四種不同品種靈芝的質(zhì)量研究

趙 慧

天津市河西區(qū)口腔醫(yī)院藥劑科(天津 300000)

靈芝為擔(dān)子菌綱，多孔菌科、靈芝屬真菌的總稱[1]?！吨腥A人民共和國藥典》2015年版收載的靈芝藥材是赤芝[Ganodermalucidum(Leys.ex Fr.)Karst]或紫芝[Ganodermajaponicum(Fr.)Lloyd]的干燥子實體[2]。具有補中益氣、延年益壽、扶正固本、滋陰強壯等功效[3]?？茖W(xué)研究證實[4]，靈芝多糖類和三萜類是其主要的藥理活性成分?！吨腥A人民共和國藥典》2015年版中以靈芝多糖含量的高低作為評價靈芝質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一,日本等國家則以靈芝酸含量的高低來控制靈芝的質(zhì)量[5]。

近年來隨著靈芝在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖等方面的作用逐步被人們所認識，市場上的靈芝產(chǎn)品日益增多，靈芝保健品、藥用產(chǎn)品不斷升溫，靈芝藥材的市場需求量也日益增大，然而,野生靈芝資源有限,人工栽培的靈芝由于產(chǎn)地、栽培技術(shù)、采收條件等的差異,導(dǎo)致市場上的靈芝產(chǎn)品良莠不齊，本實驗選取了靈芝的道地產(chǎn)區(qū)安徽大別山區(qū)的兩種靈芝以及山東和東北兩大人工栽培靈芝的主要產(chǎn)區(qū)的靈芝，從靈芝總多糖的含量和靈芝酸類成分HPLC指紋圖譜兩方面對這幾個產(chǎn)地的靈芝的質(zhì)量進行研究，從而為靈芝原料的采購提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1實驗材料本實驗所用靈芝分別為安徽大別山松杉靈芝、安徽大別山密紋靈芝、東北赤芝、山東紫芝(采集時間：2018年10月)，經(jīng)黃崔生教授鑒定均符合藥典要求的赤芝和紫芝類。

1.2儀器與試劑Agilent 1200高效液相色譜儀；UV-1206紫外分光光度計(日本島津公司)；AEL-200電子天平(xiangxiBanlance factory)；AB204-N分析天平(梅特勒托利多儀器公司)；葡萄糖對照品(中國藥品生物制品檢定所)；乙腈(色譜級)；磷酸(分析純)；香草醛(分析純)；冰醋酸(分析純)等。

2 方法與結(jié)果

2.1靈芝多糖含量測定參照《中國藥典》2015年版一部中靈芝多糖的含量測定方法，建立了適合本實驗樣品的靈芝多糖含量測定方法。本實驗采用索氏提取法對靈芝多糖進行提取，蒽酮-硫酸法測定其含量，并對線性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收進行了考察。

2.1.1 靈芝多糖的含量測定方法 ①對照品溶液的制備。取一定量的葡萄糖對照品105℃干燥至恒重，精密稱取10 mg，用重蒸水溶解，定容至100 mL制成0.1 mg/mL的葡萄糖對照品溶液。②供試品溶液制備。取靈芝藥材粉末2 g，精密稱定，置索氏提取器中，加水90 mL，移置電熱套中，加熱回流提取至提取液無色，將提取液轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密吸取提取液10 mL，置250 mL具塞三角瓶中，加入乙醇150 mL，搖勻，4℃放置12 h，取出，離心，棄去上清液，沉淀加水溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。③含量測定方法。精密吸取供試品溶液2 mL,置10 mL具塞試管中，精密加入硫酸蒽酮溶液(精密稱取蒽酮0.1 g,加入80%的硫酸溶液100 mL,使溶解，即得)6 mL，搖勻，置沸水浴中加熱15 min，取出，放入冰浴中冷卻，以相應(yīng)的試劑為空白，依照紫外-可見分光法在625 nm處測定吸收值。

2.1.2 靈芝多糖含量測定的方法學(xué)考察 ①線性關(guān)系的考察。分別精密吸取對照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，分別置10 mL具塞試管中，加蒸餾水至2.0 mL，精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL，搖勻，置沸水浴中加熱15 min，取出，放入冰浴中冷卻15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，在625 nm的波長處測定吸收度，以吸收值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.004 6x+0.018 1(r=0.999 2)，葡萄糖的加入量在20～120 μg的范圍內(nèi)與吸收度呈良好的線性關(guān)系。②精密度試驗。分別精密吸取同一葡萄糖對照品溶液(0.1 mg/mL)0.6 mL,依照上述顯色方法，重復(fù)測定6次，測得吸收值的平均值為：0.323，RSD為：2.00%(n=6)，表明本方法葡萄糖對照品的顯色重復(fù)性良好。③重復(fù)性試驗。取同一批靈芝樣品6份，60℃干燥后粉碎，精密稱取靈芝粉末2 g，按照2.1.1②供試品溶液的制備方法制備供試品，分別吸取供試品溶液0.2 mL,依照上述含量測定方法進行靈芝多糖的含量測定，測得吸收值的平均值為：0.325，RSD值為：1.28%，表明此方法重復(fù)性良好。④穩(wěn)定性試驗。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.6 mL，依照2.1.1③的含量測定方法顯色，分別在顯色后5，10，15，20，25，30 min時進行測定，測得的吸收值平均值為：0.324，RSD為:0.57%(n=6),表明該方法穩(wěn)定性良好。⑤加樣回收試驗。本方法因無靈芝多糖對照品而以葡萄糖為對照品。多糖提取采用的是水提醇沉法，葡糖糖用乙醇無法使其沉淀，故用葡糖糖對照品溶液直接加入靈芝多糖提取液的辦法進行加樣回收實驗。

精密量取0.2 mL已知含量的靈芝多糖濃縮液9份，分為3組，分別精密加入濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖對照品溶液0.4、0.5、0.6 mL,按照上述含量測定方法測定其含量,計算回收率?；厥章史秶?8.53%～103.58%平均回收率為100.22%，RSD為1.78%，表明此方法回收率符合要求，見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

2.1.3 不同品種靈芝藥材中靈芝多糖含量比較 按照2.1.1③靈芝多糖的含量測定方法對4個產(chǎn)地的靈芝進行靈芝多糖的含量測定，見表2。

表2 不同產(chǎn)地靈芝藥材中靈芝多糖的含量比較

2.2不同品種靈芝子實體靈芝酸類成分HPLC指紋圖譜

2.2.1 供試品溶液[6]的制備 稱取靈芝藥材3 g加無水乙醇150 mL熱回流提取2 h，過濾，殘渣再無水乙醇150 mL回流2 h，共重復(fù)提取3次，濾液合并，減壓蒸干后加氯仿15 mL溶解，移至分液漏斗中，再用氯仿洗滌殘渣2次，合并氯仿液；用飽和碳酸氫鈉萃取氯仿4次(15 mL×4)，合并碳酸氫鈉液，用6 mol/mL鹽酸調(diào)節(jié)pH 2～3，用氯仿萃取4次(15 mL×4)，合并氯仿液，用水洗滌氯仿液，棄去水層，氯仿液用無水硫酸鈉干燥，過濾，用氯仿洗滌無水硫酸鈉3次(15 mL×3)，洗滌液與濾液合并，減壓蒸干，殘渣用甲醇溶解，過微孔濾膜。

2.2.2 色譜條件 流動相:乙腈和水梯度洗脫,梯度洗脫程序見表3;色譜柱:capcellC18柱;檢測波長：254 nm;柱溫:30℃;進樣量：30 μL;流速：0.8 mL/min。

表3 梯度洗脫表

2.2.3 試驗結(jié)果 4個產(chǎn)地靈芝的靈芝酸HPLC指紋圖譜見圖1～4。

圖1 大別山密紋靈芝

圖2 大別山松杉靈芝

圖3 東北赤芝

圖4 山東紫芝

3 討論

靈芝多糖具有提高機體免疫力、抗腫瘤、消除體內(nèi)自由基、降血糖、降血脂等作用[7]，本實驗利用蒽酮-硫酸法對靈芝的多糖含量進行測定，其中安徽大別山松杉靈芝多糖含量最高(16.37 mg/g)，其它品種的靈芝多糖含量從高到低依次為：安徽大別山密紋靈芝(15.83 mg/g)，東北赤芝(15.29 mg/g)，山東紫芝(14.96 mg/g)。靈芝三萜在免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤方面顯著效果[4]，其含量的高低直接決定了靈芝產(chǎn)品抑腫瘤效果的好壞。本實驗利用HPLC法測定了4個品種靈芝的靈芝酸類成分指紋圖譜，實驗結(jié)果顯示4個品種靈芝的靈芝酸類成分指紋圖譜具有明顯差異。

本實驗綜合評價了靈芝的藥效物質(zhì)，實驗結(jié)果表明由于地理氣候條件等許多因素的影響，各品種靈芝質(zhì)量存在差異，該實驗結(jié)果可為靈芝原料的采購提供可靠的理論依據(jù)。