防御素對(duì)腸道炎癥反應(yīng)和微生物的調(diào)節(jié)機(jī)制

■顏文新 劉 剛，2 方 俊*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南長(zhǎng)沙410125）

由于仔豬的腸道尚未發(fā)育健全，易受病原微生物、外來(lái)抗原和其他有毒有害分子的侵襲，導(dǎo)致腸道屏障功能受損，菌群失調(diào)，細(xì)菌與內(nèi)毒素移位，產(chǎn)生炎性反應(yīng)[1-2]。這種炎性反應(yīng)又會(huì)進(jìn)一步損傷腸黏膜，增加腸通透性，促使細(xì)菌移位，而形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)，使得豬處于亞健康狀態(tài)，降低了動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率，還降低了生產(chǎn)效率[3]。

防御素是先天免疫的主要效應(yīng)物，在宿主免疫系統(tǒng)中起著重要的作用，其重要性已被廣泛認(rèn)可[4-5]。潘氏細(xì)胞(Paneth cell)系的腸上皮細(xì)胞能產(chǎn)生并分泌的抗菌肽——α防御素，使得細(xì)胞可以感受以細(xì)菌、膽堿以及其他外界刺激，進(jìn)而通過(guò)去除病原體并與有益微生物共生，保持腸道穩(wěn)態(tài)平衡[6-7]。防御素對(duì)細(xì)菌有選擇性的抑菌活性，可以有效地殺死致病細(xì)菌，但對(duì)某些共生細(xì)菌的抑菌活性很小，對(duì)某些共生細(xì)菌無(wú)抑菌活性[8-9]。多個(gè)研究顯示防御素對(duì)腸道微生物群組成具有調(diào)節(jié)作用，腸道炎癥狀態(tài)下的腸道抗菌肽，特別是防御素在回腸和結(jié)腸中表達(dá)紊亂，從而影響了整個(gè)腸道的穩(wěn)態(tài)[10-11]。因此，防御素可能作為連接微生物和疾病的一種機(jī)制起著關(guān)鍵作用，本文綜述了防御素在仔豬腸道炎癥反應(yīng)中的作用，并對(duì)防御素調(diào)控仔豬腸道炎性反應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行了討論。

1 腸道中的微生物及菌群失衡

腸道吸收了生命所必需的營(yíng)養(yǎng)成分，腸上皮細(xì)胞直接與食物和微生物接觸，處于不斷的刺激之下，因而他們?cè)跔I(yíng)養(yǎng)吸收和黏膜免疫等方面發(fā)揮著重要作用[12-13]。腸道中的微生物大約有1×1014個(gè)，正常腸道菌群由數(shù)量龐大的共生的微生物組成[14-15]。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)腸道微生物區(qū)系與各種疾病之間的相關(guān)關(guān)系。其重要原因之一是由于宏基因組分析技術(shù)的快速發(fā)展，這種分析技術(shù)對(duì)不可培養(yǎng)的微生物也能夠有效的定量和檢測(cè)[16]。同時(shí)，抗菌肽及防御素在調(diào)節(jié)微生物群作為先天免疫主要效應(yīng)物的重要性也得到了廣泛的認(rèn)可[10-11，17]。潘氏細(xì)胞響應(yīng)某些刺激從而表達(dá)α-防御素，α-防御素不僅直接參與除去病原體，而且有助于維持正常腸道菌群建立穩(wěn)態(tài)[10，18]。

腸道微生物是免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。腸道微生物在不同的效應(yīng)和記憶T 細(xì)胞群體的分化中起作用，這是產(chǎn)生IL-17 等促炎因子和IL-10 等抗炎因子所必需[19]。目前已有許多研究報(bào)道了腸道炎癥中微生物菌群失調(diào)，例如共生細(xì)菌多樣性減少和黏膜相關(guān)細(xì)菌數(shù)量增多與腸道炎癥發(fā)展相關(guān)[20]。宏基因組學(xué)研究也顯示了腸道炎癥中微生物與對(duì)照組微生物區(qū)系的差異，目前認(rèn)為：①腸道炎癥中幾種硬壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的數(shù)量減少。在擬桿菌中，脆弱擬桿菌（B.fragilis）在誘導(dǎo)結(jié)腸炎的小鼠模型中顯示出重要的保護(hù)作用[21]。此外，在厚壁菌類(lèi)中，普氏糞桿菌（F.prausnitzii）數(shù)量減少[22]。在腸道炎癥的小鼠模型中，口服普氏糞桿菌可以降低炎癥反應(yīng)，并有助于恢復(fù)正常的微生物組成[22]。因此，脆弱擬桿菌和普氏糞桿菌的豐度下降可能導(dǎo)致腸道的炎癥狀態(tài)；②腸道炎癥中變形菌門(mén)（Proteobacteria）和放線菌門(mén)（Actinobacteria）水平增加，特別是黏附侵襲性大腸桿菌的數(shù)量較高[23-24]。研究已經(jīng)證明侵襲性大腸桿菌可以入侵巨噬細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，并刺激產(chǎn)生大量腫瘤壞死因子（TNF-α）等促炎因子；③腸道炎癥中穿透黏液層的細(xì)菌數(shù)量增加[25-26]。在腸道炎癥的腸上皮細(xì)胞中經(jīng)?？梢杂^察到一些黏液溶解細(xì)菌如活潑瘤胃球菌（Ruminococcusgnavus）和扭鏈瘤胃球菌（Ruminococcus torques）[27-28]。因此，腸道炎癥期間微生物群可能與黏膜接觸更密切[29]。

2 腸道屏障與潘氏細(xì)胞及分泌的防御素

腸道屏障在腸道免疫功能中發(fā)揮著重要的作用，允許離子、水和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)透過(guò)腸道屏障，但腸道內(nèi)的微生物無(wú)法通過(guò)腸道黏膜屏障。腸道由一層柱狀上皮細(xì)胞組成，為抵抗進(jìn)入腸腔的微生物提供了第一道防線。這些細(xì)胞中超過(guò)80%的細(xì)胞是腸上皮細(xì)胞，而其余的則是腸分泌細(xì)胞、杯狀細(xì)胞或潘氏細(xì)胞[30]。

潘氏細(xì)胞分泌的α-防御素是小腸上皮產(chǎn)生和釋放的主要抗菌肽。潘氏細(xì)胞也分泌其他的抗菌肽如Reg3γ、溶菌酶和分泌型磷脂酶A2等[31]。此外，潘氏細(xì)胞是腸上皮微環(huán)境的重要組成成分，并與腸道干細(xì)胞發(fā)生相互作用[7]。潘氏細(xì)胞可以產(chǎn)生生長(zhǎng)因子和Wnt 信號(hào)分子，導(dǎo)致Wnt 和Notch 關(guān)閉，這些物質(zhì)被遞送到隱窩基柱狀細(xì)胞誘導(dǎo)特定上皮細(xì)胞譜系的分化。因此，潘氏細(xì)胞在腸道天然免疫和小腸上皮細(xì)胞的再生/分化中起重要作用[32-33]。然而，潘氏細(xì)胞最重要的作用是通過(guò)分泌α-防御素為腸道提供防御作用。

α-防御素不僅具有殺死病原體的功能，也可以通過(guò)維持正常腸道微生物群的組成而有助于腸道動(dòng)態(tài)平衡。例如，基質(zhì)金屬蛋白酶-7（matrix metalloproteinase 7，MMP7）缺陷型小鼠的回腸微生物群，由于缺乏激活了的隱窩素，與野生型小鼠相比，厚壁菌門(mén)的比例明顯升高，類(lèi)桿菌比例顯著下降[34]。此外，在潘氏細(xì)胞中表達(dá)α-防御素HD5 轉(zhuǎn)基因的DEFA5+/+小鼠中，腸道中的微生物菌群組成與野生型菌株顯著不同，厚壁菌門(mén)比例下降，同時(shí)擬桿菌門(mén)比例上升[35]。在潘氏細(xì)胞分泌的六個(gè)最豐富的α-防御素中，cryptdin4 是最有效的殺微生物劑。Masuda 等發(fā)現(xiàn)具有三個(gè)二硫鍵的cryptdin4 顯示出對(duì)致病菌的有效殺菌活性，但對(duì)共生細(xì)菌例如雙歧桿菌、干酪乳桿菌和脆弱擬桿菌沒(méi)有抑菌活性或抑菌活性很低[10]。相反，沒(méi)有二硫鍵的cryptdin4 則殺死致病細(xì)菌和共生細(xì)菌。這些結(jié)果表明，潘氏細(xì)胞分泌的α-防御素具有二硫鍵依賴性的殺菌活性，并在通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物的組成來(lái)維持腸道環(huán)境中發(fā)揮作用。

3 炎癥狀態(tài)下潘氏細(xì)胞被破壞，打破腸道穩(wěn)態(tài)

盡管我們對(duì)仔豬腸道炎癥發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)還不全面，但目前的研究已經(jīng)揭示出了許多炎癥的風(fēng)險(xiǎn)因子及一些與病原相關(guān)分子模式，自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的識(shí)別受體有關(guān)，這些分子還多都有在潘氏細(xì)胞中表達(dá)。此外，遺傳缺陷NOD2、自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因影響潘氏細(xì)胞選擇性，可能會(huì)影響腸道炎癥的發(fā)病機(jī)制[36]。在具有自噬基因Atg16L1 缺陷的小鼠中，潘氏細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)學(xué)異常并且伴有分泌缺陷[37]。研究指出突變的Atg16L1 及諾如病毒特異性菌株的感染導(dǎo)致潘氏細(xì)胞的破壞[38]。此外，敲除Xbp1 基因?qū)е碌鞍谉o(wú)法正確折疊，誘導(dǎo)出小鼠潘氏細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的回腸炎[39]。此外，在缺失前梯度2 基因（Anterior Gradient 2）的結(jié)腸炎小鼠中發(fā)現(xiàn)了無(wú)法分泌粘蛋白2 的杯狀細(xì)胞，同時(shí)由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致了潘氏細(xì)胞形態(tài)改變[40-41]。這些結(jié)果表明導(dǎo)致潘氏細(xì)胞穩(wěn)態(tài)破壞的遺傳缺陷可通過(guò)減少α-防御素的產(chǎn)生和分泌而削弱腸道的先天免疫。

4 結(jié)論

從潘氏細(xì)胞及其分泌的α-防御素的作用最近研究進(jìn)展來(lái)看，防御素對(duì)于穩(wěn)定腸道微生物群的組成非常重要。他們通過(guò)防止細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)和抵抗?jié)撛诘闹虏〖?xì)菌侵入上皮從而促進(jìn)了腸道的正常功能。防御素表達(dá)的改變對(duì)微生物群具有負(fù)面影響并且可以引起炎癥狀態(tài)。防御素在腸道炎癥中表達(dá)的改變?cè)谀c道炎癥的發(fā)病機(jī)制中可能起重要作用，特別是回腸炎癥與潘氏細(xì)胞分泌的防御素的缺乏有關(guān)。恢復(fù)防御素的正常表達(dá)可重新平衡腸道微生物群并改善腸道炎癥。綜上所述，防御素可通過(guò)調(diào)控腸道微生物從而成為腸道炎癥及抗炎治療潛在的新靶點(diǎn)。但防御素介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的機(jī)制仍值得探索。