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    中藥復(fù)方筋脈通對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠肝臟損傷和脂肪變性的保護(hù)作用

    2020-06-18 12:12:42孫青薛曉偉閆斌田國(guó)慶梁曉春
    環(huán)球中醫(yī)藥 2020年5期
    關(guān)鍵詞:通組筋脈變性

    孫青 薛曉偉 閆斌 田國(guó)慶 梁曉春

    非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷,其疾病譜包括非酒精性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)、肝硬化和肝細(xì)胞癌[1-2]。近年來(lái),胰島素抵抗和肥胖在1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)發(fā)病機(jī)制中的作用受到關(guān)注[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)成人T1DM患者NAFLD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加[4-5];研究證實(shí)鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)T1DM大鼠可見(jiàn)肝臟脂肪變性[6-7],其具體機(jī)制尚不清楚,缺乏有效治療方法。本研究擬初步探索中藥復(fù)方筋脈通對(duì)STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠肝臟損傷和脂肪變性等表型的保護(hù)作用,為進(jìn)一步機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

    6~8周齡雄性SD大鼠,體重180~200 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2011-0004。于北京協(xié)和醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng),維持飼料喂養(yǎng),進(jìn)食、飲水不限。筋脈通膠囊為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院院內(nèi)制劑,由菟絲子10 g、女貞子10 g、水蛭3 g、延胡索10 g、桂枝10 g、細(xì)辛3 g等組成,每粒含生藥0.35 g,由北京九龍制藥廠加工生產(chǎn)(批號(hào)120119)。STZ購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;血糖儀購(gòu)自美國(guó)Abbott公司;蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)液購(gòu)自北京九州柏林生物科技有限公司;Masson三色染色液購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

    1.2 動(dòng)物分組及給藥

    SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天,隨機(jī)分正常對(duì)照組和糖尿病組和筋脈通組,每組各8只。造模前禁食過(guò)夜,正常對(duì)照組注射等量的枸櫞酸鹽緩沖液,糖尿病組和筋脈通組一次性腹腔注射1%STZ 55 mg/kg(0.1 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液配制,pH 4.5)。72小時(shí)后用血糖儀測(cè)定尾尖血糖,正常對(duì)照組大鼠血糖<7.0 mmol/L,糖尿病組和筋脈通組大鼠血糖≥16.7 mmol/L為造模成功,筋脈通組按成人劑量10倍(0.876 g·kg-1·d-1)灌胃,每日1次,糖尿病組和筋脈通組灌胃等量的生理鹽水,連續(xù)灌胃12周,每4周監(jiān)測(cè)血糖、體重。

    1.3 組織取材

    灌胃12周后禁食過(guò)夜,次日空腹測(cè)量體重,予12%烏拉坦腹腔注射麻醉,頸動(dòng)脈取血,離心取血清并分裝,-80℃保存,用于檢測(cè)肝功、血脂。仰臥位固定,開(kāi)腹取肝臟,稱重后置于冰上,切取部分肝組織置于10%中性福爾馬林緩沖液固定,用于常規(guī)石蠟包埋和病理切片。

    1.4 指標(biāo)檢測(cè)

    肝/體重的比值、肝功、血脂用肝臟重量除以體重以計(jì)算肝/體重的比值,采用乳酸脫氫酶法檢測(cè)大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)表達(dá),酶法測(cè)定血清總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、游離脂肪酸(free fatty acid,F(xiàn)FA)水平。

    1.5 HE染色

    每組隨機(jī)選擇6只大鼠的樣本進(jìn)行HE染色。對(duì)各組的肝組織樣本進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片后進(jìn)行HE染色,NanoZoomer數(shù)字病理切片掃描儀掃描后利用NDP.view軟件導(dǎo)出圖片,觀察肝組織的病理學(xué)改變。由病理學(xué)專家讀片判定NAFLD活動(dòng)評(píng)分(NAFLD activity score, NAS)。NAS評(píng)分(0~8分):(1)肝細(xì)胞脂肪變:0分(<5%),1分(5%~33%),2分(34%~66%),3分(>66%);(2)小葉內(nèi)炎癥(20倍鏡計(jì)數(shù)壞死灶):0分(無(wú)),1分(<2個(gè)),2分(2~4個(gè)),3分(>4個(gè));(3)肝細(xì)胞氣球樣變:0分(無(wú)),1分(少見(jiàn)),2分(多見(jiàn))[8]。

    1.6 Masson染色

    每組隨機(jī)選擇6只大鼠的樣本進(jìn)行Masson染色。切片常規(guī)脫蠟至水,Weigert鐵蘇木素染色10分鐘,酸性乙醇分化液分化,Masson藍(lán)化液返藍(lán);麗春紅品紅染色5分鐘,磷鉬酸溶液分化;苯胺藍(lán)溶液染色10分鐘,弱酸工作液浸泡沖洗。梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。掃描切片后導(dǎo)出圖片。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 血糖、體重結(jié)果

    造模后各組大鼠體重?zé)o明顯差異(P>0.05),自第4周起糖尿病組和筋脈通組大鼠體重較正常對(duì)照組顯著下降(P<0.05),糖尿病組和筋脈通組間差異不顯著(P>0.05)。造模后糖尿病組和筋脈通組大鼠血糖與正常對(duì)照組比較顯著升高(P<0.01),并持續(xù)至第12周,糖尿病組和筋脈通組間血糖無(wú)明顯差異(P>0.05)[9]。

    2.2 血脂、肝/體重比值、肝功能、血脂結(jié)果

    灌胃12周后,各組大鼠血清TC水平無(wú)顯著性差異(P>0.05),而糖尿病組大鼠血清TG和FFA表達(dá)較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.05),筋脈通組大鼠TG、FFA水平較糖尿病組大鼠均明顯降低(P<0.05),可見(jiàn)筋脈通可改善TG和FFA異常。結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 灌胃12周后各組大鼠血清中TC、TG、FFA 的表達(dá)情況

    注: 與正常對(duì)照組比較,aP<0.05;與糖尿病組比較,bP<0.05。

    灌胃12周后,糖尿病組和筋脈通組大鼠的肝/體重的比值較正常對(duì)照組均顯著升高,且有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。肝功能方面,糖尿病組大鼠血清ALT和AST表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而與糖尿病組相比,筋脈通組大鼠血清ALT、AST水平顯著降低,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

    表2 灌胃12周后各組大鼠肝/體重比值、ALT、AST 的表達(dá)情況

    注: 與正常對(duì)照組比較,aP<0.05;與糖尿病組比較,bP<0.05。

    2.3 HE染色結(jié)果

    形態(tài)方面,正常對(duì)照組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整、清晰,中央靜脈大而壁薄,細(xì)胞形態(tài)正常;糖尿病組可見(jiàn)彌漫性肝細(xì)胞脂肪變,以小泡性脂肪變?yōu)橹?,但未?jiàn)明顯的肝細(xì)胞氣球樣變;肝小葉結(jié)構(gòu)模糊,伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),部分可見(jiàn)壞死灶。筋脈通組肝細(xì)胞脂肪變的面積、程度和炎性浸潤(rùn)等情況均明顯優(yōu)于糖尿病組。結(jié)果見(jiàn)圖1。

    2.4 脂肪變性評(píng)分、炎癥評(píng)分、NAS評(píng)分結(jié)果

    與正常對(duì)照組相比,糖尿病組的脂肪變性評(píng)分和炎癥評(píng)分均顯著升高(P<0.05),未見(jiàn)明顯的氣球樣變。與糖尿病組比較,筋脈通組的脂肪變性評(píng)分和炎癥評(píng)分明顯降低(P<0.05)。計(jì)算NAS評(píng)分,正常對(duì)照組最低,糖尿病組最高,筋脈通組介于兩者之間。與正常對(duì)照組相比,糖尿病組NAS評(píng)分升高(P<0.05);筋脈通組與糖尿病組相比,NAS評(píng)分明顯降低且差異顯著(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

    表3 灌胃12周后各組大鼠脂肪變性評(píng)分、 炎癥評(píng)分NAS評(píng)分結(jié)果分)

    注: 與正常對(duì)照組比較,aP<0.05;與糖尿病組比較,bP<0.05。

    2.5 Masson染色結(jié)果

    Masson染色可將膠原纖維染成藍(lán)色,提示組織纖維化程度,細(xì)胞漿、肌纖維呈紅色,細(xì)胞核呈藍(lán)黑色。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,灌胃12周后各組大鼠肝臟組織均未見(jiàn)明顯的肝竇周染藍(lán)色。結(jié)果見(jiàn)圖2。

    注:A、B:正常對(duì)照組;C、D:糖尿病組;E、F:筋脈通組(A、C、E×200;B、D、F×400)。

    圖1 各組大鼠肝臟組織HE染色結(jié)果

    注:A:正常對(duì)照組;B: 糖尿病組;C: 筋脈通組。

    圖2 各組大鼠肝臟組織Masson染色結(jié)果(×400)

    3 討論

    隨著肥胖和代謝綜合征的流行,NAFLD已成為中國(guó)第一大慢性肝病和健康體檢肝功能異常的首要原因[10]。臨床以生活方式干預(yù)和針對(duì)代謝綜合征各組分的藥物治療為主,但無(wú)臨床證據(jù)顯示這些藥物可改善NASH和肝纖維化,間隔肝纖維化和肝硬化是NAFLD患者肝病不良結(jié)局的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素,而NASH更易進(jìn)展為肝纖維化[11-12],目前NAFLD缺乏有效治療方法,亟待深入研究。T1DM是一種多因素免疫介導(dǎo)的疾病,由遺傳易感性和環(huán)境危險(xiǎn)因素相互作用導(dǎo)致,發(fā)病年齡輕,血糖較難控制,并發(fā)癥出現(xiàn)早,其發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明。近年來(lái)有學(xué)者提出“雙重糖尿病”假說(shuō),認(rèn)為部分患者同時(shí)具有T1DM(胰島β細(xì)胞被破壞)和T2DM(胰島素抵抗)的病因[3],患有雙重糖尿病的個(gè)體同時(shí)存在代謝失調(diào)和自身免疫異常,其遺傳學(xué)特征與T1DM患者極為相似。因此,如果這類患者合并NAFLD,治療難度更大,且進(jìn)一步增加心血管疾病患病風(fēng)險(xiǎn)[4]。

    中藥復(fù)方筋脈通主要由菟絲子、女貞子、延胡索、水蛭、細(xì)辛、桂枝等藥物組成。方中菟絲子配女貞子補(bǔ)益腎之氣陰;延胡索行氣活血止痛,水蛭為血肉有情之品,配伍延胡索加強(qiáng)活血逐瘀之功;桂枝、細(xì)辛振奮氣血、溫通血脈。全方共奏補(bǔ)腎活血、溫通經(jīng)脈之功效,臨床用于治療糖尿病周圍神經(jīng)病變療效確切[13]。既往研究證實(shí),筋脈通能夠改善T2DM患者及STZ誘導(dǎo)T1DM大鼠糖脂代謝[13-14],并通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抗炎以及抗細(xì)胞凋亡等機(jī)制而起到神經(jīng)保護(hù)作用[9,15-16],而糖脂代謝紊亂、炎癥及氧化應(yīng)激等在NAFLD發(fā)病中的作用已得到公認(rèn)。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),菟絲子中主要活性成分槲皮素[17],女貞子中提取出的齊墩果酸和熊果酸[18]能夠改善NASH肝臟炎癥和脂肪變性;天然水蛭素有抗肝纖維化的作用[19]。因此,推測(cè)筋脈通對(duì)于T1DM大鼠肝臟具有保護(hù)作用。

    本研究采用單次大劑量腹腔注射STZ成功復(fù)制T1DM動(dòng)物模型[9]。T1DM時(shí)胰島素絕對(duì)缺乏,肝臟葡萄糖輸出增加,外周組織葡萄糖攝取減少,同時(shí)糖酵解生成ATP供能途徑受阻,此時(shí)機(jī)體主要依靠動(dòng)員脂肪和蛋白質(zhì)分解來(lái)提供能量,最終導(dǎo)致血液葡萄糖和FFA水平顯著增高。過(guò)多的游離脂肪酸由肝細(xì)胞攝取并氧化成脂肪乙酰輔酶A。當(dāng)肝內(nèi)乙酰輔酶A過(guò)多而超過(guò)其氧化利用時(shí),部分轉(zhuǎn)化為TG。當(dāng)TG合成超過(guò)其排泄時(shí)則貯積于肝細(xì)胞內(nèi)形成脂肪肝。本研究結(jié)果顯示,造模成功12周時(shí)糖尿病組肝/體重的比值增加,血清TG、FFA水平明顯升高,HE染色可見(jiàn)彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性,以小泡性脂肪變?yōu)橹鳎匆?jiàn)明顯氣球樣變,與T2DM誘發(fā)的大、小脂滴并存的混合性脂肪肝,伴明顯氣球樣變不同[20]。而筋脈通干預(yù)可顯著下調(diào)肝/體重的比值,減輕血清脂代謝紊亂,改善肝臟脂肪變性。

    NASH更易進(jìn)展為肝纖維化,最終發(fā)展為肝硬化和肝癌。本研究結(jié)果顯示,糖尿病組大鼠血清ALT、AST水平顯著升高,提示存在肝細(xì)胞損傷;肝組織HE染色可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)模糊,伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),部分可見(jiàn)壞死灶,提示存在肝小葉炎癥。而筋脈通治療可明顯減輕血清和肝組織的炎癥狀態(tài)、壞死等,從而起到改善NASH的作用。根據(jù)肝臟脂肪變性、炎癥以及氣球樣變程度計(jì)算NAS評(píng)分可見(jiàn)糖尿病組最高,正常對(duì)照組最低,筋脈通組介于兩者之間,表明筋脈通可明顯減輕肝臟脂肪變性和小葉內(nèi)炎癥。肝組織Masson染色結(jié)果顯示,T1DM大鼠造模成功12周未見(jiàn)明顯竇周纖維化,可能與病程較短有關(guān)。

    總之,本研究表明T1DM合并NAFLD肝組織學(xué)改變以小泡性脂肪變性為主,部分伴灶性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、壞死,不伴明顯氣球樣變及纖維化。筋脈通能夠改善血清肝功能異常及脂代謝紊亂,減輕肝細(xì)胞脂肪變性、炎性浸潤(rùn)和壞死,從而起到肝臟保護(hù)作用。進(jìn)一步深入探索作用機(jī)制是今后研究的方向。

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