補(bǔ)肺湯通過TGF-β/Smad3信號(hào)通路抑制小鼠肺纖維化的研究*

劉煒，駱新，沈靜

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011)

肺纖維化(pulmonary fibrosis)是指病因未明的彌漫性肺間質(zhì)疾病，以慢性進(jìn)行性肺間質(zhì)陽性反應(yīng)和細(xì)胞基質(zhì)動(dòng)態(tài)沉積為主要病理特征，也可累及肺泡上皮細(xì)胞及肺血管，臨床表現(xiàn)以慢性咳嗽，低氧性呼吸衰竭[1]。近年來肺纖維化患病率逐年上升，中老年男性多發(fā)，確診后平均生存時(shí)間僅為2.8～4.2年。肺纖維化的發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚，但是成纖維細(xì)胞的活化和細(xì)胞外基質(zhì)中I型膠原蛋白的過度沉積是肺纖維化的特征性病理變化，所以α平滑肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和I型膠原蛋白(Collagen I)是反映肺纖維化疾病進(jìn)程的常見指標(biāo)[2]。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)被認(rèn)為是參與肺纖維化發(fā)生發(fā)展多個(gè)環(huán)節(jié)的關(guān)鍵致纖維化因子，而其功能的發(fā)揮依賴于Smad3蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，與肺纖維化的形成密切相關(guān)[3]。肺纖維化的臨床用藥以西藥，如醋酸潑尼松龍、氫化可的松、吡非尼酮等為主，其治療效果有限，副作用明顯[4]。因此，尋找療效好且副作用低的肺纖維化治療新手段迫在眉睫。

中醫(yī)認(rèn)為肺纖維化屬于肺痿，《金匱要略》論治虛寒肺痿集中于補(bǔ)肺益氣、健脾化痰、活血化瘀等。補(bǔ)肺湯出自李仲南所著《永類鈐方》，全方具有補(bǔ)肺健脾益腎，止咳化痰平喘、降逆止咳之功效，目前臨床多用于治療肺系疾病，療效顯著，如慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘等[5-6]。但其對(duì)肺纖維化的治療作用及作用機(jī)制筆者尚未見報(bào)道，所以本實(shí)驗(yàn)通過研究補(bǔ)肺湯對(duì)肺纖維化小鼠血清中羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)，透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)，層黏連蛋白(laminin，LN)的含量的影響，從形態(tài)學(xué)和病理組織學(xué)分析其對(duì)小鼠的肺纖維改善情況，及從調(diào)節(jié)TFG-β/Smad3信號(hào)通路的角度揭示該方對(duì)肺纖維化小鼠的治療作用及其機(jī)制，為抗肺纖維化藥物的研究提供科學(xué)的途徑。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體(SPF)級(jí)雄性C57BL/6小鼠，8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(新)2018-0002，動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境SPF級(jí)，日光燈照明，空調(diào)控溫，分籠飼養(yǎng)，可自由攝食水，飼養(yǎng)溫度為(22±2)℃。

1.2試劑 注射用鹽酸博來霉素(日本化藥株式會(huì)社，批號(hào)：18051511)，吡非尼酮膠囊(北京康蒂尼藥業(yè)有限公司，批號(hào)：151010)，補(bǔ)肺湯免煎顆粒(熟地黃24 g、桑白皮9 g、人參 9 g、五味子6 g、紫菀9 g、黃芪24 g)購買自四川大冢制藥有限公司。TGF-β、p-Smad3、α-SMA、Collagen I以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)等單克隆抗體均購買自Abcam公司，山羊抗兔HRP -IgG抗體(美國Santa Cruz公司，批號(hào)：69080030)。蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(批號(hào)：180620)，Masson染色試劑盒(批號(hào)：180629)，電致化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(批號(hào)：PH0353)均購自北京索寶來科技有限公司。羥脯氨酸測試盒(南京建成生物工程有限公司，批號(hào)：181201)。透明質(zhì)酸試劑盒(批號(hào)：20181203)，層黏連蛋白試劑盒(批號(hào)：20180902)購自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司。

1.3動(dòng)物分組及模型制備 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只，造模組40只。造模前12 h均禁食不禁水。造模組小鼠以10%水合氯醛麻醉，仰臥固定頭和四肢于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，常規(guī)消毒，沿頸部正中線切口，鈍性分離頸部軟組織，暴露氣管，經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙緩慢注入博來霉素0.9%氯化鈉溶液5 mg·kg-1。注射后迅速將小鼠直立并旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)均勻分布，正常對(duì)照組小鼠麻醉后氣管內(nèi)滴注等量0.9%氯化鈉溶液。造模當(dāng)天及術(shù)后3 d 內(nèi)，所有小鼠頸部縫合處噴撒青霉素粉末。

1.4干預(yù)方法 造模后第3天，隨機(jī)將博來霉素誘導(dǎo)的40只小鼠分成4組，分別是模型對(duì)照組，吡非尼酮組，補(bǔ)肺湯小、大劑量組，每組10只，以未造模10只小鼠為正常對(duì)照組。吡非尼酮組小鼠灌胃給予吡非尼酮300 mg·kg-1。補(bǔ)肺湯小、大劑量組分別灌胃給予補(bǔ)肺湯3，12 g·kg-1。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組小鼠給予等量0.9%氯化鈉溶液。連續(xù)給藥28 d，每天一次。

1.5補(bǔ)肺湯對(duì)肺纖維化小鼠血清中HYP、HA、LN水平的影響 給藥28 d后，所有動(dòng)物禁食不禁水24 h，左心腔取血法處死，鼠血3000 r·min-1(r=10 cm)離心15 min，分離血清，-20 ℃凍存?zhèn)溆?。采用化學(xué)免疫法檢測各組小鼠HYP水平，放射免疫測定法檢測HA、LN水平。

1.6肺組織形態(tài)學(xué)以及組織病理學(xué)變化 小鼠處死后，暴露胸腔以分離肺組織，攝像并分析肺形態(tài)學(xué)改變。結(jié)扎并分離右上肺，置于4%多聚甲醛中固定，乙醇逐級(jí)脫水，浸蠟包埋，病理切片行HE染色及Masson染色，肺泡炎和非纖維化評(píng)分程度評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)參照Szapie評(píng)價(jià)方法[7]。右下肺保存在-80 ℃，用于檢測組織中蛋白表達(dá)。

1.7肺組織中TGF-β、p-Smad3、α-SMA、Collagen I蛋白表達(dá)水平的檢測 蛋白免疫印跡法檢測各組小鼠肺組織中TGF-β、p-Smad3、α-SMA、Collagen I等蛋白的表達(dá)水平。取各組小鼠肺組織50 mg，加入提取液低溫勻漿裂解，12 000 r·min-1(r=10 cm)離心10 min，取上清液，部分上清液用于BCA定量總蛋白濃度，剩余蛋白加上樣緩沖液煮沸5 min。上樣等量總蛋白，Bio-Rad電泳儀恒壓70 V，100 min后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5% 脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，TBST清洗3次，每次10 min。加入TGF-β、p-Smad3、α-SMA、Collagen I的單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，TBST清洗。加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的IgG二抗，室溫下振蕩孵育1 h，TBST清洗。滴加ECL顯色、暗室曝光，運(yùn)用Image 獲得灰度值。

2 結(jié)果

2.1補(bǔ)肺湯對(duì)肺纖維化小鼠HYP、HA、LN水平的影響 檢測各組小鼠HYP、HA、LN水平，結(jié)果見表1。與正常對(duì)照組比較，造模成功小鼠血清中HYP、HA、LN含量顯著升高(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，吡非尼酮組和補(bǔ)肺湯小、大劑量組HYP、HA、LN等含量均顯著降低(P<0.05)，提示吡非尼酮和小、大劑量的補(bǔ)肺湯均能改善小鼠肺纖維增生情況。

表1 5組小鼠HYP、HA、LN水平檢測值

Tab.1 The Levels of HYP，HA and LN in five groups of mice

組別HYPHALN正常對(duì)照組1.19±0.1833.27±3.8952.11±2.83模型對(duì)照組2.63±0.32①72.17±4.12①126.23±4.12①吡非尼酮組1.27±0.24①②30.22±2.91①②55.84±3.62①②補(bǔ)肺湯 小劑量組1.52±0.25①②39.88±6.18①②63.15±7.12①② 大劑量組1.33±0.16①②33.12±4.73①②59.76±4.16①②

①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05.

2.2補(bǔ)肺湯對(duì)PE小鼠肺形態(tài)學(xué)和病理組織學(xué)的影響 正常對(duì)照組小鼠肺臟外觀大體正常；模型對(duì)照組小鼠肺顏色蒼白，硬度增加且彈性差，表面呈結(jié)節(jié)性改變；補(bǔ)肺湯小劑量組肺表面呈現(xiàn)暗紅色，凹凸不平，彈性稍差；補(bǔ)肺湯大劑量組和吡非尼酮組肺外觀接近正常對(duì)照組，表面稍欠光滑，彈性較好。見圖1。HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)輪廓完整清晰，肺泡壁薄且光滑無變形，肺泡間隔未見水腫和炎性細(xì)胞浸潤；模型對(duì)照組可見肺結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡閉鎖、萎陷，肺泡間隔明顯增厚，實(shí)質(zhì)組織內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤聚集；與模型對(duì)照組比較，吡非尼酮和小、高劑量補(bǔ)肺湯均可顯著改善肺纖維化小鼠肺組織的病理變化，其肺泡結(jié)構(gòu)較為完整，肺泡間質(zhì)增厚不明顯，炎癥明顯減輕，膠原組織沉積減少。見圖1。Masson染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠肺泡腔透亮，肺泡壁未見增厚，肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)未見纖維蛋白沉積；模型對(duì)照組肺泡和成纖維細(xì)胞增生，可見大量膠原纖維增生、沉積；與模型對(duì)照組比較，補(bǔ)肺湯小、大劑量組肺組織結(jié)構(gòu)明顯完整，肺纖維蛋白顯著減少；吡非尼酮也可顯著抑制膠原沉積，改善病理變化。見圖1。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組肺泡炎和肺纖維化評(píng)分顯著升高(P<0.05)，而補(bǔ)肺湯小、高劑量和吡非尼酮可顯著降低肺泡炎和肺纖維化評(píng)分(P<0.05)。見表2。

2.3肺組織中TGF-β、p-Smad3、α-SMA、Collagen I等蛋白表達(dá)水平的檢測 檢測各組小鼠肺組織中TGF-β、p-Smad3、α-SMA、Collagen I等蛋白的表達(dá)水平。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組TGF-β1、p-Smad3、α-SMA、Collagen I等蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，吡非尼酮組和補(bǔ)肺湯低、大劑量組肺組織TGF-β、p-Smad3、α-SMA、Collagen I等蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖2。

3 討論

肺纖維化是肺間質(zhì)性疾病，目前治療尚無特效藥物，臨床多采用西藥治療，如醋酸潑尼松、吡非尼酮等，但價(jià)格昂貴，且存在著一定副作用[8]?！端貑枴け哉摗氛J(rèn)為肺纖維屬于肺痿，乃“肺熱葉焦，則皮毛虛弱急薄，著則生痿躄也”，提出其病機(jī)為“氣虛血瘀”，嘗試以益氣活血為基本法則治療。而補(bǔ)肺湯出自李仲南《永類鈐方》，是中醫(yī)治療肺氣虛的經(jīng)典之方，主要由人參、黃芪、熟地、五味子、紫菀、桑白皮組成，六藥合用，為益氣護(hù)陰、潤燥止咳，顧全肺脾腎三臟之方。方中參芪以其歸脾肺經(jīng)，用于補(bǔ)二者虛弱之氣。熟地滋腎填精，滋下潤上，使肺得潤而降。五味子酸能收斂，性溫而潤，上斂肺氣，下滋腎陰，用于肺腎兩虛之咳喘。桑白皮歸肺經(jīng)瀉肺化痰。紫菀性溫而潤，潤肺之虛燥，止咳化痰，為久咳之圣藥。很多學(xué)者應(yīng)用補(bǔ)肺湯治療肺系疾病，療效顯著[5-6]。

在肺纖維化發(fā)生時(shí)，HYP、HA、LN的含量常用來反映膠原沉積和纖維增生的程度[9]。HYP在膠原組織中占13.4%，是機(jī)體膠原纖維所特有的氨基酸，是衡量膠原組織代謝和纖維化程度的重要指標(biāo)，因此檢測肺組織中HYP含量常用來反映膠原纖維增生的情況[10]。HA是肺間質(zhì)中主要的糖胺聚糖，廣泛存在于胞外基質(zhì)，為炎性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增生提供大量基質(zhì)，加速纖維組織的形成，是重要的血清纖維化指標(biāo)[11-12]。LN主要存在于基底膜透明層中的大分子非膠原糖蛋白，能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞合成膠原[13]。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠血清中HYP、HA、LN的含量顯著升高，說明肺纖維化小鼠的肺纖維化程度明顯加重。與模型對(duì)照組比較，補(bǔ)肺湯小、大劑量組可顯著降低肺纖維化小鼠血清中HYP、HA、LN的水平，說明補(bǔ)肺湯通過抑制膠原沉積和纖維增生，對(duì)博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠發(fā)揮明確療效。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.吡非尼酮組；D.補(bǔ)肺湯小劑量組；E.補(bǔ)肺湯大劑量組。

A.normal control group；B.model control group；C.pifenidone group；D.low-doseBufeidecoction group；E.high-doseBufeidecoction group.

Fig.1 Pulmonary histomorphology and pathology in five groups of mice(×100)

表2 5組小鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分

組別肺泡炎評(píng)分肺纖維化評(píng)分正常對(duì)照組0.00±0.000.00±0.00模型對(duì)照組2.59±0.63①2.77±0.29①吡非尼酮組0.83±0.79①②0.91±0.27①②補(bǔ)肺湯 小劑量組1.38±0.32①②1.73±0.61①② 大劑量組1.14±0.57①②1.38±0.42①②

①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05.

TGF-β是最直接的促纖維化細(xì)胞因子，通過促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞增殖、分化來誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，抑制肺間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)降解，從而產(chǎn)生纖維化，被認(rèn)為是是肺纖維化發(fā)生的誘導(dǎo)和啟動(dòng)因子[14]。Smad3是TGF-β的下游受體調(diào)節(jié)型蛋白，活化后形成p-Smad3，從而調(diào)節(jié)膠原等基因的表達(dá)，誘導(dǎo)并促進(jìn)成纖維轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞，從而增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，誘發(fā)肺組織纖維化樣改變[15-16]。α-SMA是活化的成纖維細(xì)胞即肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志，參與合成Collagen I等細(xì)胞外基質(zhì)成分，促進(jìn)纖維化的發(fā)生[17]。Collagen I是細(xì)胞外基質(zhì)中膠原的主要成分，占正常人肺中總間質(zhì)膠原的60%～70%，隨著肺纖維化病程的進(jìn)展，Collagen I的表達(dá)上調(diào)，在肺間質(zhì)中沉積，使得肺組織結(jié)構(gòu)紊亂而發(fā)生肺纖維化[18]。蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，模型對(duì)照組中TGF-β、p-Smad3、α-SMA和Collagen I表達(dá)明顯升高。TGF-β、p-Smad3的蛋白表達(dá)上調(diào)意味著TGF-β/Smad3信號(hào)通路的激活，而下游α-SMA以及Collagen I蛋白表達(dá)的上調(diào)標(biāo)志著成纖維細(xì)胞的活化和膠原纖維的大量沉積。這說明肺纖維化小鼠TGF-β/Smad3信號(hào)通路被激活后，能引起成纖維細(xì)胞大量活化轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞，從而促進(jìn)膠原纖維的大量聚集，纖維化進(jìn)程加快。而補(bǔ)肺湯小、大劑量組以及吡非尼酮組中TGF-β、p-Smad3、α-SMA和Collagen I表達(dá)均顯著下降，說明補(bǔ)肺湯通過抑制TGF-β/Smad3信號(hào)通路，對(duì)成纖維細(xì)胞的形成和膠原沉積發(fā)揮抑制作用。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.吡非尼酮組；D.補(bǔ)肺湯小劑量組；E.補(bǔ)肺湯大劑量組。①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05。

A.normal control group；B.model control group；C.pifenidone group；D.low-doseBufeidecoction group；E.high-doseBufeidecoction group；①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05.

綜上所述，本研究結(jié)果表明補(bǔ)肺湯可通過抑制TGF-β/Smad3信號(hào)通路，下調(diào)血清纖維化指標(biāo)HYP、HA、LN的含量，抑制成纖維細(xì)胞的活化和Collagen I的表達(dá)，從而改善其肺組織纖維化和肺泡炎情況，抑制小鼠的肺纖維化的進(jìn)展。