Unc13基因胰島β細胞條件性敲除小鼠模型的構(gòu)建和鑒定

李 奇 盧 晶 朱曉蓉 熊楓然 楊金奎

(首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科 糖尿病防治研究北京市重點實驗室 北京市糖尿病研究所，北京 100730)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM) 由于其經(jīng)常累及身體多個系統(tǒng)和器官以及嚴重的合并癥，截至2017年，我國成年人糖尿病患病人數(shù)已達1.14億，占世界糖尿病患者總數(shù)的25%[1]。T2DM的主要致病原因為胰島β細胞的損害導(dǎo)致的胰島素分泌功能障礙，或者因為胰島素抵抗致使胰島細胞超負荷運轉(zhuǎn)造成功能的損傷。就胰島素分泌功能而言，T2DM患者的主要表現(xiàn)為胰島素雙相分泌模式的紊亂，即第一時相分泌延遲和第二時相分泌降低[2]。因此，深入了解胰島素雙相分泌的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)機制對于理解糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過程是非常重要的。研究[3]顯示，胰島素分泌的第一時相為“預(yù)備釋放池”中胰島素分泌顆粒的釋放，第二時相則涉及“儲存池”中胰島素分泌顆粒的動員和啟動[3]。然而，由于胰島素雙相分泌過程可能涉及多種因素的協(xié)同作用，胰島素顆粒分泌的調(diào)節(jié)過程仍有待進一步研究加以明確。

對于哺乳動物中Munc13蛋白來說，他們的秀麗隱桿線蟲直系同源物Unc13s和果蠅直系同源物Dunc13s已經(jīng)有十多年的研究歷史[4]。Unc13基因首次在秀麗隱桿線蟲突變表型中發(fā)現(xiàn)，這些突變體攜帶一種未協(xié)調(diào)(uncoordinated/unc)的，與神經(jīng)遞質(zhì)的突觸前胞吐作用受損有關(guān)的表型，故被命名為Unc13基因[5]。Munc13蛋白家族在哺乳動物中由3個亞型(Munc13-1、Munc13-2、Munc-3)構(gòu)成，主要為腦特異性佛波酯受體[6]，含有結(jié)合佛波酯的C1結(jié)構(gòu)域和兩個C2結(jié)構(gòu)域[7]，可以調(diào)節(jié)囊泡運輸，參與囊泡的引導(dǎo)、錨定及釋放過程。研究[8]顯示，Munc13-1與胰島素分泌顆粒的啟動密切相關(guān)，其缺失會損害第二時相胰島素分泌[8]。但是Unc13基因具體如何調(diào)節(jié)胰島素顆粒分泌仍不清楚。因此，本研究構(gòu)建了特異性的基因修飾動物模型為研究提供幫助。

基因修飾動物模型是在活體動物上開展基因功能研究，是尋找合適藥物作用靶標的重要工具[9]。條件性基因敲除技術(shù)作為新一代基因敲除技術(shù)，與第一代基因敲除技術(shù)相比，有更高的特異性，因此具更為廣泛的應(yīng)用前景。其中基于Cre-LoxP系統(tǒng)的條件性基因敲除小鼠因良好的實驗效果得到了青睞[10]。Cre重組酶是大腸桿菌噬菌體P1中Cre基因編碼表達的由343個氨基酸組成的相對分子質(zhì)量為38 000的蛋白質(zhì)，它可以特異性識別DNA上的LoxP序列，并根據(jù)LoxP序列的位置和LoxP序列之間的關(guān)系介導(dǎo)不同的特異性重組反映。

本研究采用Cre-LoxP系統(tǒng)構(gòu)建了Unc13基因胰島β細胞條件敲除小鼠，為2型糖尿病發(fā)病機制研究提供了動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

胰島β細胞表達Cre重組酶的小鼠(以下簡稱CreT小鼠)由香港大學徐愛民教授饋贈，實驗動物許可證號：SCXK(京)2011-0012。Unc13flox/flox轉(zhuǎn)基因小鼠(即僅插入了LoxP序列，未與Cre重組酶進行結(jié)合的小鼠，以下簡稱純合Flox小鼠)采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建。遺傳背景均系C57/B6小鼠，按照SPF級動物飼養(yǎng)標準在北京大學醫(yī)學部 SPF級實驗動物中心進行飼養(yǎng)。實驗室溫度20～25 ℃，相對濕度50%～70%。12 h光照，12 h黑暗，所有小鼠自由采食，飲水，小鼠飼料、飲水、墊料均經(jīng)高溫高壓滅菌處理。實驗所使用的所有動物均經(jīng)過首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院動物委員會批準。

1.2 采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Flox小鼠

1.2.1 構(gòu)建打靶載體

從NCBI小鼠基因組網(wǎng)站得到Unc13基因(Gene ID:208898)的序列和結(jié)構(gòu)信息。在基因的非編碼區(qū)中選擇距離和長度適宜的2個區(qū)域插入同向的LoxP序列，并在LoxP序列兩端攜帶相應(yīng)的同源序列，構(gòu)建出兩段“同源序列-LoxP-同源序列”的DNA片段作為打靶載體。

1.2.2 顯微操作與F0代鑒定

將純化后的打靶載體通過顯微注射的方法注入小鼠胚胎干細胞中，得到攜帶LoxP突變基因的靶細胞。將中靶細胞注入小鼠囊胚中內(nèi)，將囊胚植入假孕小鼠子宮，發(fā)育得到F0代LoxP突變基因的嵌合體小鼠。取小鼠尾部細胞進行培養(yǎng)，PCR擴增后通過DNA印跡確認LoxP突變基因已經(jīng)整合到小鼠染色體上。為進一步驗證，將PCR產(chǎn)物進行TA克隆測序。

1.2.3 繁育純合突變小鼠

將嵌合體小鼠與野生型C57/B6小鼠進行繁育，得到F1代小鼠。通過基因型鑒定篩選出F1代雜合子，并用其作為親本。交配繁育F2代，得到的F2代再進行基因鑒定，最終得到兩條染色體均帶有LoxP突變基因的純合突變小鼠(以下簡稱為純合Flox小鼠)，從而建立突變?nèi)后w。

1.3 Unc13基因胰島β細胞條件敲除小鼠構(gòu)建

由于純合Flox小鼠的目的基因片段上下游均插入了同向的LoxP片段，將其與CreT小鼠進行雜交后，即能在特異性表達Cre重組酶的組織(本研究中為胰島β細胞)中將2段LoxP序列之間的基因刪除，同時生成一個終止子，以達到條件性敲除目的基因的作用，最終得到Unc13基因胰島β細胞條件性敲除小鼠模型。

1.4 小鼠基因型的鑒定

1.4.1 小鼠尾部基因組DNA提取

剪取21日齡小鼠尾尖0.5 cm置于1.5 mL的EP管內(nèi)，加入400 μL裂解液和1 μL蛋白酶K儲存液，將上述EP管置于55 ℃恒溫水浴鍋水浴過夜，待消化完全，使用酚/氯仿法抽提基因組DNA。

1.4.2 小鼠基因組DNA的PCR擴增反應(yīng)

下列反應(yīng)物構(gòu)成20 μL的反應(yīng)體系：模板DNA 2.0 μL，緩沖液 (含Mg2+) 2.0 μL，dNTP混合物(10 mmol/L) 0.5 μL，引物混合液 (10 mol/L) 0. 5 μL， DNA聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL，超純水 14.5 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃5 min；變性95 ℃30 s；退火58 ℃30 s；延伸72 ℃ 30 s；共40個循環(huán)，最后再延伸70 ℃10 min，之后25 ℃保存，引物序列見表1。

表1 引物序列

Fl: Flox;Wt: wild type;T:Cregene positive.

1.4.3 瓊脂糖凝膠電泳及結(jié)果分析

PCR之后通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。制備2%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂糖凝膠，取PCR反應(yīng)終產(chǎn)物5 μL進行電泳，135 V 20 min。電泳后利用凝膠成像系統(tǒng)進行電泳圖片分析。根據(jù)電泳結(jié)果篩選含有目的條帶的小鼠，判斷對應(yīng)小鼠是雜合子還是純合子。

圖1 Cas9設(shè)計策略Fig.1 Design strategy of Cas9UTR: untranslated regions

1.5 小鼠腹腔葡萄糖耐量實驗(intra-peritoneal glucose tolerance test，IPGTT)及血清胰島素濃度測定

小鼠禁食12～14 h后，腹腔注射20%(質(zhì)量分數(shù))葡萄糖溶液，注射體積為小鼠體質(zhì)量(g)×10 μL，用固定器固定小鼠，分別測定葡萄糖負荷后0、15、30、60和120 min時小鼠尾靜脈血糖濃度。并于0、15、30 min 自眼眶靜脈叢采血，留取血清，采用小鼠超敏胰島素ELISA試劑盒(美國Milipore公司)測定血清胰島素濃度。血糖測定用美國強生公司One-Touch血糖儀及配套試紙。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用Prism7(GraphPad Software)軟件進行統(tǒng)計分析。兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本的Mann-WhitneyU檢驗。組間和時間均數(shù)比較，采用雙因素重復(fù)測量方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Flox小鼠構(gòu)建策略

通過NCBI小鼠基因組網(wǎng)站得到Unc13基因(Gene ID:208898)的序列和結(jié)構(gòu)信息，選擇Exon2和Exon3作為目的基因片段，在其上下游分別插入一段同向的LoxP序列，構(gòu)建出攜帶有LoxP序列的Flox小鼠(圖1)。

2.2 F1代雜合Flox小鼠構(gòu)建及基因型鑒定

將F0代Flox小鼠與野生型C57/B6小鼠進行繁育，得到F1代小鼠。從鼠尾中提取出DNA樣品，采用PCR擴增的方法檢測LoxP片段。理論上，不含LoxP片段的小鼠可見條368 bp條帶，LoxP純合子只有一條466 bp條帶，雜合子有368 bp和466 bp兩條帶(圖2A)。為進一步驗證，將PCR產(chǎn)物進行TA克隆測序(圖2B)。LoxP序列成功結(jié)合到小鼠Unc13基因相應(yīng)部位，27、28、29、36、38、39號均為雜合子Flox小鼠。

圖2 Flox小鼠F1代基因型鑒定Fig.2 Flox mice genotype identificationA:27-39:mice; B: Flox mice sequencing results,LoxP sequence is highlight;TRANS 2K:marker; TRANS 2K PLUS II marker(bp): 8 000,5 000,3 000,2 000,1 000,750,500,250,100; 500 bp is highlight; P:positive control; B6: C57/B6;N: negative control.

2.3 胰島β細胞條件性敲除鼠構(gòu)建及基因型鑒定

將純合Flox小鼠與CreT小鼠進行雜交，得到特異性表達Cre重組酶的Flox雜合鼠(基因型為Unc13flox/wtCreT)和沒有特異性表達Cre重組酶的Flox雜合鼠(基因型為Unc13flox/wtCreW)。將其作為親本進行雜交，可得到表達或不表達Cre重組酶的Flox純合鼠(基因型為Unc13flox/floxCreT或Unc13flox/floxCreW)，即為本研究構(gòu)建的Unc13基因胰島β細胞條件性敲除鼠及其對照鼠。

從鼠尾中提取出DNA樣品，采用PCR擴增的方法分別檢測LoxP片段(圖3A)和Cre片段。表達Cre重組酶的鼠在481 bp處可見條帶，不表達者則在相應(yīng)位置沒有條帶(圖3B)。成功構(gòu)建出Unc13基因胰島β細胞條件性敲除鼠(編號為87、91、92、93，基因型為Unc13flox/floxCreT，即Unc13 KO鼠)及其對照鼠(編號為88、89、90，基因型為Unc13flox/floxCreW，即WT鼠)。

圖3 條件性敲除小鼠基因型鑒定結(jié)果Fig.3 Conditioned knockout mice genotype identificationA: 87-93:mice, identify LoxP gene, LoxP is 466 bp;B: 87-93:mice,identify Cre gene,CreT is 481 bp,CreW is none;DL 2 000: marker;DL 2 000 marker(bp):2 000,1 000,750,500,250,100.750 bp is highlight;P:positive control; B6: C57/B6;N: negative control.

2.4 Unc13 KO小鼠葡萄糖代謝能力下降

選取9周齡的基因型為CreTUnc13flox/flox(以下簡稱Unc13 KO鼠)和CreWUnc13flox/flox(以下簡稱WT鼠)兩種小鼠作為實驗組和對照組進行GTT和胰島素分泌實驗。雌雄Unc13 KO小鼠在30 min和60 min 的血糖濃度均明顯高于對照組(P<0.05)。Unc13 KO雄鼠的血糖值曲線下面積較對照組明顯升高(P<0.05)，雌鼠的血糖值曲線下面積雖較對照組也有升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),詳見圖4。

圖4 IPGTT實驗結(jié)果Fig.4 IPGTT resultsA： blood glucose levels of male mice,WT, n=6, KO: n=3; B：AUC of male mice;*P<0.05 vs WT; C: blood glucose levels of female mice; WT: n=5, KO: n=3. D: AUC of female mice; IPGTT: intra-peritoneal glucose tolerance test; KO:knockout; WT: wild type; AUC: area under curve.

2.5 Unc13 KO小鼠胰島素分泌功能受損

分別測量普通飼養(yǎng)的11周齡Unc13 KO小鼠與WT小鼠的胰島素分泌水平。Unc13 KO小鼠在15 min 和30 min的胰島素質(zhì)量濃度明顯低于對照組(P<0.05),Unc13 KO雄鼠的胰島素質(zhì)量濃度曲線下面積較對照組明顯升高(P<0.05)。雌鼠的胰島素分質(zhì)量濃度曲線下面積雖較對照組也有升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見圖5。

圖5 胰島素分泌實驗結(jié)果Fig.5 Insulin release resultsA:serum insulin levels of male mice; WT: n=6, KO: n=3; B:AUC of male mice;*P<0.05; C:serum insulin levels of female mice;WT: n=5; KO: n=3; D:AUC of female mice; KO: knockout; WT:wild type;AUC:area under curve.

3 討論

胰島素抵抗與胰島β細胞缺陷是2型糖尿病兩個重要的病理生理改變。目前認為，胰島素抵抗在2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用[11]，但單獨的胰島素抵抗不足以引發(fā)糖尿病，只有當胰島β細胞不能代償胰島素抵抗時，糖尿病才發(fā)生[12]；胰島β細胞缺陷在2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮中心性作用[13]。

胰島β細胞的主要功能為胰島素的合成、儲存、運輸和釋放。就胰島素的釋放而言，其需要一系列的準備過程，包括分泌囊泡向細胞質(zhì)膜的遷移，囊泡的錨定，胞吐過程的啟動等步驟[14]，此過程受蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)[15]、環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)[16]、蛋白激酶A (protein kinase A，PKA)[17]、腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)[17]和Ca2+[18]等因子調(diào)控，任何一個環(huán)節(jié)受損都可能導(dǎo)致胰島素分泌功能障礙。Munc13-1蛋白可作用于囊泡的錨定過程，通過輔助SNAREs蛋白促進囊泡膜與細胞膜半融合中間體的形成[19-23]。而Unc13基因在胰島素釋放過程中的作用仍不得而知，所以，構(gòu)建動物模型進行研究就顯得極為重要。

基于Cre-LoxP系統(tǒng)的條件性基因敲除技術(shù)因其良好的實驗效果而成為熱門的基因編輯技術(shù)[24-25]。本實驗通過構(gòu)建Unc13flox/flox轉(zhuǎn)基因小鼠，并將其與Ins2-Cre鼠雜交，通過繁育最終得到Unc13基因胰島β細胞條件敲除小鼠。通過進行小鼠葡萄糖耐量實驗及胰島素測定，筆者發(fā)現(xiàn)Unc13 KO鼠的確存在糖耐量降低，胰島素分泌水平下降的表現(xiàn)。后期實驗將通過增加樣本量，高糖、高脂等特色條件誘導(dǎo)Unc13 KO鼠，相信能對Unc13基因的作用有更深入的了解。

本研究成功構(gòu)建了Unc13基因胰島β細胞條件敲除小鼠模型并進行了初步實驗，但還存在一些問題。比如對Unc13 KO鼠的胰島β細胞的功能研究還不夠深入，也并沒有闡明Unc13基因發(fā)揮作用的具體機制。后續(xù)應(yīng)在提取原代胰島β細胞后，進行形態(tài)學檢查、葡萄糖刺激的胰島素分泌實驗、探究蛋白質(zhì)之間相互作用等實驗來更進一步的研究Unc13基因的功能，從而為Unc13基因與胰島素分泌的相關(guān)性研究提供新的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)和結(jié)果。