GC-O-MS分析熱處理前后西瓜汁揮發(fā)性風(fēng)味成分

楊 帆， 陳爾豹， 牛曉媛， 律 詩， 劉 野， 張 雨， 鄒婷婷

(北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院， 北京 100048)

西瓜汁因其清爽的口感、誘人的顏色和潛在的健康益處變得越來越受歡迎[1]。西瓜汁的水分活度很高，病原微生物可能會由于其酸度較低而快速生長。熱處理通常用于滅活果汁中的微生物和酶，以延長貨架期[2]。西瓜作為一種熱敏性的水果，熱處理不可避免會破壞其香氣，形成“蒸煮味”，影響消費者的接受度[3-4]。

迄今為止，西瓜汁中已經(jīng)報道的氣味化合物有數(shù)百種，以烯烴醛、飽和醛、醇、酮和酯為主[5-6]，其中不飽和C9醇和醛是西瓜汁氣味活性化合物的重要成分[7]。何聰聰?shù)萚8]采用固相微萃取法(solid-phase microextraction, SPME)和溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)法(solvent-assisted flavor evaporation，SAFE)進(jìn)行西瓜汁風(fēng)味萃取，并確定西瓜汁中的關(guān)鍵氣味成分，包括反-2-壬烯醛、反,順-2,6-壬二烯醛、反,順-2,6-壬二烯醇、順-6-壬烯醛等。Liu等[9]通過兩種方法萃取不同種類的西瓜汁揮發(fā)性化合物，發(fā)現(xiàn)SPME對醛類、醇類和酮類有較好的提取效率，而SAFE對西瓜汁中含硫化合物的提取效率更高。因此，在西瓜汁的風(fēng)味研究中，采用SPME和SAFE相結(jié)合的方法能有效提取氣味化合物。對于熱處理西瓜汁導(dǎo)致的“熱異味”問題，楊瀟等[10]通過氣相色譜- 嗅聞- 質(zhì)譜法(gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS)初步鑒定出了西瓜汁中反-2-庚烯醛、反-2-辛烯醛、二丙基二硫醚等6種關(guān)鍵異味成分。

目前有關(guān)西瓜汁風(fēng)味的研究多集中在鮮榨西瓜汁，缺少對熱處理后西瓜汁風(fēng)味的關(guān)注，而對西瓜汁加熱前后氣味化合物變化的研究較少。本研究以鮮榨及加熱西瓜汁為實驗對象，通過GC-O-MS對樣品進(jìn)行揮發(fā)性氣味化合物分析，對比西瓜汁熱處理前后的氣味化合物的變化，以期為西瓜汁熱加工研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麒麟西瓜，北京永輝超市；正己烷，色譜純，美國Fisher公司；無水硫酸鈉，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；正構(gòu)系列烷烴(C7～C30)、2-甲基-3-庚酮、關(guān)鍵氣味化合物標(biāo)準(zhǔn)品，均為色譜純，美國Sigma公司；無水乙醚、正戊烷，均為分析純，北京化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A- 7000B型氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有EI離子源和NIST 08數(shù)據(jù)庫)，美國Agilent公司；Sniffer 9000型嗅聞儀，瑞士 Brechbuhler公司；DB- WAX型毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，美國J&W公司； SPME萃取頭(50/30 μm DVB-CAR-PDMS)，美國Supelco公司；Vigreux柱(50 cm×1 cm)，北京博美玻璃儀器有限公司；氮吹儀，天津恒奧科技發(fā)展有限公司；溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)裝置，德國Glasbl?serei Bahr公司。

1.3 實驗方法

1.3.1西瓜汁樣品制備

為減小西瓜個體差異，一次性購買所有待檢測樣品且保證西瓜新鮮、飽滿。西瓜清洗后取瓤、破碎，經(jīng)紗布多次過濾至無泡沫后，迅速移至保鮮袋中密封。袋裝樣品置于液氮中迅速冷凍后于-80 ℃冰箱貯藏備用。

鮮榨組西瓜汁：袋裝樣品在4 ℃條件下正常解凍后立即分析。

熱處理西瓜汁：袋裝樣品在4 ℃條件下正常解凍后，模擬巴氏殺菌，在70 ℃條件下水浴加熱30 min。

1.3.2氣味化合物的提取

1.3.2.1 固相微萃取法

參考何聰聰?shù)萚8]對西瓜汁的萃取方法，量取10 mL西瓜汁樣品于40 mL頂空瓶中，加入1 μL 2-甲基-3-庚酮(0.816 μg/μL)作為內(nèi)標(biāo)物密封。將裝有樣品的頂空瓶在40 ℃下平衡20 min，使用SPME萃取頭在相同溫度下吸附40 min。待萃取完全后，將萃取頭插入GC進(jìn)樣口，在250 ℃下解析5 min。鮮榨組和熱處理西瓜汁樣品均重復(fù)實驗3次。

1.3.2.2 溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)法

在Engel等[11]方法上稍作修改。量取100 mL西瓜汁樣品于250 mL離心瓶中，加入體積比為2∶1的乙醚和正戊烷150 mL作為溶劑，同時加入50 μL 2-甲基-3-庚酮溶液(0.816 g/mL)作為內(nèi)標(biāo)參照。將此樣品瓶放入4 ℃搖床，在180 r/min的條件下萃取氣味化合物8 h，經(jīng)過濾得到溶有氣味物質(zhì)的有機相萃取液備用。將容積為500 mL和250 mL的圓底燒瓶接于裝置兩側(cè)，分別作為蒸餾裝置和樣品冷阱接收裝置，蒸餾裝置溫度設(shè)定為恒溫40 ℃，冷阱接收裝置溫度設(shè)定為-196 ℃，通過液氮維持。SAFE裝置需要維持真空狀態(tài)，復(fù)合分子渦輪泵將系統(tǒng)壓力維持在低于10-4Pa，循環(huán)水浴裝置可以使整個系統(tǒng)溫度維持在50 ℃。待SAFE系統(tǒng)真空度及溫度穩(wěn)定后，將有機相萃取液通過SAFE裝置均勻緩慢的滴入蒸餾瓶中。冷阱接收裝置收集到的有機相經(jīng)過解凍和除水(無水硫酸鈉)后通過Vigreux柱濃縮至10 mL，最后將萃取液氮吹濃縮至200 μL。進(jìn)樣時吸取1 μL萃取液打入 GC 進(jìn)樣口進(jìn)行解吸分離，鮮榨組和熱處理西瓜汁樣品均重復(fù)實驗3次。

1.3.3GC-O-MS分析條件設(shè)定

色譜條件：升溫程序為起始溫度45 ℃，保持3 min后，以6 ℃/min升溫至210 ℃，再以8 ℃/min升至230 ℃維持3 min。載氣為氦氣，其恒定流速設(shè)為1.2 mL/min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃。分流比設(shè)為不分流。

質(zhì)譜條件：離子源為EI離子源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，傳輸線溫度為280 ℃，四極桿溫度為150 ℃，溶劑延遲5 min，質(zhì)量掃描范圍m/z為50～350。

嗅聞儀條件：氣味輸出通過無涂層填充的色譜柱，色譜柱溫度設(shè)定為200 ℃，3名經(jīng)驗豐富的感官小組成員對GC-O輸出的氣味化合物進(jìn)行嗅聞，依次記錄氣味出現(xiàn)的時間、氣味特征和氣味強度。

1.3.4氣味化合物定性分析

定性方法[12]：采用質(zhì)譜定性、保留指數(shù)(RI)對比和嗅聞(O)對比相結(jié)合的方式對氣味化合物進(jìn)行定性分析。根據(jù)目標(biāo)物的出峰時間及相同氣質(zhì)條件下系列烷烴的出峰時間計算實際RI值，見式(1)：

(1)

式(1)中：n表示系列烷烴的碳原子個數(shù)；Tn為正構(gòu)烷烴Cn的保留時間；Ta為樣品中化合物a的保留時間(化合物a的保留時間在Cn與Cn+1之間)。

嗅聞方式即通過GC-O-MS，利用感官評價員的鼻子作為檢測器感知從色譜柱上分離出的氣味化合物的氣味并做記錄，最后根據(jù)已有的文獻(xiàn)進(jìn)行RI值和氣味特征的比對。

1.3.5氣味化合物稀釋分析

香氣提取稀釋分析法(AEDA)[12]：對SAFE提取的濃縮液以提取時所用的溶劑(乙醚和正戊烷體積比2∶1的混合液)進(jìn)行1∶3n的逐級稀釋，并將稀釋后的溶液進(jìn)行GC-O-MS分析，直到感官評價員嗅聞不到氣味為止，該稀釋倍數(shù)為氣味稀釋(FD)因子。

動態(tài)頂空稀釋分析法(DHDA)：對SPME進(jìn)樣，參考Kim等[13]和Ferreira等[14]的方法，通過改變GC進(jìn)樣口分流比，按照3n∶1逐級稀釋分析，其FD因子分別對應(yīng)1、3、9、27、81等[15]。

1.3.6關(guān)鍵氣味化合物定量分析

采用內(nèi)標(biāo)半定量和外標(biāo)定量兩種定量方式。

內(nèi)標(biāo)半定量方法是在GC-MS模式為全掃描的條件下操作的，以質(zhì)量濃度為0.816 μg/μL的2-甲基-3-庚酮為內(nèi)標(biāo)物，即通過內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度和峰面積與未知物峰面積比值計算，見式(2)[16]：

(2)

式(2)中，f表示相應(yīng)因子，A1、Ax分別代表內(nèi)標(biāo)物峰面積和未知物峰面積，ρ1、ρx分別代表內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度和未知物質(zhì)量濃度。

外標(biāo)定量方法的質(zhì)譜掃描條件為選擇離子監(jiān)測(selected ion monitor，SIM)模式[17]。以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)參照物2-甲基-3-庚酮質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)，SIM模式下目標(biāo)物與所對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物定量離子的峰面積比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到一次方程。對樣品同樣進(jìn)行SIM掃描，將峰面積代入方程得到對應(yīng)質(zhì)量濃度。

1.3.7香氣活性值的計算

精確定量的關(guān)鍵氣味化合物對應(yīng)的香氣活性值(odor activity value, OAV)可用來驗證氣味化合物對整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)大小，通常認(rèn)為，OAV>1代表該化合物可被嗅聞，該組分對香氣整體有貢獻(xiàn)作用，且該值越大代表其貢獻(xiàn)度越大。OAV計算見式(3)[17]：

(3)

式(3)中，ρi為待測組分的質(zhì)量濃度，OTi為該組分在水中的閾值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

表格制作由Microsoft Office Excel 2010軟件完成，采用IMB SPSS Statistics 26進(jìn)行單因素方差分析和顯著性分析，顯著性分析采用Duncan檢驗。

2 結(jié)果分析

2.1 氣味化合物定性分析結(jié)果

利用SPME和SAFE兩種方法結(jié)合，分別萃取鮮榨及熱處理西瓜汁的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，見表1、表2。從表1、表2可以看出，西瓜汁加熱前后的氣味化合物皆以醛類、醇類和酮類為主。

在鮮榨西瓜汁中共鑒定出44種氣味化合物，其中醛19種、醇9種、酮6種、酯3種、酸3種、其他物質(zhì)4種；感官小組嗅聞到15種氣味化合物，以不飽和C9醇、醛類為主，例如反,順-2,6-壬二烯醛、反,順-2,6-壬二烯醇、香葉基丙酮、異戊酸香葉酯等，這些物質(zhì)具有清香、黃瓜味、青草味、果香等令人愉悅的氣味。

根據(jù)FD因子結(jié)合嗅聞結(jié)果，初步判定鮮榨麒麟西瓜汁中的關(guān)鍵氣味成分可能為壬醛(清香、青草味)、反-2-壬烯醛(清香、黃瓜味)、反,順-2,6-壬二烯醛(清香、黃瓜味)、反,順-3,6-壬二烯醇(清香、黃瓜味)、反,順-2,6-壬二烯醇(清香、黃瓜味)、香葉基丙酮(花香、甜味)。

在加熱西瓜汁中共鑒定出50種氣味化合物，其中醛23種、醇11種、酮5種、呋喃類3種、芳香族物質(zhì)5種、其他物質(zhì)3種。

熱處理西瓜汁的蒸煮、刺鼻等不愉快的氣味是多種氣味化合物與西瓜基質(zhì)綜合作用的結(jié)果。通過加熱前后西瓜汁氣味化合物對比，正辛醛(清香、脂味)、反-2-庚烯醛(脂味、苦味)、1-癸醛(脂味、肥皂味)、1-壬醇(脂味、清香)、6-甲基-5-庚烯-2-酮(蘑菇味、霉味)、2-乙基呋喃(堅果味、泥土味)、以苯乙酮(苦杏仁味)為主的芳香族化合物、二乙基二硫醚(大蒜味)、順-6-壬烯醛(臭味、刺鼻味)等物質(zhì)的含量明顯增加，反-2-壬烯醛(清香、黃瓜味)、反,順-2,6-壬二烯醛(清香、黃瓜味)、反,順-2,6-壬二烯醇(清香、黃瓜味)、反,順-3,6-壬二烯醇(清香、黃瓜味)和香葉基丙酮(花香、甜味)等氣味化合物含量顯著降低。且根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，加熱后的西瓜汁中呈RI值為待測物實際保留指數(shù)，該值與譜庫RI值[18]相差不超過50；氣味特征為感官評價員嗅聞到的化合物氣味描述詞，未嗅聞到的化合物的氣味特征來自文獻(xiàn)報道。

表1 鮮榨西瓜汁中氣味化合物和稀釋結(jié)果

表2 熱處理西瓜汁中氣味化合物和稀釋結(jié)果

*表示西瓜汁加熱后含量顯著變化(P<0.05)；UD表示未被MS檢測到，且無法通過香氣屬性和RI值定性的化合物；RI值為待測物的實際保留指數(shù)，該值與譜庫RI值[18]相差不超過50；氣味特征為感官評價員嗅聞到的化合物氣味描述詞，未嗅聞到的化合物的氣味特征來自文獻(xiàn)報道。

果香、花香等的酯類物質(zhì)消失或含量明顯降低，低于檢出限。

根據(jù)FD因子結(jié)合嗅聞結(jié)果，初步判定加熱西瓜汁中的關(guān)鍵異味化合物可能為反-2-庚烯醛(脂味、苦味)、1-癸醛(脂味、肥皂味)、6-甲基-5-庚烯-2-酮(蘑菇味、霉味)、苯乙酮(苦杏仁味)、二乙基二硫醚(大蒜味)和順-6-壬烯醛(臭味、刺激味)。其中順-6-壬烯醛特征氣味為清新、黃瓜味，可能由于西瓜汁加熱后順-6-壬烯醛的含量增大，超過感官評價員鼻子的耐受值，呈現(xiàn)臭味、刺激味。

2.2 關(guān)鍵氣味化合物定量結(jié)果和OAV分析

某種氣味化合物對整體氣味的貢獻(xiàn)程度不完全取決于其含量，氣味閾值也起著很大的作用，因此某一化合物對整體氣味的貢獻(xiàn)度可以用OAV來衡量。從鮮榨西瓜汁和加熱西瓜汁中能夠嗅聞到的關(guān)鍵氣味化合物中選擇FD≥9，又能夠被質(zhì)譜檢測到的關(guān)鍵氣味成分，采用外標(biāo)法結(jié)合SIM模式提高質(zhì)譜靈敏度，進(jìn)行定量分析，結(jié)果見表3。其中相關(guān)系數(shù)R2>0.99，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合良好。

大多數(shù)情況下，F(xiàn)D因子和OAV基本呈對應(yīng)關(guān)系，即FD因子越高，OAV越大，該物質(zhì)活性越大，對西瓜汁整體氣味的貢獻(xiàn)越大，如反-2-壬烯醛、反,順-2,6-壬二烯醛和順-6-壬烯醛等(見表4)。但是也有一些例外，如己醛，F(xiàn)D因子為9，而OAV值卻小于1。造成這種結(jié)果的原因可能是氣味化合物與基質(zhì)的相互作用(協(xié)同或拮抗)。而且計算OAV的時候是假設(shè)每個化合物的含量與OAV間的關(guān)系是線性的[19]；但是，實際上氣味化合物的對數(shù)濃度和該物質(zhì)對整體氣味的貢獻(xiàn)作用不完全是線性關(guān)系，有的是S型的關(guān)系，且各化合物氣味強度的個體差異也不能忽視[17]。

表3 關(guān)鍵氣味化合物外標(biāo)定量結(jié)果

表4 關(guān)鍵氣味化合物的OAV

3 結(jié) 論

本研究針對熱處理對西瓜汁風(fēng)味的影響，綜合利用現(xiàn)代感官科學(xué)技術(shù)對比了熱處理前后西瓜汁氣味化合物的變化并鑒定出關(guān)鍵氣味化合物。熱處理導(dǎo)致西瓜汁的風(fēng)味改變，加熱前后西瓜汁的關(guān)鍵氣味化合物發(fā)生了變化，且差異顯著(P<0.05)。鮮榨西瓜汁中關(guān)鍵氣味化合物為壬醛(清香、青草味)、反-2-壬烯醛(清香、黃瓜味)、反,順-2,6-壬二烯醛(清香、黃瓜味)、反,順-3,6-壬二烯醇(清香、黃瓜味)、反,順-2,6-壬二烯醇(清香、黃瓜味)和香葉基丙酮(花香、甜味)。熱處理西瓜汁中關(guān)鍵氣味化合物為反-2-庚烯醛(脂味、苦味)、1-癸醛(脂味、肥皂味)、6-甲基-5-庚烯-2-酮(蘑菇味、霉味)、苯乙酮(苦杏仁味)、二乙基二硫醚(大蒜味)和順-6-壬烯醛(臭味、刺鼻味)。文章旨在為西瓜汁風(fēng)味的深入研究提供更多的信息。