 條插入序列，3 746 個基因和2 個次級代謝產(chǎn)物合成基因簇。將預(yù)測的基因進行數(shù)據(jù)庫的注釋，64.5%、61.3%、55.9%、97.5%、67.8%的基因分別在數(shù)據(jù)庫COG、GO、KEGG、NR 和Swiss-Prot 匹配到了相應(yīng)的注釋信息。盡管沒有注釋到一個完整的與目前所報道的胞外多糖代謝路徑一致的，這也有可能是目前這一類研究領(lǐng)域數(shù)據(jù)大量缺乏的原因，如果需要進一步探索菌株的代謝通路，未來還需要更深入的分子水平研究。