PEG1000-（NH4）2SO4雙水相萃取玉米芯黃酮工藝優(yōu)化及抗氧化性研究

劉 曄

（福建林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 南平 353000）

糯玉米芯作為主要糧食作物玉米的一種加工廢棄物，多用于造紙制漿和家畜飼喂[1]，綜合開(kāi)發(fā)利用率不高，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，玉米芯內(nèi)含有多種生物活性成分，可作為木糖、黃酮、多酚類(lèi)物質(zhì)等高附加值產(chǎn)物的原料[2]。黃酮類(lèi)化合物作為玉米芯中的主要活性物質(zhì)之一，具有抗腫瘤、抗心血管疾病、抗氧化等藥理作用[3]。熱回流提取法、超聲波提取法、微波提取法等仍然為黃酮類(lèi)物質(zhì)最主要的提取方法[4]，但上述方法操作復(fù)雜、成本高、易破壞有效成分、不易于連續(xù)生產(chǎn)。而雙水相作為一種聚合物-鹽-水萃取體系具有萃取條件溫和，不破壞生物活性，易于連續(xù)生產(chǎn)等特點(diǎn)，已被應(yīng)用于分離色素，生物堿，黃酮以及小分子化合物[5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PEG1000-（NH4）2SO4雙水相對(duì)糯玉米芯中黃酮進(jìn)行萃取，探討其最佳工藝條件，并評(píng)價(jià)其抗氧化能力，旨在為分離玉米芯黃酮提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯玉米芯采集于南平市郊區(qū)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，江西佰草源生物科技有限公司；Tris，Scientific Phygene；PEG1000、水楊酸 、乙 醇 、（NH4）2SO4、NaCl、NaOH、鹽 酸 、Al（NO3）3、NaNO2、L-抗壞血酸、FeSO4、鄰苯三酚、30%H2O2，西隴化工股份有限公司。

1.2 設(shè)備

UV-1600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，翱藝儀器有限公司；KQ-500E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；ST2100 pH計(jì)，奧豪斯儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 玉米芯黃酮粗提液制備

將糯玉米芯干燥至恒定質(zhì)量，粉碎過(guò)篩備用。稱(chēng)取糯玉米芯樣品粉末2.5 g，75%乙醇作為浸提液，超聲提取30 min，離心，得上清液。

1.3.2 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成一定濃度，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法[6]，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.3 制備雙水相體系相圖

采用濁點(diǎn)法[7]，將PEG1000溶液置于比色管中，加入一定濃度的（NH4）2SO4溶液混合，直至體系有兩相產(chǎn)生，計(jì)算此時(shí)二者的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，加水破壞兩相，重復(fù)上述步驟，將數(shù)據(jù)整合進(jìn)行相圖繪制。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將2 mL黃酮粗提液混合在雙水相萃取體系中，分別設(shè)置總體系中PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)（18%、20%、22%、24%、26%、28%），（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù) （10%、12%、14%、16%、18%、20%），NaCl添加量（1%、2%、3%、4%、5%），pH 值（2、3、4、5、6、7），恒定體系總質(zhì)量 10 g，將混合液 3 000 r/min 離心10 min，靜置分層[8]，考察這4項(xiàng)因素對(duì)玉米芯黃酮在雙水相體系中的萃取效用。

式中：M——相比；V上、V下——上、下相體積，mL；K——分配系數(shù)；C上、C下——上、下相黃酮濃度，mg/mL。

1.3.5 正交優(yōu)化篩選

單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，以玉米芯黃酮萃取率為指標(biāo)結(jié)果，將 PEG1000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)、NaCl添加量、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值為自變量，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，篩選出玉米芯黃酮最佳萃取工藝參數(shù)。

1.3.6 測(cè)定抗氧化活性

（1）羥自由基清除作用。參照李小紅等[9]方法，以L(fǎng)-抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，取濃度分別為0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL 的玉米芯黃酮提取液2 mL，與蒸餾水2 mL、2.5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、5 mmol/L FeSO4溶液各1 mL混勻，靜置10 min；隨即顯色反應(yīng)30 min，在510 nm處測(cè)定吸光度。

式中：B0——空白對(duì)照吸光度；B1——樣品溶液本底吸光度；B2——樣品吸光度。

（2）超氧陰離子自由基清除作用。參照單科開(kāi)等[10]方法，將一定濃度的玉米芯黃酮樣品溶液，運(yùn)用鄰苯三酚溶液自氧化法，于325 nm處每隔30 s測(cè)定一次吸光度。以L(fǎng)-抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，試劑參比為0.01 mol/LHCl溶液。

式中：V1——樣品所測(cè)吸光度值與時(shí)間的線(xiàn)性回歸直線(xiàn)斜率；V0——蒸餾水所測(cè)吸光度值與時(shí)間的線(xiàn)性回歸直線(xiàn)斜率。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

測(cè)定0.008～0.056 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，回歸方程為：y=11.546x+0.0008，R2=0.999 4。

2.2 雙水相體系

作為影響兩相平衡的主要因素，PEG1000與（NH4）2SO4二者的質(zhì)量分?jǐn)?shù)數(shù)值需位于臨界線(xiàn)上方，才能夠獲得穩(wěn)定的雙水相體系。觀察圖1曲線(xiàn)，當(dāng)PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大時(shí)，（NH4）2SO4含量不宜過(guò)低，否則不易形成兩相，當(dāng)PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%時(shí)，（NH4）2SO4所需量應(yīng)高于10%才易形成兩相。因此，需選取臨界曲線(xiàn)上方適宜的數(shù)值才能構(gòu)建穩(wěn)定的雙水相體系。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)玉米芯黃酮萃取率的影響

固定萃取體系中（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%，pH值 4，NaCl添加量3%，玉米芯黃酮在PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%～28%范圍時(shí)的體系中，研究分配系數(shù)和萃取率的分配趨勢(shì)。由圖2可知，PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，增強(qiáng)了兩相之間相比，促使玉米芯黃酮富集于上相，提升了上相中黃酮的濃度，分配系數(shù)值也發(fā)生相應(yīng)的增加。當(dāng)PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)26%時(shí)，體系黏度升高[11]，造成分配系數(shù)與萃取率數(shù)值降低。因此，體系中PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)在26%時(shí)，萃取效果最好。

2.3.2 （NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)玉米芯黃酮萃取率的影響

玉米芯黃酮在兩相間的分配特性也取決于（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)。圖3表明，當(dāng)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)不高于18%時(shí)，萃取率隨濃度增加并達(dá)到最高值；在18%～20%范圍內(nèi)，隨濃度增加而減小。在雙水相體系中，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加，促使體系極性增強(qiáng)[12]，受此作用使上相中黃酮濃度降低，導(dǎo)致萃取率隨之下降。故體系中，設(shè)置（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%，萃取效果顯著。

2.3.3 NaCl添加量對(duì)玉米芯黃酮萃取率的影響

研究NaCl添加量在1%、2%、3%、4%、5%范圍內(nèi)，玉米芯黃酮在兩相間的分配情況。由圖4可知，NaCl添加量低于3%時(shí)，電解質(zhì)離子在兩相間的分配導(dǎo)致兩相間電位差增大[13]，有利于玉米芯黃酮萃取率的提高；當(dāng)NaCl添加量超過(guò)3%時(shí)，雙水相體系極性增強(qiáng)，阻礙黃酮進(jìn)入上相，導(dǎo)致體系中玉米芯黃酮分配系數(shù)與萃取率下降。因此NaCl添加量3%為宜。

2.3.4 pH值對(duì)玉米芯黃酮提取率的影響

圖5所知，由于pH增大，能引起雙水相體系黃酮電荷性質(zhì)和電位差的改變[14]，影響玉米芯黃酮在上下相中的分配，從而導(dǎo)致玉米芯黃酮分配系數(shù)和萃取率隨著體系pH值先增加后減小。根據(jù)總體趨勢(shì)，pH值調(diào)整為4時(shí)最為適宜。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)化雙水相萃取體系，將PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、pH 值（C）、NaCl添加量（D）這四項(xiàng)因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，從表1可知，影響玉米芯黃酮萃取率各因素的主次順序?yàn)椋篈BCD，其最優(yōu)工藝參數(shù)：A2B2C2D2，即PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)26%，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%，pH為4，NaCl添加量3%。進(jìn)行方差分析可知，PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮萃取率具有顯著性影響（p0.05）。在該條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)平行3次，可得萃取率平均值為97.39%±0.26%。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Tab.1 Results and analysis of orthogonal test

表2 方差分析表Tab.2 Analysis results of variance

2.5 抗氧化活性結(jié)果

2.5.1 羥自由基清除作用

玉米芯黃酮對(duì)羥自由基清除率，見(jiàn)圖6。

圖6 所示，隨玉米芯黃酮濃度增加，對(duì)羥自由基清除效果呈直線(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)玉米芯黃酮、L-抗壞血酸濃度為0.6mg/mL時(shí)，對(duì)羥自由基清除率分別為70.28%和86.90%，二者之間有輕微差異。

2.5.2 超氧陰離子自由基清除作用

圖7表明，玉米芯黃酮濃度的增加，對(duì)超氧陰離子自由基清除效果呈總體提升趨勢(shì)。當(dāng)玉米芯黃酮、L-抗壞血酸濃度為0.5 mg/mL時(shí)，清除率分別為67.94%和86.05%，其清除能力低于相同濃度的L-抗壞血酸。

3 結(jié)論

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化PEG1000-（NH4）2SO4雙水相體系萃取玉米芯中黃酮工藝，確定PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26%，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%，pH值為4，NaCl添加量為3%為最優(yōu)工藝參數(shù)。在此工藝參數(shù)下，其萃取率可達(dá)97.39%±0.26%，優(yōu)于傳統(tǒng)的超聲波浸提法，可作為一種更高效、穩(wěn)定的提取方法。同時(shí)，對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力上，主要取決于玉米芯黃酮的濃度，隨添加量呈直線(xiàn)上升趨勢(shì)。這為進(jìn)一步綜合開(kāi)發(fā)利用玉米高附加值產(chǎn)物提供了一定的理論參考。