基于不同乳糖濃度的乳蛋白濃縮物發(fā)酵特性研究

羅天淇， 楊智杰， 張 敏， 王世杰， 朱 宏， 楊貞耐,*

(1.北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心/北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心， 北京 100048； 2.石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司， 河北 石家莊 050221)

乳蛋白濃縮物(milk protein concentrate，MPC)是一種采用膜分離技術(shù)生產(chǎn)的乳蛋白產(chǎn)品，其中酪蛋白和乳清蛋白的比例與原料乳相同[1]，具有優(yōu)異的溶解性、乳化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性以及高蛋白、低乳糖的特點(diǎn)。

在發(fā)酵乳方面，MPC通過替代或額外添加的方式應(yīng)用于牛乳中，可以降低體系乳糖含量，強(qiáng)化蛋白組成，促進(jìn)發(fā)酵乳在生產(chǎn)過程中凝膠結(jié)構(gòu)的形成，改善最終產(chǎn)品的品質(zhì)。Rehman等[2]發(fā)現(xiàn)，使用MPC替代非脂肪干乳制備減脂切達(dá)干酪，干酪產(chǎn)量增加一倍，同時(shí)由于降低了干酪中乳糖殘留量，能有效防止成熟過程中不良發(fā)酵的發(fā)生，減少肉湯味、苦味等異味的形成；添加MPC能夠有效增強(qiáng)干酪的硬度和可切割性，但會(huì)降低干酪的融化性[3]；傳統(tǒng)的酸奶質(zhì)地較差且有乳清分離，在酸奶制作中添加MPC，可以作為穩(wěn)定劑提高酸奶的質(zhì)地[4]?？抵具h(yuǎn)等[5]發(fā)現(xiàn)，適量添加MPC- 70替代牛奶可以明顯改善酸奶的感官品質(zhì)、穩(wěn)定性以及質(zhì)構(gòu)特性；孫顏君[6]的研究顯示，使用MPC強(qiáng)化酸奶可以提高黏度和持水性，并在感官上提高酸奶風(fēng)味；此外，還可以利用MPC標(biāo)準(zhǔn)化原料乳降低乳糖含量來生產(chǎn)低乳糖酸奶[7]。

雖然MPC已經(jīng)被廣泛用于發(fā)酵乳生產(chǎn)中，但目前的研究重點(diǎn)都集中在MPC對發(fā)酵乳品質(zhì)的改變上，而關(guān)于MPC自身發(fā)酵特性的相關(guān)研究少見報(bào)道。本研究使用MPC-70作為原料，在不同乳糖濃度下進(jìn)行發(fā)酵，研究其發(fā)酵曲線、微流變、質(zhì)構(gòu)以及風(fēng)味特性，以期為MPC在不同發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MPC- 70(蛋白質(zhì)70%、脂肪1.4%、乳糖16.2%)，寧夏塞尚乳業(yè)；乳糖，上海麥克林生化科技有限公司；發(fā)酵劑YO- MIX 300 LYO (保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌)，丹麥Danisco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS- 3781L- PC型高壓蒸汽滅菌鍋，日本Sanyo公司； DHP- 9032型恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒儀器科技有限公司； iCinac型乳品發(fā)酵監(jiān)控儀，法國AMS Alliance公司；Rheolaser Master型光學(xué)微流變儀，法國Formulaction公司；7890A- 7000型氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用(GC- MS)儀，美國Agilent公司； CR 21GⅢ型高速冷凍離心機(jī)，日本Hitachi公司；Brookfield CT3型質(zhì)構(gòu)儀，美國Brookfield公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1基于不同乳糖濃度的MPC發(fā)酵樣品制備

利用無離子水配制含45.0 g/L MPC- 70的混合液，其中乳糖質(zhì)量濃度為7.3 g/L。進(jìn)一步添加乳糖，至混合液中乳糖質(zhì)量濃度為10.0、15.0、20.0、30.0、50.0 g/L。65 ℃下殺菌30 min，冷卻至室溫，加入商業(yè)發(fā)酵劑YO- MIX 300 LYO，42 ℃發(fā)酵5 h后冷卻，置于4 ℃后熟24 h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.3.2發(fā)酵過程中的pH值測定

采用乳品發(fā)酵監(jiān)控儀對發(fā)酵過程中pH值的變化進(jìn)行監(jiān)測，每1 min記錄一次，持續(xù)10 h。

1.3.3發(fā)酵過程中微流變學(xué)參數(shù)測定

取接菌后的MPC溶液20 mL至微流變儀專用樣品池中，將樣品池插入微流變儀，運(yùn)行測試程序。在42 ℃下監(jiān)測發(fā)酵凝膠過程中的宏觀黏性因子、彈性因子、固液平衡值以及流動(dòng)性指數(shù)隨時(shí)間的變化情況。每隔3 min采集一次數(shù)據(jù)，測定5 h。

1.3.4發(fā)酵樣品的持水力測定

各組均稱取10 g左右發(fā)酵乳樣品，分別放于標(biāo)號(hào)的離心管中并稱量記錄質(zhì)量，4 000 r/min離心20 min，去上清液，稱量并作記錄，計(jì)算方法見式(1)。

(1)

式(1)中：M0為空離心管質(zhì)量，g；M1為樣品質(zhì)量，g；M2為樣品離心除去上清液后的離心管與剩下樣品總質(zhì)量，g。

1.3.5發(fā)酵樣品的質(zhì)構(gòu)分析

使用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析(texture profile analysis, TPA)，選用圓柱形TA10探頭，目標(biāo)值10.0 mm，測試速度0.5 mm/s。測定參數(shù)：硬度、黏力、彈性、膠著性。

1.3.6發(fā)酵樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

SPME法提取揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)：萃取前將SPME纖維置于GC-MS進(jìn)樣口老化。取10 g發(fā)酵樣品和1 μL內(nèi)標(biāo)物 2-甲基-3-庚酮于30 mL萃取瓶中，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度為0.816 μg/μL，加蓋密封，在40 ℃恒溫水浴下平衡30 min后，將SPME萃取纖維通過瓶蓋插入樣品中的頂空部分，推出纖維，頂空吸附30 min后拔出；快速插入GC-MS進(jìn)樣口解吸5 min，進(jìn)行GC- MS分析。

GC條件：采用DB-wax(30 m×0.25 mm，0.25 μm)色譜柱進(jìn)行分析。升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持3 min，以5 ℃·min-1升溫到200 ℃，以10 ℃·min-1升至230 ℃，保持3 min，載氣為氦氣，流速1.2 mL·min-1，不分流進(jìn)樣。

MS條件：電子電離源，電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z40～250 u。

定性分析：化合物通過NIST 14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù) RI值來鑒定。

定量分析：使用2-甲基-3庚酮為內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，求得各揮發(fā)性成分的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品至少測定3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，P<0.05表示差異顯著；使用Sigma Plot軟件繪圖；風(fēng)味物質(zhì)用NIST14譜庫檢索，并應(yīng)用CANOCO 4.5統(tǒng)計(jì)分析軟件對風(fēng)味數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于不同乳糖濃度的MPC發(fā)酵過程中pH值的變化

圖1 發(fā)酵過程中的pH值變化Fig.1 pH changes of MPC during fermentation

使用乳品發(fā)酵監(jiān)控儀對發(fā)酵過程中pH值的變化進(jìn)行監(jiān)測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。由圖1可知，6組實(shí)驗(yàn)樣品的發(fā)酵pH曲線變化趨勢相同，先下降后趨于平穩(wěn)，但終止pH值不同。發(fā)酵前1 h，由于發(fā)酵劑中的乳酸菌進(jìn)入新環(huán)境后有一定的延遲期[8]，各組pH 值下降比較緩慢。經(jīng)過短暫的延遲期后，各組pH值快速下降至4.80左右，不同乳糖含量對發(fā)酵劑的產(chǎn)酸速率無明顯影響。發(fā)酵5 h時(shí)，各組樣品pH值陸續(xù)降至4.60，但不同乳糖含量的MPC發(fā)酵物的產(chǎn)酸速率開始出現(xiàn)差異；發(fā)酵10 h時(shí)，各組pH值依次為4.59、4.42、4.25、4.19、4.14、4.21。 乳酸菌利用乳糖的過程分為兩個(gè)階段，首先分泌乳糖酶將乳糖分解成葡萄糖和半乳糖，然后利用葡萄糖進(jìn)行糖酵解產(chǎn)酸[9]，因此MPC發(fā)酵物的乳糖含量對乳酸菌發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間與pH值有直接影響。乳糖質(zhì)量濃度為7.3、10.0 g/L的兩組樣品pH值穩(wěn)定在較高值，說明在發(fā)酵后期，由于這些樣品中的乳糖含量過低，不足以讓乳酸菌利用大量產(chǎn)酸[10]，因此使用MPC標(biāo)準(zhǔn)化原料乳降低乳糖濃度可以制備弱后酸化的低乳糖酸奶。

2.2 發(fā)酵過程中微流變學(xué)參數(shù)的變化

發(fā)酵是酸奶生產(chǎn)的重要階段，在此過程中，隨著pH值的降低，乳液中的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，最終形成以酪蛋白膠粒為基礎(chǔ)的凝膠結(jié)構(gòu)，引起酸奶流變特性的顯著變化[11-12]。微流變儀通過監(jiān)測樣品中粒子的運(yùn)動(dòng)，可以在不破壞樣品的前提下研究樣品流變特性[13]，基于不同乳糖濃度的發(fā)酵過程中流變學(xué)特性隨時(shí)間的變化如圖2至圖5。圖2至圖5中，所有樣品的彈性因子(EI)、宏觀黏性因子(MVI)、固液平衡值和流動(dòng)性指數(shù)變化趨勢相同，但在發(fā)酵后期不同樣品的流變學(xué)特性具體值存在一定差異。

彈性因子、宏觀黏性因子作為時(shí)間的函數(shù)可以直接反映樣品的彈性、黏性，彈性因子、宏觀黏性因子越大，樣品的黏彈性越強(qiáng)[14]。從圖2、圖3的黏度、彈性變化可以看出，各組樣品發(fā)酵過程中的黏彈性變化可以分為3個(gè)階段。在發(fā)酵前期，結(jié)合圖1可知，發(fā)酵0～160 min，樣品pH值由起始值降至5.30左右的過程中，樣品處于低黏度、低彈性的液體狀態(tài)，且無明顯變化；而發(fā)酵160～200 min時(shí)，樣品pH值由5.30 降至 5.00，乳蛋白開始凝膠化，黏度、彈性快速增加。Rohart等[15]研究葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯誘導(dǎo)的牛乳凝膠化發(fā)現(xiàn)，牛乳pH值在5.20～5.40時(shí)，其黏彈性出現(xiàn)類似變化趨勢。Ercili-Cura等[16]認(rèn)為這與酪蛋白膠束在pH值為5.00～5.50時(shí)引起的蛋白質(zhì)聚集有關(guān)，當(dāng)接近酪蛋白的等電點(diǎn)時(shí)，它們的溶解度降低，導(dǎo)致在pH值約5.00～5.20時(shí)的締合和隨后的聚集，從而引起牛乳性質(zhì)的變化。之后，樣品初步形成較為穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)，黏性、彈性增長速度減緩，進(jìn)入高黏彈性階段，可能與形成的凝膠結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定有關(guān)[17]。隨著乳糖添加量的增加，各組樣品宏觀黏性因子降低，并且乳糖含量較低時(shí)變化明顯(P<0.05)，而彈性因子在部分樣品間存在顯著性差異(P>0.05)，但整體上變化趨勢不明顯。

圖2 發(fā)酵過程中的宏觀黏性因子變化Fig.2 Macroscopic viscosity index of MPC during fermentation

圖3 發(fā)酵過程中的彈性因子變化Fig.3 Elastic index of MPC during fermentation

固液平衡值(SLB)直接與樣品黏彈性成正比，可以給出樣品固液性質(zhì)隨時(shí)間的變化過程。當(dāng)SLB=0時(shí)，樣品為純彈性/固體性質(zhì)；0

圖5 發(fā)酵過程中的流動(dòng)性變化Fig.5 Fluidity index of MPC during fermentation

2.3 MPC發(fā)酵物的持水力及質(zhì)構(gòu)特性分析

表1是不同乳糖含量的MPC發(fā)酵物的持水力和質(zhì)構(gòu)特性分析結(jié)果。持水力是發(fā)酵乳品質(zhì)高低的重要參數(shù)指標(biāo)之一，它對延長發(fā)酵乳產(chǎn)品的貨架期起著關(guān)鍵性作用。由表可知，隨著乳糖添加量的增加，MPC發(fā)酵物的持水力逐漸升高，與Meletharayil等[20]關(guān)于乳糖添加量對MPC酸凝膠影響的研究結(jié)果相同。

TPA質(zhì)構(gòu)分析是2次咀嚼實(shí)驗(yàn)，可以模擬人類咀嚼食品，廣泛用于固體、半固體食品的質(zhì)構(gòu)分析中[21]。表1所示質(zhì)構(gòu)特性中，彈性可用第一次壓縮后樣品回彈的高度表示，膠著性反映了使半固態(tài)樣品破裂成吞咽時(shí)的分散狀態(tài)所需的能量。MPC發(fā)酵物的膠著性、彈性隨乳糖含量的升高，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，可能與凝膠過程中乳糖和酪蛋白分子之間相互作用有關(guān)[22]，而MPC發(fā)酵物的硬度、黏力隨著乳糖濃度的增加無明顯變化(P>0.05)。

表1 MPC發(fā)酵物的持水力與質(zhì)構(gòu)特性

同列小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 MPC發(fā)酵物的風(fēng)味物質(zhì)分析

2.4.1SPME-GC-MS 檢測結(jié)果

風(fēng)味是評估發(fā)酵乳品質(zhì)的主要指標(biāo)之一[23]。采用SPME-GC-MS技術(shù)從6組MPC發(fā)酵物樣品中一共檢測出29種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。表2中包括烴類7種，醇類1種，醛類3種，酮類12種，酯類1種，酸類5種。

表2 MPC發(fā)酵物揮發(fā)性組分的定性定量分析

續(xù)表2 ng/g

定性方法中， MS 為質(zhì)譜定性，RI為保留指數(shù)定性；“-”表示未檢出；各物質(zhì)的含量保留兩位有效數(shù)字。

在發(fā)酵乳制品中，烴類物質(zhì)大多來源于原料乳自身，這些物質(zhì)閾值較高，對樣品整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)較小。在7種檢出的烴類物質(zhì)中，甲苯具有水果甜味[24]，王丹等[25]指出，甲苯是嗜熱鏈球菌單菌發(fā)酵牛乳的關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)之一，而苯乙烯被認(rèn)為具有香醋味、橘香味[26]。

醛類是一類風(fēng)味閾值偏低的風(fēng)味物質(zhì)，但由于醛類化合物化學(xué)性質(zhì)比較活潑，在一定條件下易被還原成相應(yīng)的醇，因此這類化合物在發(fā)酵乳制品中的含量通常都不高。GC-MS檢測出樣品中的3種醛類化合物中，壬醛具有青草味和霉腐味，其含量超過某個(gè)閾值時(shí)會(huì)產(chǎn)生令人不愉快的氣味[27]；癸醛具有脂肪香氣；苯甲醛具有杏仁、焦糖氣味，可能與乳粉制作和牛乳殺菌時(shí)的美拉德反應(yīng)有關(guān)。

酮類化合物在各組樣品風(fēng)味物質(zhì)中含量較高，分別為揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總含量的41.06%、42.09%、46.01%、45.92%、48.80%、54.25%，一般認(rèn)為酮類物質(zhì)具有清香氣味、奶油味和果香味[28]。在GC-MS檢測出的15種酮類化合物中，2,3-丁二酮(雙乙酰)、3-羥基-2-丁酮(乙偶姻)被認(rèn)為是影響發(fā)酵乳風(fēng)味的關(guān)鍵因素[29]，并且隨著乳糖含量的增加，在MPC發(fā)酵乳中的含量增加，驗(yàn)證了發(fā)酵乳中雙乙酰、乙偶姻主要是由乳酸菌代謝乳糖而產(chǎn)生[30]。在其他酮類物質(zhì)中，6-甲基-5-庚烯-2-酮具有蘑菇氣味，2-壬酮、2-十一酮具有脂肪香，2-十三酮具有水果香、清香。

酸類化合物在各組樣品中的含量較高，為25%～40%，但通常認(rèn)為酸類物質(zhì)在發(fā)酵乳制品中主要表現(xiàn)在滋味上，且閾值較高，對整體風(fēng)味貢獻(xiàn)小。乙酸具有醋酸味，丁酸具有奶油味，己酸具有強(qiáng)烈的腐臭奶酪香氣，辛酸略有不舒適的氣味，癸酸具有脂肪味。在酸類化合物含量上，隨著乳糖含量的增加，MPC發(fā)酵物中的酸類揮發(fā)性化合物含量降低，可能是因?yàn)槿樘怯绊懥孙L(fēng)味物質(zhì)與乳基質(zhì)之間的相互作用。

2.4.2風(fēng)味物質(zhì)主成分分析

為了明確乳糖濃度對MPC發(fā)酵物風(fēng)味的影響，利用主成分分析法考察了揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與樣品間的分布關(guān)系，研究結(jié)果如圖6。

圖6 MPC發(fā)酵物風(fēng)味的主成分分析結(jié)果Fig.6 Principal component analysis of flavor in MPC fermentation product

圖6中，F(xiàn)1和F2的貢獻(xiàn)率分別為50.9%、27.3%，可以很好地解釋乳糖濃度對樣品風(fēng)味的影響。從圖6可以看出，各組樣品在主成分分析圖中的分布比較分散，說明乳糖濃度對MPC發(fā)酵物風(fēng)味物質(zhì)的組成有較大影響。隨著乳糖濃度的增加，不同風(fēng)味物質(zhì)對MPC發(fā)酵物的貢獻(xiàn)也隨之變化。不添加乳糖時(shí)，乙酸(24)對整體風(fēng)味有較大貢獻(xiàn)；而乳糖濃度達(dá)到30.0 g/L和50.0 g/L時(shí)，對整體風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)的風(fēng)味物質(zhì)變成了2,3-丁二酮(12)、2,3-戊二酮(13)、2-庚酮(14)以及3-羥基-2-丁酮(16)等物質(zhì)。在發(fā)酵乳中，乙酸主要來源于脂肪酸降解以及乳糖代謝[23]；2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮、2,3-戊二酮均為乳酸菌代謝乳糖的產(chǎn)物[30]；2-庚酮與飽和脂肪酸的降解有關(guān)[31]，是發(fā)酵乳制品特征風(fēng)味的重要組成物質(zhì)。因此，乳糖濃度主要是通過影響乳糖代謝產(chǎn)物的形成改變MPC發(fā)酵物風(fēng)味物質(zhì)的組成，隨著乳糖濃度的增加，乳糖代謝產(chǎn)物對整體風(fēng)味的影響也隨之增加。

3 結(jié) 論

本研究利用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌復(fù)合發(fā)酵劑，探討了不同乳糖濃度條件下乳蛋白濃縮物的發(fā)酵特性。隨著乳糖質(zhì)量濃度的升高(7.3～50.0 g/L)，MPC發(fā)酵物的發(fā)酵終點(diǎn)pH值呈下降趨勢(pH值范圍4.14～4.59)；同時(shí)，MPC發(fā)酵物的宏觀黏性因子減小，固液平衡值、流動(dòng)性指數(shù)增大，持水力逐漸升高，膠著性和彈性呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，而硬度和黏力不受影響。MPC發(fā)酵物中的揮發(fā)性化合物主要是酮類和酸類物質(zhì)，其中酸類化合物含量隨乳糖添加量的增加而減少，而2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮等乳糖代謝物的含量則隨之增加。本研究旨在為進(jìn)一步了解MPC的發(fā)酵特性及其在發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。