天麻-附子祛風通絡(luò)藥對抗類風濕性關(guān)節(jié)炎風寒濕痹癥大鼠的干預(yù)機制

郭步伐，楊 杰*，彭啟倫，范光忠，姚維一，鄧佳麗，龔弟鴻，丁維俊

1畢節(jié)醫(yī)學高等?？茖W校基礎(chǔ)醫(yī)學系，畢節(jié) 551700；2成都中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，成都 610075

天麻為蘭科植物天麻屬的干燥塊莖，主產(chǎn)于四川、云南、貴州等地。天麻味甘、藥性平和，附子辛、甘、大熱、有小毒。由于兩種中藥均味甘，因此兩藥配伍組成祛風通絡(luò)藥對，能相互調(diào)和其藥性，廣泛用于類風濕性關(guān)節(jié)炎的治療[1]。首先，Peng等[2]篩選與天麻配伍具有祛風通絡(luò)功效的400首方劑，從中發(fā)現(xiàn)天麻與川芎、當歸、牛膝和附子等配伍頻次之高，在治療頑固性痹癥中發(fā)揮著重要作用。Lai等[3]采用“中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)”篩選出與天麻進行配伍的106首方劑，認為天麻與附子配伍是祛風通絡(luò)治療痹病的最佳藥物組合。其次，天麻與附子配伍組成祛風通絡(luò)藥對在《太平圣惠方》、《圣濟總錄》和《奇效良方》天麻丸中均有記載，其中明代方賢著所著《奇效良方》天麻丸中天麻與附子配伍的劑量比為1∶1和3∶2。當今，Chen等[4]根據(jù)古方天麻丸研制的天麻浸膏丸用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎，其總有效率為82.8%。因此，我們在古方天麻丸所含天麻-附子劑量配比的基礎(chǔ)上設(shè)計天麻-附子藥對1∶1、3∶2和2∶3劑量比組，觀察天麻-附子藥對三種劑量配比抗RA的療效；在此療效的基礎(chǔ)上，從環(huán)加氧酶COX-2/COX-1角度闡釋天麻-附子祛風通絡(luò)藥對抗膠原誘導(dǎo)的RA風寒濕痹癥大鼠模型[5]的干預(yù)機制。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品

紅天麻GastrodiaelataBl購自貴州畢節(jié)大方天麻公司，附子Radix Aconiti Lateralis Preparata購自四川江油鑫臨附子藥業(yè)有限公司。產(chǎn)地分別為貴州畢節(jié)大方和四川江油。由成都中醫(yī)藥大學鄧赟教授鑒定。

天麻-附子祛風通絡(luò)藥對(1∶1、3∶2、2∶3)凍干粉制備：按比例稱取天麻、附子粗粉，分別加10倍體積水浸泡30 min，先煎附子1 h，再加天麻煎1 h，過濾；第二次在殘渣中加8倍體積水煎煮1 h，過濾，合并兩次濾液，濃縮至相對密度1∶1.1的膏狀物，再制成天麻-附子藥對不同劑量配比的凍干粉，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

牛Ⅱ型膠原(美國Chondrex公司，批號：20022),完全弗氏佐劑(美國Chondrex公司，批號：7023)；大鼠類風濕因子RF(批號：ERC156)，C反應(yīng)蛋白CRP(批號：ERC07)，血栓素B2TXB2(批號：ERC88)，前列腺素E2PGE2(批號：ERC16)，前列環(huán)素PGI2(批號：ERC129)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自依科賽生物科技有限公司。BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix(2X)(碧云天生物技術(shù)公司，批號：D7260)。PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa公司，批號：RR037A)。

1.1.3 動物

SPF級SD雄性大鼠60只，6周齡，購自成都達碩動物有限公司，許可證號SCXK(川)2015-030。飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學實驗中心清潔級動物房，自由飲水和進食。

1.2 儀器

FYL-YS-138L恒溫冷藏柜(北京福意聯(lián)醫(yī)療設(shè)備有限公司)，Multiskan MK3全自動酶標儀(美國Thermo Scientific公司)，CFX96熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，NanoDrop2000超微量分光光度計(美國Thermo公司)。

2 方法

2.1 類風濕性關(guān)節(jié)炎風寒濕痹癥大鼠模型的建立

選用SPF級SD雄性大鼠60只，6周齡，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，任意選取8只大鼠作為正常組，其余大鼠參考文獻按照膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎法(CIA法)[5]造模。取2 g/L牛Ⅱ型膠原置于4 ℃冰箱中過夜，與含有5 g/L卡介苗的完全弗氏佐劑(CFA)等體積混合，充分研磨至乳白色黏稠液體，使之乳化，膠原最終質(zhì)量濃度為1 g/L。于大鼠的尾根部至后背部進行皮下注射膠原乳化劑0.2 mL。14天后按初次致炎的方法和劑量重復(fù)致炎。風寒濕刺激條件:自致炎第1天起，將致炎大鼠置于恒溫冷藏柜中，風速18 m/s，相對濕度95%～100%，每次30 min，每天1次，連續(xù)18天。定期觀察大鼠的一般情況、關(guān)節(jié)腫脹程度、顏色、關(guān)節(jié)活動情況等變化。

2.2 動物分組及給藥

致炎21天，根據(jù)關(guān)節(jié)炎指數(shù)≥4篩選模型建立成功的大鼠，按各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)無統(tǒng)計學差異，均勻地分為模型組、天麻-附子祛風通絡(luò)藥對1∶1(含藥對生藥2.7 g/kg)、2∶3(含藥對生藥3.4 g/kg)、3∶2(含藥對生藥3.4 g/kg)劑量比組，每組8只，灌胃給藥每日一次，連續(xù)21天。正常組和模型組按10 mL/kg灌胃生理鹽水。各給藥組劑量均按體表面積換算的成人臨床等效劑量[5]的1.5倍進行計算，同時以明代《奇效良方》天麻丸所含天麻附子配伍的比例為依據(jù)。

2.3 檢測指標

2.3.1 大鼠體重

致炎前起，每周稱量并記錄大鼠體重。

2.3.2 關(guān)節(jié)炎指數(shù)

致炎第21天起，每周按大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎全身5級評分法[5,6]對病變程度進行評分。0分，正常；1分，足趾關(guān)節(jié)紅腫；2分，多個趾關(guān)節(jié)或趾跖關(guān)節(jié)腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分，全部足爪腫脹。累計四肢關(guān)節(jié)炎積分為每只大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)，最高為16分。

2.3.3 血清細胞因子

致炎42天后，10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉各組大鼠，心臟取血2～3 mL，3 000 rpm離心20 min，分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩LISA法測定血清類風濕因子(RF)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、血栓素B2(TXB2)、前列腺素E2(PGE2)和前列環(huán)素(PGI2)的水平。

2.3.4 RT-qPCR檢測各組大鼠全血COX-1和COX-2 mRNA的表達量

致炎42天后，10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉各組大鼠，心臟取血1～2 mL，置于含有乙二胺四乙酸(EDTA)的離心管中，加3倍體積紅細胞裂解液，輕輕顛倒混勻，3 000 rpm離心10 min，棄上清，用2 mL 磷酸緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，放入1 mL RNA Later之中，-80 ℃保存。

根據(jù)Multisource Total RNA Miniprep Kit(AXYGEN，AxyPrepTM，07418KD1)試劑盒操作說明書提取各組樣本總RNA。按照PrimeScript TM RT Reagent Kit (Takara)說明書進行反轉(zhuǎn)錄操作。采用20 μL反應(yīng)體系(SYBR Green qPCR Mix 10 μL，F(xiàn)orward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，cDNA 2 μL，dH2O 6 μL)，擴增反應(yīng)條件如下：95 ℃ 30 s 熱啟動和預(yù)變性，95 ℃ 5 s 變性，60 ℃ 35 s 退火，72 ℃ 30 s 充分延伸，共40個循環(huán)。引物信息見表1。β-actin為內(nèi)參基因，相對表達水平采用2-△△Ct公式進行計算。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 天麻-附子不同劑量配比對大鼠一般情況及體重的影響

致炎10天，類風濕性關(guān)節(jié)炎風寒濕痹癥大鼠足趾皮膚發(fā)紅，輕度腫脹，致炎14天再次強化免疫，大鼠足背、踝關(guān)節(jié)腫脹明顯，活動量減少，食少，體重增長緩慢，甚至下降；致炎21天，大鼠足背、踝關(guān)節(jié)腫脹進一步加重，體重下降，下肢觸地無力。自致炎第21天開始給藥，各治療組大鼠體重逐漸上升，見表2。致炎第42天(給藥第21天)，各治療組大鼠體重較模型組明顯升高(見表2)。

表2 天麻-附子不同劑量配比對大鼠體重的影響Table 2 Effect of different dose-ratios of GRHP on rats′ weight = 8)

注：與正常組相比，*P<0.05；#P<0.01。與模型組相比，△P<0.01；△△P<0.05。TF11、TF32、TF23組分別為天麻-附子藥對1∶1、3∶2、2∶3劑量比組。

Note:Compared with normal,*P<0.05;#P<0.01.Compared with model,△P<0.01;△△P<0.05.TF11,TF32 and TF23 group were GRHP 1∶1,3∶2 and 2∶3 dose-ratio groups,respectively.

3.2 天麻-附子不同劑量配比對大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響

致炎28天，模型組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)達到高峰。各治療組隨著治療時間的延長，關(guān)節(jié)炎指數(shù)逐漸下降。致炎42天(給藥第21天)，各治療組與模型組相比，其關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯下降(見表3)。

表3 天麻-附子不同劑量比對大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響Table 3 Effect of different dose-ratios of GRHP on rats′ AI = 8)

注：與模型組相比，*P<0.05；#P<0.01。

Note:Compared with model,*P<0.05;#P<0.01.

3.3 天麻-附子不同劑量配比對血清RF、CRP水平的影響

表4所示，模型組血清RF、CRP水平明顯高于正常組，可成為類風濕性關(guān)節(jié)炎風寒濕痹癥大鼠模型的判定標準之一。與模型組相比，天麻-附子1∶1、2∶3、3∶2劑量比組能明顯降低類風濕性關(guān)節(jié)炎風寒濕痹癥大鼠血清RF和CRP的水平(P<0.05，P<0.01)，因而各劑量比組可改善大鼠足趾及踝關(guān)節(jié)腫脹癥狀。

表4 天麻-附子不同劑量比對大鼠血清RF和CRP水平的影響Table 4 Effect of different dose-ratios of GRHP on RF and CRP levels in rats′ blood = 8)

注：與正常組相比，*P<0.01。與模型組相比，#P<0.05；△P<0.01。

Note:Compared with normal,*P<0.01.Compared with model,#P<0.05;△P<0.01.

3.4 天麻-附子不同劑量配比對血清TXB2、PGE2、PGI2水平的影響

表5所示，致炎42天，與正常組相比，模型組血清PGE2和PGI2水平明顯升高，為類風濕性關(guān)節(jié)炎風寒濕痹癥大鼠主要的致炎因子之一。與模型組相比，各劑量配比組血清PGE2和PGI2水平下降，其中天麻-附子藥對1∶1劑量組和2∶3劑量組下降最為明顯，P<0.01。

表5 天麻-附子不同劑量比對大鼠血清TXB2、PGE2、PGI2水平的影響Table 5 Effect of different dose-ratios of GRHP on TXB2,PGE2 andPGI2 levels in rats′ blood serum = 8)

注：與正常組相比，*P<0.01；#P<0.05。與模型組相比，△P<0.01；△△P<0.05。

Note:Compared with normal,*P<0.01;#P<0.05.Compared with model,△P<0.01;△△P<0.05.

3.5 天麻-附子不同劑量配比對COX-1和COX-2 mRNA表達的影響

致炎42天，與正常組相比，模型組COX-1 mRNA表達低于正常組，COX-2 mRNA表達高于正常組，P<0.05。與模型組相比，各劑量組能明顯降低COX-2 mRNA的表達。各劑量組之間COX-1 mRNA、COX-2 mRNA表達無統(tǒng)計學差異(見表6)。

表6 天麻-附子不同劑量比對大鼠全血COX mRNA表達的影響Table 6 Effect of different dose-ratios of GRHP on rats′ whole blood COX mRNA = 8)

注：與正常組相比，*P<0.05。與模型組相比，#P<0.05；△P<0.01。

Note:Compared with normal,*P<0.05.Compared with model,#P<0.05;△P<0.01.

4 討論

類風濕性關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病?；ぱ壮志梅磸?fù)發(fā)作，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨和骨的破壞，關(guān)節(jié)功能障礙，甚至殘廢，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[7,8]。目前，CIA和AIA法是常見的復(fù)制類風濕性關(guān)節(jié)炎動物模型的方法之一，CIA法大鼠模型關(guān)節(jié)炎癥狀與人類類風濕性關(guān)節(jié)炎相類似[9]。經(jīng)大鼠尾根部至后背部皮下注射膠原乳劑14天之后，大鼠足趾及踝關(guān)節(jié)紅腫癥狀逐漸加重，飲食減少乃至體重增幅減少。致炎21天，以關(guān)節(jié)炎指數(shù)≥4為模型判定標準，顯示52只SD大鼠成模率為61.54%。血清RF、CRP水平是類風濕性關(guān)節(jié)炎的診斷標準之一[8]，我們采用ELISA法檢測類風濕性關(guān)節(jié)炎大鼠血清RF和CRP的水平。結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠血清RF、CRP血清濃度明顯升高，進一步證實RA模型復(fù)制成功。

藥對是臨床上常用的兩味藥物的配伍形式。根據(jù)中藥藥性理論，天麻味甘、藥性平和，附子辛、甘、大熱、有小毒，兩味藥配伍組成祛風通絡(luò)藥對用于類風濕性關(guān)節(jié)炎的治療。在與天麻配伍具有祛風通絡(luò)功效的400首方劑中，其中天麻與附子配伍的頻次較高[2]?！洞笃绞セ莘健贰ⅰ镀嫘Я挤健泛汀妒備洝分杏涊d的天麻丸所用的天麻-附子劑量配比為1∶1和3∶2。因此，本課題組在古方天麻丸所用天麻-附子劑量配比的基礎(chǔ)上，觀察天麻-附子劑量配比1∶1、3∶2和2∶3抗RA的療效。

首先，給藥21天(致炎42天)之后，天麻-附子藥對各劑量比可降低RA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)及血清RF、CRP的水平，同時增加其各劑量組大鼠的體重，提示了天麻-附子祛風通絡(luò)藥對各劑量配比組具有較好的抗炎抗風濕作用(見表2、表3和表4)。從RA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)、血清炎癥因子水平到COX mRNA表達程度，天麻附子1∶1和3∶2劑量比組對各檢測指標的影響與模型組相比，統(tǒng)計學差異不一致；然而，天麻附子藥對2∶3劑量比組對各檢測指標的影響，與模型組相比，P值均小于0.01,可認為是天麻附子藥對抗RA的最佳劑量比，在于此劑量比附子用量稍高于天麻，并與附子溫通經(jīng)絡(luò)治療痹癥的中醫(yī)理論有一定的關(guān)系[10,11]。

其次，COX是影響花生四烯酸代謝的限速酶，包括COX-1和COX-2兩種類型，COX-1 mRNA表達于胃粘膜、腎血管等正常組織中，具有生理性保護作用，COX-2 mRNA在炎癥刺激下強烈表達，并促進前列腺素等炎癥因子的釋放[12,13]。大多數(shù)研究均表明[14,15]，COX表達于類風濕性關(guān)節(jié)炎滑膜組織中，COX-1 mRNA表達衍生的TXA2具有促凝作用，COX-2 mRNA表達衍生的PGI2具有抗凝作用，因此，TXA2與PGI2在生理功能上呈現(xiàn)相互拮抗。TXA2半衰期較短，難以檢測，故通過檢測TXB2的濃度進行間接地評價[16]。表5所示，各組大鼠血清中PGI2的濃度明顯高于TXB2的濃度，與COX mRNA表達程度相關(guān)(見表6)。由于天麻-附子藥對各劑量比組均能明顯降低RA大鼠COX-2 mRNA的表達，對COX-1 mRNA表達影響較小(見表6)，且各劑量組能明顯降低RA大鼠血清PGE2和PGI2的含量(見表5)，因此天麻-附子藥對通過下調(diào)COX-2 mRNA表達而成為其具有抗炎抗風濕作用的原因之一。

至今，從單味藥到復(fù)方，從單一成分到多組分，從單一靶點到多靶點網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)，天麻藥對研究層次逐漸深入。由天麻與川芎組成的兩味方含有20種活性成分，與48個偏頭痛相關(guān)靶點結(jié)合，產(chǎn)生了潛在的協(xié)同治療效應(yīng)[17,18]。天麻鉤藤飲是治療腦缺血及相關(guān)疾病的常用方劑，其主要的藥物是天麻和鉤藤，其神經(jīng)保護效應(yīng)的分子機制在于能上調(diào)Nrf-2、Bcl-2及抗氧化反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因的表達，明顯縮短大腦中央動脈阻塞的范圍[19]。我們首次從COX-2/COX-1角度闡釋古方天麻丸中天麻-附子祛風通絡(luò)藥對劑量配比抗RA的作用機制，其天麻-附子藥對多成分、多靶點和多途徑的網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)機制有待于進一步深入研究。