復方中藥提取液對家兔血液動力學效應影響的研究

■王小玉 紀康華 郭云霞 郝慶紅 王圣贊 吳國江

（河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河北保定071000）

血液凝固性增加，血小板的聚集與黏附均會影響血流動力學效應。從古至今，在中醫(yī)藥針對心腦血管性疾病的實踐總結中，我們發(fā)現(xiàn)這些研究中積累了許多改善血流狀態(tài)的珍貴經(jīng)驗。有研究表明[5]，丹參能夠通過下調(diào)凝血系統(tǒng)活性[6]和上調(diào)纖溶系統(tǒng)活性[7]維持凝血與纖溶系統(tǒng)的平衡。除此之外，還能夠抑制血小板聚集與黏附[8]，改善血流速度[9]。多項研究表明[10]，三七能夠降低血液黏度，改善內(nèi)皮功能[11]，抑制血小板活化[12]，提高纖溶活性[13]，減少凝血因子含量[14]。而黃芪也有實驗證明[15]，能夠改善內(nèi)皮素-1（ET-1）引發(fā)的血管收縮[16]，抑制血小板聚集[17]，保護血管內(nèi)皮細胞[18]。

本研究以家兔為試驗動物，將丹參、三七與黃芪按2∶1∶10 比例聯(lián)用，通過考察AT-Ⅲ、PC、ET-1、t-PA、TXB2、和PF4 等指標，探討復方中藥提取液對改善血流動力學效應的作用效果，為養(yǎng)殖業(yè)中經(jīng)常發(fā)生血管損傷的防治提供適宜藥物及最佳劑量。

1 材料

1.1 試驗動物

25只健康成年家兔2.0～2.5 kg，雌雄各半，河北保定家兔養(yǎng)殖場提供。家兔在實驗室條件下，自由采食及飲水7 d。

1.2 試驗藥品及耗材

丹參、三七、黃芪，購自安國中藥材市場；20%甘露醇，購自山東齊都藥業(yè)有限公司；抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）測定試劑盒、抗凝蛋白C（PC）測定試劑盒、內(nèi)皮素-1（ET-1）測定試劑盒、組織型纖溶酶原激活物（t-PA）測定試劑盒、血栓烷素（TXB2）測定試劑盒、血小板因子4（PF4）測定試劑盒，均購自鈺博生物科技有限公司；生理鹽水，購自華裕(無錫)制藥有限公司；24G×0.75靜脈留置針，購自蘇州碧迪醫(yī)療器械有限公司。

1.3 試驗儀器

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購自上海亞榮生化儀器廠；JA2103 電子天平，購自金壇市華特試驗儀器有限公司；752型紫外-可見分光光度計，購自上海舜宇恒平科學儀器有限公司；LDZ-52普通離心機，購自北京離心機廠；DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱，購自上海飛越試驗儀器有限公司。

2 試驗方法

2.1 動物模型建立

將已在實驗室條件下適應7 d 的25 只家兔依試驗隨機分為2組，對照組（共1組）和受試組（共4組）。其中，對照組（5 只）耳緣靜脈注射復方生理鹽水（3 ml/kg），3次/d，共3 d；受試組（5只/組，共20只）分別利用靜脈留置針于耳緣靜脈注射20%甘露醇（3 ml/kg），3 次/d，共3 d。給藥3 d 后依據(jù)血液生化指標AT-Ⅲ活性和TXB2活性及肉眼觀察靜脈血管外形進行分析評價，確定造模成功。

2.2 試驗藥物準備

試驗研究依照配方組分及比例（2∶1∶10）分別稱取丹參、三七、黃芪，混合均勻用水浸泡3 h后，加至8 倍體積水，用藥鍋大火熬制至沸騰，再用小火煎熬30 min，經(jīng)紗布過濾，重復上述煎藥過程1次，最后將兩次濾液合并，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)濃縮，使藥物濃縮至生藥含量為1 g/ml，放入4 ℃冰箱中，備用。

藥物使用時，使低、中、高劑量的藥物濃度稀釋至含生藥量分別為0.2、0.4、0.8 g/ml。

孩子的個性不同，所處的年齡階段不同，對父母的需求不同，良好親子關系的格式也會有所不同。良好的親子關系表現(xiàn)為依戀不依賴，理性不冷漠。父母需要很好地回應并引導孩子，使親子之間和而不同，保持一種有彈性的融洽關系。

2.3 試驗動物的分組及給藥劑量

動物造模成功后，將受試組隨機分為模型組（Ⅱ組）、藥物低劑量組（Ⅲ組）、藥物中劑量組（Ⅳ組）、藥物高劑量組（Ⅴ組）及對照組（Ⅰ組），共5組。給藥量：對照組（1 ml/kg，生理鹽水）；模型組（1 ml/kg，生理鹽水）；藥物低劑量組（1 ml/kg，提取液0.2 g/ml）；藥物中劑量組（1 ml/kg，提取液0.4 g/ml）；藥物高劑量組（1 ml/kg，提取液0.8 g/ml）。灌胃給藥7 d后，通過耳緣靜脈取血進行下一步試驗研究。

3 復方中藥的使用對靜脈血栓的作用效果研究

3.1 血清的制備

每組于造模后及給藥7 d 時通過耳緣靜脈取血，將采集到的血液于3 500 r/min 離心10 min，取上清液，4 ℃保存，備用。

3.2 復方中藥的使用對家兔抗凝系統(tǒng)的檢測

PC和AT-Ⅲ有很好的抗凝活性，會直接影響凝血與抗凝的平衡。因此，試驗通過檢測家兔血清中PC及AT-Ⅲ活性的多少來反映藥物對家兔抗凝系統(tǒng)的影響。操作方法按照PC和AT-Ⅲ試劑盒的操作步驟進行。

3.3 復方中藥的使用對家兔纖溶系統(tǒng)的檢測

ET-1 是體內(nèi)最強的縮血管物質(zhì)，ET-1 增加，血管內(nèi)皮細胞受損，t-PA含量下降，t-PA為纖溶系統(tǒng)中的關鍵物質(zhì)，主要功能是溶解血管內(nèi)血栓。因此，試驗通過檢測家兔血清中ET-1 及t-PA 活性的多少來反映藥物對家兔纖溶系統(tǒng)的影響。操作方法按照ET-1和t-PA試劑盒的操作步驟進行。

3.4 復方中藥的使用對家兔血小板系統(tǒng)的檢測

TXB2使血小板發(fā)生凝集及血管收縮，可直觀反映血管的淤血情況。PF4的含量變化反映了血小板的釋放程度。因此，試驗通過檢測兔血清中TXB2及PF4活性的多少來反映藥物對家兔血小板系統(tǒng)的影響。操作方法按照TXB2和PF4試劑盒的操作步驟進行。

3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用GraphPad Prism 6.0 進行數(shù)據(jù)分析，所有計量數(shù)據(jù)均用“平均值±標準差”表示，用P＜0.05表示差異顯著且具有統(tǒng)計學意義。

4 結果與分析

4.1 動物模型建立結果分析

表1 兔血清中AT-Ⅲ、TXB2活性測定的結果

注：同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05），相同小寫字母表示差異不顯著（P＞0.05）；下表同。

由表1 可見，與對照組相比，受試組的AT-Ⅲ活性明顯降低（P＜0.05），TXB2 的活性明顯升高（P＜0.05），說明試驗造模成功。

圖1 家兔耳緣靜脈血管變化

由圖1 可見，對照組家兔耳緣靜脈管徑粗細均勻，管壁薄而柔軟，透過管壁可見腔內(nèi)紅色流動血液；而受試組家兔耳緣靜脈管徑明顯擴張，質(zhì)地堅硬，呈暗紅色。除此之外，家兔眼球因血液凝固堵塞靜脈管腔導致的血液回流障礙而明顯突出，顯示造模成功。

4.2 復方中藥的使用對家兔抗凝系統(tǒng)的作用效果（見表2）

表2 家兔血清中AT-Ⅲ、PC活性測定的結果

由表2 可見，與Ⅰ組相比，Ⅱ組的AT-Ⅲ和PC 的活性明顯降低（P＜0.05），說明試驗造模成功；與Ⅱ組相比，各受試組AT-Ⅲ和PC 活性顯著升高（P＜0.05），說明各藥物均對AT-Ⅲ和PC活性的升高有較好的改善作用；Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組與Ⅰ組相比AT-Ⅲ和PC 活性差異均不顯著（P＞0.05），但Ⅳ組、Ⅴ組的抗凝效果要明顯優(yōu)于Ⅲ組。

4.3 復方中藥的使用對家兔纖溶系統(tǒng)的作用效果（見表3）

表3 家兔血清中ET-1、t-PA活性測定的結果

由表3可見，與Ⅰ組相比，Ⅱ組的ET-1活性明顯升高，t-PA 的活性明顯降低（P＜0.05），說明試驗造模成功；與Ⅱ組相比，各受試組ET-1 活性明顯下降，t-PA 的活性明顯升高（P＜0.05），說明各藥物均對ET-1和t-PA 的活性變化有較好的改善作用；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組與Ⅰ組相比ET-1 和t-PA 活性差異均不顯著（P＞0.05），但Ⅳ組、Ⅴ組的溶栓效果要明顯優(yōu)于Ⅲ組。

4.4 復方中藥的使用對家兔血小板系統(tǒng)的作用效果（見表4）

表4 家兔血清中TXB2、PF4活性測定的結果

由表4可見，與Ⅰ組相比，Ⅱ組的TXB2和PF4的活性明顯升高（P＜0.05），說明試驗造模成功；與Ⅱ組相比，各受試組TXB2 和PF4 的活性明顯下降（P＜0.05），說明各藥物均對TXB2 和PF4 的活性變化有較好的改善作用；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組與Ⅰ組相比，TXB2和PF4活性的差異均不顯著（P＞0.05），但Ⅳ組、Ⅴ組的抗血小板效果要明顯優(yōu)于Ⅲ組。

5 討論

血管損傷在養(yǎng)殖業(yè)中是時常會發(fā)生的。由于動物患病，尤其是高熱性疾病，本身就會導致血流速度變慢，而在治療過程中的動物保定不確定、靜脈注射技術不佳、留置針長時間滯留在血管中會進一步加重血管損傷，改變血流狀態(tài)，加速血液凝固[19]。初期，動物主要表現(xiàn)為局部炎性水腫、體溫升高、精神沉郁、食欲減退，若不及時疏通血管，嚴重時會導致動物死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[19]。目前，對于血管損傷的治療大多數(shù)為西藥，雖然在短時間內(nèi)達到了很好的治療效果，但同時會產(chǎn)生很大的副作用，影響后續(xù)治療[20-21]。中醫(yī)認為，此病屬于血瘀、腫脹等范疇，是血凝、腫脹和運行不暢的結果。根據(jù)現(xiàn)代藥理學發(fā)現(xiàn)，我國傳統(tǒng)中藥丹參[6]、三七[10]具有抗血小板聚集、促進纖維蛋白溶解、抗凝血等作用；黃芪[22]具有促進血液流動、抗凝血，抑制血小板聚集等作用。本試驗以丹參、三七和黃芪為方劑，三者聯(lián)用相輔相成，最終達到協(xié)同改善血流動力學效應的目的。

溶液濃度的高低可直接影響血管內(nèi)皮細胞的通透性，而本試驗注射的20%甘露醇為高滲溶液，輸注后內(nèi)皮細胞的通透性會隨著滲透壓的升高而降低[23]。甘露醇以微粒的形式存在于溶液中，大量微粒在短時間內(nèi)迅速進入靜脈，可造成局部堵塞。其中部分較大的微粒還會在血管壁上沉積，加重血管壁損傷[24]。此外，由于家兔耳緣靜脈比較薄，加上使用留置針時局部的包扎和制動，使靜脈血流變慢，血小板得以沉積，進一步加重血管內(nèi)皮損傷，從而加重血液凝固。試驗結果表明，與對照組相比，受試組的AT-Ⅲ活性明顯降低，TXB2的活性明顯升高（P＜0.05），且肉眼可明顯觀察到受試組家兔耳緣靜脈管徑明顯擴張，質(zhì)地堅硬，呈暗紅色，顯示造模成功。因此，在飼料中添加能夠促進抗凝血物質(zhì)釋放或抑制血小板聚集與黏附的藥物可在一定程度上保護血管，改善血液動力學效應，防止血液凝固。

ET-1 存在于血管內(nèi)皮細胞，是現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)的作用力最強、作用時間最長的縮血管物質(zhì)[25]?？赏ㄟ^對血管孔徑及血流量的干預，誘導血管內(nèi)皮細胞損傷[26]。當內(nèi)皮細胞受損后合成并釋放t-PA物質(zhì)減少，從而抑制纖溶系統(tǒng)的活性，促進血液凝固[27]。試驗結果顯示，家兔灌胃中藥復方提取液中、高劑量后ET-1活性明顯降低，t-PA活性明顯升高，與模型組比較差異顯著（P＜0.05），與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），說明藥物在降低ET-1活性，升高t-PA活性方面有很好的作用效果，并且在一定程度上能夠保護血管內(nèi)皮細胞免受損害。凝血和纖溶平衡失調(diào)是改變血流動力學效應的重要環(huán)節(jié)之一。AT-Ⅲ、PC是人體內(nèi)重要的抗凝物質(zhì)，在維持抗凝和凝血平衡方面有著重要作用。當發(fā)生異常時，AT-Ⅲ、PC的消耗量增加，體內(nèi)AT-Ⅲ、PC含量下降，使機體凝血功能亢進，促進血液凝固[28]。試驗證實，中、高劑量的復方中藥提取液能夠升高AT-Ⅲ和PC 活性，與模型組相比差異顯著（P＜0.05），與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），說明藥物在一定程度上能夠升高AT-Ⅲ和PC活性，維持機體凝血與抗凝血的平衡。除此之外，通過血小板的聚集及黏附也會影響血流狀態(tài)。PF4的含量變化反映了血小板的激活程度。PF4的升高會激活血小板同時使釋放反應亢進[29]?；罨蟮难“鍟尫叛ㄋ兀═XA2）使血小板發(fā)生凝集及血管收縮，由于TXA2 半衰期短，性質(zhì)不穩(wěn)定，易轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的TXB2，故多以TXB2 間接反映TXA2。試驗結果表明，家兔在灌胃復方中藥提取液中、高劑量后TXB2和PF4活性明顯降低，與模型組相比差異顯著（P＜0.05），與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），說明藥物在降低TXB2和PF4活性方面有很好的作用，能夠在一定程度上抑制血小板聚集。但在給予家兔高劑量藥物時，出現(xiàn)了不同程度的少食、精神萎靡及死亡等現(xiàn)象。因此，丹參、三七和黃芪為方劑的中藥提取液濃度在0.4 g/ml時為最佳治療劑量。

6 結論

上述試驗證實，復方中藥提取液中劑量可以較好地緩解血流狀態(tài)改變所帶來的損傷，使凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)保持平衡，保護血管內(nèi)皮細胞，抗血小板聚集與黏附，抑制血管損傷的進一步發(fā)展，為養(yǎng)殖業(yè)解決血管損傷提供了理論和試驗依據(jù)。