白薇化學(xué)成分及其抗煙草花葉病毒活性研究

晏 英，湯 磊，王建塔，胡嘉琪，徐 冉，朱高峰，郝小江

1貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥衛(wèi)生管理學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省化學(xué)合成藥物研發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，貴陽(yáng) 550004；3貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550014

植物病毒是危害農(nóng)作物的一類重要病原，因其危害大、防治困難，俗有植物癌癥之稱。由于植物病毒對(duì)植物細(xì)胞的絕對(duì)寄生性，病毒復(fù)制所需要的物質(zhì)、能量場(chǎng)所等完全由寄主提供，病毒能夠脅迫寄主細(xì)胞的生化機(jī)理，使其與病毒本身的生化機(jī)理糾纏在一起難以識(shí)別，所以藥物難以只對(duì)病毒進(jìn)行選擇性攻擊而不傷害寄主細(xì)胞，導(dǎo)致研究高選擇性的化學(xué)抗病毒制劑面臨極大的困難，至今仍未取得重大突破，尚未出現(xiàn)國(guó)際公認(rèn)的抗TMV(tobacco mosaic virus，TMV)藥物[1]。煙草花葉病毒是其中最具代表性的病毒，該病毒發(fā)現(xiàn)110年以來，已發(fā)現(xiàn)可感染的植物高達(dá)500種以上。煙草花葉病毒病是煙草生產(chǎn)上的嚴(yán)重病害，煙草及其他農(nóng)作物感染TMV后，葉片葉綠素被破壞，光合作用減弱，生長(zhǎng)受抑制，造成植株生長(zhǎng)困難，畸形、矮化，甚至死亡。TMV的防治較為困難，可導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)幅度為20%～80%，全球每年因TMV造成的損失可達(dá)數(shù)億美元[2]。煙草病毒病的發(fā)生日趨嚴(yán)重，抗病毒制劑的研發(fā)和使用對(duì)于防治該病具有重要意義。

目前，傳統(tǒng)的抗病毒制劑往往效果不佳，或者對(duì)植物有毒害作用。運(yùn)用基因工程技術(shù)開發(fā)轉(zhuǎn)基因抗病品種，如弱毒疫苗衛(wèi)星核酸等又存在一定爭(zhēng)議，不容易被采納。植物源活性物質(zhì)抗病毒效果良好，其治療效果不亞于化學(xué)合成制劑，且資源豐富，綠色環(huán)保，不會(huì)造成環(huán)境污染和殘留毒性問題，具有廣闊的發(fā)展前景[3]。目前，從植物中分離得到的倍半萜內(nèi)酯、檸檬苦素、苦木素、石蒜生物堿、3-acetonyl-3-hydroxyoxindole(AHO)等化合物均有很強(qiáng)抗TMV活性，從植物中分離純化化合物(即天然產(chǎn)物)，篩選具有抗病毒活性的化合物，已經(jīng)被證實(shí)是一種有效對(duì)抗植物病毒的方法[4-6]。前期，課題組研究蘿藦科植物抗TMV活性成分的過程中，應(yīng)用TMV活性追蹤法，分離得到的抗TMV活性成分seco-pregnane類甾體苷。深入研究發(fā)現(xiàn)，該類化合物高選擇性地抑制TMV病毒亞基因組RNA的表達(dá)，而對(duì)病毒基因組RNA沒有影響[7]，此類化合物對(duì)TMV新穎的作用機(jī)制，有望突破抗植物病毒劑的瓶頸。同時(shí)植物中存在的化學(xué)防御物質(zhì)對(duì)植物本身的自毒性是較小的，同時(shí)具備特殊的識(shí)別病毒與寄主植物的能力，將有利于發(fā)現(xiàn)和研究新的抗病毒制劑。為了繼續(xù)尋找抗TMV的活性化學(xué)成分，進(jìn)一步開展蘿藦科白薇植物的化學(xué)成分研究和抗TMV活性研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

Bruker AM-400，Bruker AV-600 MHz核磁共振儀(德國(guó)布魯克公司)；Bruker HTC / Esquire 質(zhì)譜儀(德國(guó)布魯克公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化，N-1300D-WD)；Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技司)；BP211D電子天平(Sartorouius公司)；色譜柱Waters sunfire C18(10 × 150 mm，4.6 × 250 mm)(沃特世公司)； Sephadex LH-20(美國(guó)GE公司)；C18反相硅膠(日本 YMC 公司)；正相硅膠和薄層色譜板(青島海洋化工廠)；核磁用氘代試劑(美國(guó)CIL氘代試劑)；液相用水(娃哈哈純凈水20181109)；色譜級(jí)甲醇(科密歐試劑公司)；化學(xué)實(shí)驗(yàn)用溶劑為工業(yè)重蒸溶劑，顯色劑為8%的硫酸乙醇溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

供試毒源：TMV(U1)普通株系，中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所提供。保存于-20 ℃，臨用時(shí)取出用0.01 M PB稀釋至50 μg/mL。

供試寄主：TMV 局部枯斑寄主心葉煙(Nicotianaglutinosa)，本研究組自行培育，漂盤育苗，無蟲溫室中培育。挑選 6～8片葉齡，大小相似的健康植株作為實(shí)驗(yàn)材料。

供試化合物：從白薇中分離得到十個(gè)化合物，用DMSO溶解成10 mg /mL的母液于4 ℃存?zhèn)溆谩＿x用寧南霉素(ningnanmycin)作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。

樣品購(gòu)于貴州省貴陽(yáng)市萬東橋藥材市場(chǎng)，經(jīng)過貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院孫慶文老師鑒定為白薇，憑證標(biāo)本(BW2011～09)保存于貴州醫(yī)科大學(xué)省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 化合物提取與分離

干燥的白薇全株30 kg，粉碎后用90%的乙醇熱回流提取3次，每次時(shí)間為2 h，過濾，合并三次提取液，經(jīng)濃縮后得粗提物約4.5 kg，加水混溶成渾濁液體，先后用石油醚、氯仿等體積萃取3次，得到萃取液后分別濃縮，最終得石油醚部位萃取物(0.8 kg)、氯仿部位萃取物(1.63 kg)。氯仿部分經(jīng)過硅膠柱層析，用石油醚/丙酮(30∶1→5∶1)和二氯甲烷/甲醇(15∶1→1∶1)快速梯度洗脫得到Fr1～Fr10 共10個(gè)部分，其中Fr4(98 g)再次以二氯甲烷/甲醇(30∶1→5∶1)梯度洗脫，分成5個(gè)亞部分，分別為Fr4-1～Fr4-5。其中 Fr4-2經(jīng)過凝膠柱層析(氯仿∶甲醇=1∶1)得化合物1(19.0 mg)。Fr4-3通過反相柱層析 洗脫(甲醇∶水=758∶25)，再經(jīng)過硅膠柱層析(石油醚/丙酮=5∶1)及HPLC分離(流動(dòng)相為甲醇∶水=82∶28，流速為2 mL /min)得化合物2(12.7 mg)和4(9.2 mg)；Fr4-5通 過反復(fù)硅膠柱層析(石油醚/丙酮=5∶1)得到化合物3(18.9 mg)。Fr5(119 g)再次以二氯甲烷/甲醇(20∶1→5∶1)梯度洗脫，分成4個(gè)亞部分，分別為Fr5-1～Fr5-4。Fr5-1經(jīng)過反相柱層析洗脫(甲醇∶水=60∶40)，再經(jīng)過HPLC 制備分離(流動(dòng)相為甲醇∶水=80∶20， 流速 2 mL/min)得化合物6(14.1 mg)和8(13.8 mg)；Fr5-2通過凝膠柱層析(純甲醇)再經(jīng)過硅膠柱層析(石油醚/丙酮=6∶1)得化合物5(1.2 g)；Fr5-3通過凝膠柱層析(純甲醇)及高效液相色譜(流動(dòng)相為甲醇∶水=78∶22，流速為2 mL/min)制備分離純化，得到化合物7(10.7 mg)；Fr6(67 g)再次以二氯甲烷/甲醇(15∶1→5∶1)梯度洗脫，分成5個(gè)亞部分，分別為Fr6-1～Fr6-5。Fr6-1通過反復(fù)硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇=10∶1)后析出沉淀得到化合物10(321 mg)，F(xiàn)r6-2經(jīng)過反相柱層析洗脫(甲醇∶水=60∶40)，再通過凝膠柱層析(純甲醇)再經(jīng)過硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇=15∶1)得化合物9(89 mg)。

2.2 化合物活性篩選

2.2.1 化合物對(duì)TMV的鈍化作用實(shí)驗(yàn)

挑選健康長(zhǎng)勢(shì)一致的5～6葉期的心葉煙，暗室放置一夜。將供試化合物與50 μg/mL的TMV 1∶1(V/V)混合至所需濃度，混勻放置0.5 h。每棵煙挑選大小相似的4～6片葉子，每片葉子的一半摩擦接種化合物與TMV的混合溶液100 μL作為處理；另一半摩擦接種50 μg/mL的TMV100 μL作為陽(yáng)性對(duì)照；摩擦接種相應(yīng)濃度DMSO溶液的葉片作為空白[8]。2 h后用無菌水將葉表面的金剛砂洗凈。放入無蟲溫室中，3～4天后按公式計(jì)算：TMV抑制率=[1-(處理的平均枯斑數(shù)/陽(yáng)性對(duì)照的平均枯斑數(shù))]×100%。每個(gè)化合物重復(fù)三次。

2.2.2 化合物對(duì)TMV的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)

挑選健康長(zhǎng)勢(shì)一致的5～6葉期的心葉煙，暗室放置一夜。每棵煙挑選大小相似的4～6片葉子，供試化合物用無菌水稀釋為所需濃度，每片葉子的一半均勻施藥100 μL作為處理，24 h后每片葉子摩擦接種200 μg/mL TMV 200 μL，未施藥的一半作為陽(yáng)性對(duì)照，未施藥且摩擦接種相應(yīng)濃度DMSO溶液的葉片作為空白。2 h后用無菌水將葉表面的金剛砂洗凈。放入無蟲溫室中，3～4天后按公式計(jì)算TMV抑制率=[1-(處理的平均枯斑數(shù)/陽(yáng)性對(duì)照的平均枯斑數(shù))]×100%。每個(gè)化合物重復(fù)三次。

圖1 化合物1～10的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-10

2.2.3 化合物對(duì)TMV的治療作用實(shí)驗(yàn)

挑選健康長(zhǎng)勢(shì)一致的5～6葉期的心葉煙，暗室放置一夜。每棵煙挑選大小相似的4～6片葉子摩擦接種200 μg/mL TMV 200 μL，2 h后每片葉子的一半均勻施藥100 μL作為處理；另一半作為陽(yáng)性對(duì)照；未施藥且摩擦接種相應(yīng)濃度DMSO溶液的葉片作為空白。2 h后用無菌水將葉表面的金剛砂洗凈。放入無蟲溫室中，3～4天后按公式計(jì)算TMV抑制率=[1-(處理的平均枯斑數(shù)/陽(yáng)性對(duì)照的平均枯斑數(shù))]×100%。每個(gè)化合物重復(fù)三次。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色粉末；ESI-MS：m/z687 [M +Na]+，確定分子質(zhì)量664；分子式C35H52O12；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.26(1H，s，H-18)，5.40(1H，d，J=5.2 Hz，H-6)，5.31(1H，m，H-16)，4.83(1H，d，J=4.0 Hz，H-1′′)，4.50(1H，dd，J=1.6，9.6 Hz，H-1′)，4.21(1H，m，H-5′)，4.18(1H，dd，J=6.8，8.8 Hz，H-15β)，3.88(1H，t，J=9.2 Hz，H-15α)，3.42(3H，s，3′-OCH3)，3.41(3H，s，3′′-OCH3)，1.54(3H，s，H-21)，0.92(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：174.5(C-14)，143.8(C-18)，140.6(C-5)，120.4(C-6)，118.3(C-20)，113.8(C-13)，102.4(C-1′)，98.9(C-1′′)，85.5(C-3′)，80.2(C-4′)，77.8(C-3)，76.0(C-3′′)，75.6(C-16)，75.5(C-2′)，70.0(C-5′)，67.9(C-15)，67.8(C-4′′)，67.5(C-5′′)，60.3(C-7′)，56.1(C-17)，55.0(C-7′′)，52.5(C-9)，40.6(C-8)，38.6(C-10)，38.5(C-4)，36.3(C-1)，30.1(C-2′′)，30.0(C-2)，28.4(C-12)，27.9(C-7)，24.5(C-21)，23.8(C-11)，18.4(C-19)，17.9(C-6′′)，17.6(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物1為glaucogenin-C 3-O-α-L-diginopyranosyl-(1→4)-β-D-thevetopyranoside。

化合物2白色粉末；ESI-MS：m/z801 [M +Na]+，確定分子質(zhì)量778；分子式C41H62O14；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.25(1H，s，H-18)，5.40(1H，d，J=5.2 Hz，H-6)，5.33(1H，m，H-16)，5.03(1H，d，J=8.0 Hz，H-1′′)，4.81(1H，d，J=4.0 Hz，H-1′)，4.55(1H，d，J=8.4 Hz，H-1′′′)，4.18(1H，dd，J=7.2，8.8 Hz，H-15β)，4.05(1H，m，H-5′′)，3.87(1H，t，J=9.2 Hz，H-15α)，3.52(3H，s，3′′′-OCH3)，3.42(3H，s，3′-OCH3)，1.53(3H，s，H-21)，0.92(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：174.3(C-14)，143.6(C-18)，140.8(C-5)，120.4(C-6)，118.4(C-20)，114.5(C-13)，98.6(C-1′′)，98.4(C-1′′′)，98.2(C-1′)，82.2(C-4′)，81.0(C-4′′)，79.1(C-3′)，77.5(C-3)，77.4(C-3′′′)，76.5(C-16)，72.6(C-4′′′)，71.8(C-5′)，69.2(C-5′′)，68.0(C-3′′)，67.5(C-15)，66.7(C-5′′′)，57.3(C-7′)，56.7(C-7′′′)，56.2(C-17)，53.1 (C-9)，40.8(C-8)，39.2(C-4)，38.6(C-10)，38.5(C-2′′)，38.1(C-2′)，36.5(C-1)，32.2(C-2′′′)，30.2(C-2)，29.1(C-7)，28.5(C-12)，24.5(C-21)，24.3(C-11)，18.9(C-6′)，18.4(C-6′′)，18.3(C-6′′′)，18.0(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物2為glaucogenin-C 3-O-β-D-oleandropyranosyl-(1→4)-β-D-digitoxopyranosy1-(1→4)-α-L-cymaropyranoside。

化合物3白色粉末；ESI-MS：m/z851 [M +Na]+，確定分子質(zhì)量828；分子式C40H60O18；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.26(1H，s，H-18)，5.40(1H，m，H-6)，5.33(1H，m，H-16)，4.97(1H，dd，J=2.0，10.0 Hz，H-1′)，4.49(1H，m，H-1′′)，4.48(1H，d，J=8.0 Hz，H-1′′′)，4.19(1H，t，J=8.0 Hz，H-15β)，3.87(1H，t，J=9.6 Hz，H-15α)，3.46(3H，s，3′-OCH3)，3.43(3H，m，H-5′′)，1.54(3H，s，H-21)，0.92(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：175.6(C-14)，143.9(C-18)，140.8(C-5)，120.7(C-6)，118.4(C-20)，114.4(C-13)，104.3(C-1′′′)，102.9(C-1′′)，98.3(C-1′)，82.4(C-4′)，78.8(C-5′′)，78.4(C-5′′′)，78.2(C-3′′′)，77.6(C-3)，77.6(C-3′′)，77.3(C-3′)，75.6(C-16)，75.4(C-2′′′)，74.5(C-2′′)， 72.5(C-4′′′)，71.9(C-4′′)，71.4(C-5′)，69.3(C-6′′)，67.5(C-15)，66.3(C-6′′′)，57.7(C-7′)，53.5(C-17)，53.3(C-9)，40.8(C-8)，39.1(C-4)，38.8(C-10)，38.1(C-2′)，36.5(C-1)，30.1(C-2)，30.0(C-7)，29.8(C-12)，24.5(C-21)，24.3(C-11)，18.1(C-6′)，18.0(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物3為glaucogenin-C 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-oleandropyranoside。

化合物4白色粉末；ESI-MS：m/z817 [M +Na]+，確定分子質(zhì)量794；分子式C41H62O15；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.26(1H，s，H-18)，5.43(1H，d，J=5.2 Hz，H-6)，5.31(1H，m，H-16)，5.02(1H，m，H-1′′)，4.77(1H，dd，J=1.8，9.6 Hz，H-1′)，4.58(1H，d，J=3.6 Hz，H-1′′′)，4.17(1H，t，J=7.2 Hz，H-15β)，3.87(1H，t，J=9.6 Hz，H-15α)，3.42(3H，s，3′′′-OCH3)，3.41(3H，s，3′-OCH3)，1.56(1H，m，H-2′′′β)，1.55(3H，s，H-21)，0.93(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：175.4(C-14)，143.9(C-18)，139.8(C-5)，120.3(C-6)，118.0(C-20)，114.4(C-13)，99.5(C-1′′′)，99.2(C-1′′)，98.6(C-1′)，86.2(C-3)，82.2(C-4′)，80.4(C-4′′)，79.0(C-3′′′)，78.6(C-3′)，75.6(C-4′′′)，75.0(C-16)，72.0(C-5′)，70.5(C-2)，69.5(C-5′′)，69.4(C-5′′′)，67.5(C-15)，67.5(C-3′′)，57.4(C-7′)，57.0(C-7′′′)，55.6(C-17)，50.5(C-9)，43.6(C-1)，40.1(C-8)，39.8(C-10)，39.7(C-4)，38.6(C-2′′)，38.0(C-2′)，35.3(C-2′′′)，29.8(C-12)，29.6(C-7)，24.5(C-21)，24.3(C-11)，18.1(C-19)，18.1(C-6′)，18.0(C-6′′)，18.0(C-6′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物4為glaucogenin-A 3-O-α-L-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-digitoxopyranosyl-(1→4) -β-D-oleandropyranoside。

化合物5白色粉末；ESI-MS：m/z831 [M +Na]+，確定分子質(zhì)量808；分子式C42H64O15；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.27(1H，s，H-18)，5.40(1H，d，J=5.4 Hz，H-6)，5.33(1H，m，H-16)，4.97(1H，dd，J=1.8，9.6 Hz，H-1′)，4.80(1H，d，J=3.6 Hz，H-1′′′)，4.47(1H，dd，J=1.8，9.6 Hz，H-1′′)，4.18(1H，t，J=7.2 Hz，H-15β)，3.87(1H，t，J=9.6 Hz，H-15α)，3.47(3H，s，3′-OCH3)，3.42(3H，s，3′′′-OCH3)，3.41(3H，s，3′′-OCH3)，1.53(3H，s，H-21)，0.95(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:175.7(C-14)，143.8(C-18)，140.5(C-5)，120.5 (C-6)，119.0(C-20)，114.3(C-13)，100.5(C-1′′′)，99.3(C-1′)，98.5(C-1′′)，85.8(C-3)，82.6(C-4′)，82.4(C-4′′)，79.2(C-3′′′)，79.0(C-3′)，77.6(C-3′′)，76.9(C-4′′′)，75.6(C-16)，71.4(C-5′)，69.7(C-5′′′)，69.6(C-2)，69.5(C-5′′)，67.5(C-15)，57.5(C-7′)，57.0(C-7′′′)，56.8(C-7′′)，55.5(C-17)，50.2(C-9)，44.5(C-1)，40.3(C-8)，39.5(C-10)，37.8(C-2′)，37.2(C-4)，36.2(C-2′′)，35.8(C-2′′′)，29.8(C-12)，29.6(C-7)，24.5(C-21)，23.7(C-11)，18.5(C-6′′′)，18.3(C-6′)，18.3(C-6′′)，18.1(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物5為glaucogenin-A 3-O-α-L-diginopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-oleandrop-yranoside。

化合物6白色粉末；ESI-MS：m/z831 [M +Na]+，確定分子質(zhì)量808；分子式C42H64O15；1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ：6.27(1H，s，H-18)，5.41(1H，d，J=5.4 Hz，H-6)，5.31(1H，m，H-16)，4.97(1H，d，J=3.6 Hz，H-1′′′)，4.96(1H，dd，J=1.8，9.6 Hz，H-1′)，4.50(1H，dd，J=2.0，10.0 Hz，H-1′′)，4.18(1H，t，J=8.4 Hz，H-15β)，3.87(1H，t，J=9.6 Hz，H-15α)，3.86(1H，m，H-5′)，3.73(1H，m，H-2)，3.46(3H，s，3′-OCH3)，3.43(3H，s，3′′-OCH3)，3.40(3H，s，3′′′-OCH3)，1.54(3H，s，H-21)，0.97(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：175.4(C-14)，143.9(C-18)，139.8(C-5)，120.4(C-6)，118.6(C-20)，114.4(C-13)，98.7(C-1′)，98.5(C-1′′)，98.0(C-1′′′)，85.6(C-3)，82.7(C-4′)，81.6(C-4′′)，79.9(C-3′)，77.6(C-3′′)，76.2(C-3′′′)，75.6(C-16)，73.0(C-4′′′)，72.9(C-5′)，69.6(C-2)，69.5(C-5′′)，67.6(C-5′′′)，67.5(C-15)，58.0(C-7′′)，57.0(C-7′)，56.3(C-7′′′)，56.2(C-17)，52.7(C-9)，44.6(C-1)，39.8(C-8)，39.5(C-10)，37.6(C-4)，37.5(C-2′)，36.8(C-2′′)，32.1(C-2′′′)，29.9(C-7)，29.6(C-12)，24.5(C-21)，23.5(C-11)，18.5(C-6′)，18.0(C-6′′)，17.9(C-19)，17.9(C-6′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物6為glaucogenin-A 3-O-α-L-cymaropyranos-yl-(1→4)-α-L-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-oleandropyranoside。

化合物7白色粉末；ESI-MS：m/z831 [M +Na]+，確定分子質(zhì)量808；分子式C42H64O15；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.28(1H，s，H-18)，5.43(1H，d，J=5.4 Hz，H-6)，5.29(1H，m，H-16)，5.00(1H，d，J=3.6 Hz，H-1′′′)，4.56(1H，dd，J=1.8，9.6 Hz，H-1′)，4.52(1H，dd，J=2.0，10.0 Hz，H-1′′)，4.18(1H，dd，J=6.8，8.4 Hz，H-15β)，3.87(1H，t，J=8.8 Hz，H-15α)，3.43(3H，s，3′′′-OCH3)，3.41(3H，s，3′-OCH3)，3.40(3H，s，3′′-OCH3)，1.50(3H，s，H-21)，0.94(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：175.1(C-14)，143.8(C-18)，139.7(C-5)，120.3(C-6)，118.1(C-20)，114.1(C-13)，99.0(C-1′′′)，98.6(C-1′′)，97.9(C-1′)，85.2(C-3)，82.0(C-4′)，81.7(C-4′′)，77.8(C-3′′)，77.6(C-3′)，76.3(C-3′′′)，75.5(C-16)，72.8(C-4′′′)，69.6(C-2)，69.3(C-5′)，69.1(C-5′′)，67.5(C-15)，66.8(C-5′′′)，57.4(C-7′)，56.8(C-7′′)，56.5(C-7′′′)，56.4(C-17)，52.3(C-9)，44.3(C-1)，39.9(C-8)，39.1(C-10)，37.7(C-4)，37.1(C-2′)，36.9(C-2′′)，32.0(C-2′′′)，30.0(C-7)，29.6(C-12)，24.7(C-21)，23.8(C-11)，18.5(C-6′)，18.1(C-19)，18.1(C-6′′′)，18.0(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物7為glaucogenin-A 3-O-α-L-cymaropyranosyl-(1→4)-β-L-cymaropyranosyl-(1→4)-β-L-cymarop-yranoside。

化合物8白色粉末；ESI-MS：m/z831 [M +Na]+，確定分子質(zhì)量808；分子式C42H64O15；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.28(1H，s，H-18)，5.43(1H，d，J=5.4 Hz，H-6)，5.31(1H，m，H-16)，4.91(1H，d，J=3.6 Hz，H-1′′′)，4.58(1H，dd，J=3.2，5.2 Hz，H-1′′)，4.56(1H，dd，J=1.8，9.6 Hz，H-1′)，4.18(1H，t，J=7.8 Hz，H-15β)，4.14(1H，m，H-4′′′)，3.87(1H，t，J=9.2 Hz，H-15α)，3.42(3H，s，3′′-OCH3)，3.41(3H，s，3′′′-OCH3)，3.40(3H，s，3′-OCH3)，1.53(3H，s，H-21)，0.95(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：174.8(C-14)，144.0(C-18)，139.8(C-5)，120.2(C-6)，117.9(C-20)，114.1(C-13)，98.5(C-1′′)，98.4(C-1′′′)，97.8(C-1′)，85.6(C-3)，81.7(C-4′)，81.6(C-4′′)77.8(C-3′)，76.5(C-3′′′)，76.4(C-3′′)，75.3(C-16)，72.9(C-4′′′)，69.9(C-2)，69.6(C-5′)，69.3(C-5′′)，68.0(C-5′′′)，67.5(C-15)，57.9(C-7′)，57.0(C-7′′)，56.7(C-7′′′)，56.5(C-17)，52.2(C-9)，43.6(C-1)，39.8(C-8)，39.2(C-10)，37.6(C-4)，37.6(C-2′′)，37.0(C-2′)，32.2(C-2′′′)，29.8(C-7)，29.7(C-12)24.4(C-21)，23.8(C-11)，18.1(C-6′)，18.0(C-19)，18.0(C-6′′)，18.0(C-6′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物8為glaucogenin-A 3-O-α-L-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-L-cymaropyranoside。

化合物9黃色粉末；ESI-MS：m/z386 [M +Na]+，確定分子質(zhì)量363；分子式C23H25NO3；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.91(1H，s，H-4)，7.90(1H，d，J=3.0 Hz，H-5)，7.83(1H，d，J=15.6 Hz，H-8)，7.31(1H，s，H-1)，7.21(1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，H-7)，4.71(1H，d，J=18.0 Hz，H-25)，4.10(3H，s，2-OCH3)，4.06(3H，s，3-OCH3)，4.01(3H，s，6-OCH3)，3.70(1H，d，J=18.0 Hz，H-9)，3.46(1H，t，J=12.0 Hz，H-11)，3.36(1H，dd，J=2.4，21.0 Hz，H-15)，2.90(1H，m，H-15)，2.49(1H，m，H-14)，2.45(1H，m，H-11)，2.22(1H，m，H-13)，2.02(1H，m，H-12)，1.92(1H，m，H-12)，1.76(1H，m，H-13)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：157.4(C-6)，149.3(C-3)，148.2(C-2)，130.1(C-8′)，127.0(C-5′)，126.6(C-9′)，125.5(C-15′)，124.2(C-8)，124.1(C-4′)，123.4(C-1′)，114.8(C-7)，104.6(C-5)，103.9(C-1)，103.7(C-4)，60.1(C-14)，55.9(OCH3-2)，55.8(OCH3-3)，55.5(OCH3-6)，55.1(C-11)，53.8(C-9)，33.7(C-15)，31.3(C-13)，21.6(C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物9為antofine。

化合物10褐色粉末；ESI-MS：m/z365 [M+Na]+，確定分子質(zhì)量342；分子式C12H22O11；1H NMR(400 MHz，DMSO)δ：5.19(1H，d，J=6.0 Hz，H-1′)，5.17(1H，d，J=4.8 Hz，H -1)，5.06(1H，d，J=12.0 Hz，H -1′)，4.80(1H，dd，J=6.0，12.0 Hz，H-6)，4.76(1H，d，J=12.0 Hz，H-6′)，4.50(1H，d，J=12.0 Hz，H-6′)，4.40(1H，dd，J=2.4，12 Hz，H-6)，3.90(1H，t，J=9.6 Hz，H-3′)，3.80(1H，m，H-4′)，3.64(1H，m，H-5′)，3.56(1H，m，H-5)，3.52(1H，m，H-6′)，3.45(1H，d，J=10.2 Hz，H-2)，3.18(1H，m，H-3)，3.13(1H，m，H-4)；13C NMR(100 MHz，DMSO)δ：104.0(C-2′)，91.7(C-1)，82.6(C-5′)，77.0(C-3′)，74.3(C-4′)，72.9(C-3)，72.8(C-5)，71.6(C-2)，69.8(C-4)，62.1(C-6′)，62.0(C-1′)，60.5(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物10為2-O-β-D-fructofuranosyl-β-D-glucopyranoside。

3.2 化合物抗TMV活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

白薇全株中分離得到的化合物1～9的抗TMV活性結(jié)果見表1，從鈍化活性結(jié)果來看，化合物1、2、3、9高于寧南霉素，化合物5和陽(yáng)性對(duì)照寧南霉素相當(dāng)，化合物4、6、7、8低于寧南霉素，表明化合物1、2、3、9在體外能作用于病毒；從保護(hù)活性來看，除了化合物8與寧南霉素相當(dāng)，其余化合物均低于寧南霉素，表明化合物8能誘導(dǎo)煙草獲得植物系統(tǒng)抗性抵御病毒；從治療活性來看，化合物1～4、9高于寧南霉素，化合物5和寧南霉素相當(dāng)，化合物6～8低于寧南霉素，表明化合物1～4、9能直接作用于病毒，不影響宿主細(xì)胞；從鈍化活性的IC50值結(jié)果來看，化合物1、2、3、9具有較強(qiáng)的抗TMV活性，說明化合物1、2、3、9不是通過誘導(dǎo)植物獲得抗性，是通過直接作用于病毒發(fā)揮抗TMV活性。結(jié)果顯示菲駢吲哚里西定生物堿高于seco-pregnane類甾體苷，glaucogenin C類型的二糖苷抗TMV活性高于三糖苷，glaucogenin C類型的三糖苷抗TMV活性高于glaucogenin A類型的三糖苷。說明glaucogenin A苷元母核上的2位羥基能影響抗TMV活性，同類型的甾體含糖越多，活性越低。

表1 化合物1～9的抗TMV活性結(jié)果Table 1 Antiviral activities of compounds 1-9 against tobacco mosaic virus

注：寧南霉素為陽(yáng)性對(duì)照藥物，a50 μg/mL，b200 μg/mL，c200 μg/mL，d以鈍化活性測(cè)定IC50值。

Note:Ningnanmycin was used as positive control drug,a50 μg/mL,b200 μg/mL,c200 μg/mL,ddetermination of IC50by inactivation effect.

4 結(jié)論

通過應(yīng)用多種色譜方法從蘿藦科植物白薇全株的乙醇提取物中分離得到10個(gè)單體化合物，化合物1～8，10為首次從該植物中分離得到。對(duì)化合物1～9進(jìn)行抗TMV活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)化合物1、2、3、9具有較強(qiáng)的抗TMV活性，其活性高于陽(yáng)性對(duì)照藥物寧南霉素，化合物5的抗TMV活性與寧南霉素相當(dāng)，說明菲駢吲哚里西定生物堿高于seco-pregnane類甾體苷，同類型的二糖苷抗TMV活性高于三糖苷，glaucogenin C類型糖苷活性高于glaucogenin A類型糖苷，且菲駢吲哚里西定生物堿和seco-pregnane類甾體苷的抗TMV活性是通過作用于TMV產(chǎn)生。本研究結(jié)果豐富了白薇的化學(xué)成分及生物活性內(nèi)容，為其進(jìn)一步的研究開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。