GC-MS/MS-SRM 技術(shù)在檢測白酒中5種吡嗪類化合物的應(yīng)用研究

李正濤 ，孫 躍，孫海燕，錢 宇，趙金松，，黃志久，李 丹

（1.四川輕化工大學(xué)，四川宜賓 644000；2.瀘州老窖集團有限責(zé)任公司，四川瀘州 646000）

吡嗪是1,4 位含氮的六元雜環(huán)化合物，其衍生物廣泛存在于天然和發(fā)酵食品中，具有類似于炒堅果、烤肉的怡人香氣[1]，由于它們具有極低的風(fēng)味閾值，還對其他香味物質(zhì)有明顯的烘托作用，可使白酒的香氣更為豐滿，對白酒風(fēng)味有重要貢獻[2]。同時,吡嗪類物質(zhì)也是白酒中一類功能性化合物。有研究表明，吡嗪類化合物具有擴張血管、促進血循環(huán)、改善學(xué)習(xí)障礙、護肝等功能[3]，因此成為近年來白酒養(yǎng)生系列的一個研究熱點。目前，白酒中吡嗪類化合物的測定方法主要有頂空固相微萃取、液-液萃取等結(jié)合氣相色譜FID 檢測器、NPD 檢測器及質(zhì)譜的測定[4-5]，或者利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進行測定[6]。王莉等[7]建立了一種利用氣質(zhì)聯(lián)用的選擇離子模式進行分析，直接進樣定量白酒中4 種重要吡嗪化合物的方法。該方法直接進樣，簡單、便捷，但具有較高的檢出限，比較適合于檢測白酒中含量較高的幾種吡嗪，另外，雖然SIM 靈敏度和抗干擾力比SCAN 強，但是SIM 是單離子監(jiān)測，即只掃描一個離子，相比于SRM，分辨率低，抗背景干擾能力更弱。王柏文等[8]采用頂空固相微萃取結(jié)合GC/NPD 技術(shù)分析芝麻香型白酒中含氮化合物，結(jié)果定性檢測到10 種具有風(fēng)味特征的吡嗪類化合物。這種方法利用液液萃取對樣品進行了一定的濃縮，有效提高了儀器對吡嗪類物質(zhì)的檢出，但是整個前處理過程較為復(fù)雜，需要經(jīng)過多次樣品轉(zhuǎn)移，因此會使目標(biāo)化合物有一定的損失，影響定量的準(zhǔn)確性。氣相色譜－四級桿串聯(lián)質(zhì)譜是目前檢測機構(gòu)及白酒企業(yè)廣泛應(yīng)用的檢驗設(shè)備。

SRM(selected reaction monitoring)是基于質(zhì)譜的選擇反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)，對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行過濾，在母離子中選擇符合條件的母離子，進行破碎后形成子離子，在多個子離子中選出符合條件的子離子，經(jīng)過兩次的選擇，得到每個物質(zhì)的母離子和子離子對，有效去除了噪聲干擾，因此SRM 模式具有更高的檢測范圍和靈敏度，更適用于復(fù)雜樣品混合物的檢測，相對于傳統(tǒng)的質(zhì)譜技術(shù)更具優(yōu)勢[9]。現(xiàn)階段，SRM 模式在蛋白質(zhì)組學(xué)[9]、毒藥和藥品[10]、農(nóng)殘[11]、尿檢[12]等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，在白酒中應(yīng)用相對較少，相關(guān)文獻報道較少。本研究采用氣相串聯(lián)質(zhì)譜中的選擇反應(yīng)檢測掃描（SRM），建立了一種簡單、快速、經(jīng)濟的白酒中5種吡嗪化合物的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：市購的16 種成品酒，編號為C-1、C-2、C-3、C-4、C-5、C-6、C-7、C-8、C-9、C-10、C-11、C-12、C-13、C-14、C-15、C-16，見表1。

標(biāo)樣：2-甲基吡嗪（純度≥98%）、2,5-二甲基吡嗪（純度≥98%）購自北京百靈威科技有限公司；2,3,5-三甲基吡嗪（純度≥98%）、2,3-二乙基吡嗪（純度≥98%）購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；2,3,5,6-四甲基吡嗪購自南京化學(xué)試劑股份有限公司。

表1 采集樣品信息

試劑：色譜級乙醇購于ANPEL 公司。

吡嗪標(biāo)準(zhǔn)貯備液：分別稱取一定量的5 種標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.0001 g）,用60%vol 的乙醇溶解并定容，配制成濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

吡嗪混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液：根據(jù)相關(guān)學(xué)者對白酒中吡嗪類化合物的研究[5，13-15]，分別從吡嗪標(biāo)準(zhǔn)貯備液中取一定的量到100 mL 容量瓶中，用60%vol 的乙醇稀釋并定容，使2-甲基吡嗪濃度為1 mg/L，2,5-二甲基吡嗪和2,3-二乙基吡嗪濃度為2 mg/L，2,3,5-三甲基吡嗪濃度為4 mg/L，2,3,5,6-四甲基吡嗪濃度為10 mg/L。以此為標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度點，再逐級稀釋4 個梯度，即2-甲基吡嗪為0.0625 mg/L、0.125 mg/L、0.250 mg/L、0.500 mg/L 和1.000 mg/L；2,5-二甲基吡嗪和2,3-二乙基吡嗪為0.125 mg/L、0.250 mg/L、0.500 mg/L、1.000 mg/L 和2.000 mg/L；2,3,5-三甲基吡嗪為0.250mg/L、0.500mg/L、1.000mg/L、2.000 mg/L、4.000 mg/L；2,3,5,6-四甲基吡嗪為0.625 mg/L、1.250 mg/L、2.500 mg/L、5.000 mg/L 和10.000 mg/L。使用以上5個梯度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

儀器設(shè)備：氣相串聯(lián)質(zhì)譜儀（TRACE 1300-TSQ8000），自動進樣器（AI/AS 1310）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；色譜柱為HP-5（30 m×0.25 mm×0.25 μ m）：安捷倫科技有限公司；電子天平購自上海恒剛儀器儀表有限公司，高純氦氣（99.999%）、高純氬氣：南京特種氣體有限公司。

1.2 試驗方法

氣相色譜（GC）條件：起始溫度為50 ℃，保留1 min，以10 ℃/min的速率升至70 ℃，再以5 ℃/min的速率升至100 ℃，再以50 ℃/min 升至250 ℃；進樣口溫度為230 ℃，恒流模式，流速為1 mL/min，分離比為20∶1；進樣量為1 μL。

質(zhì)譜（MS）條件：電子轟擊離子源（EI），電子能量70 eV，傳輸線溫度260 ℃；離子源溫度280 ℃；溶劑延遲3 min，選擇反應(yīng)檢測掃描模式（SRM），離子掃描參數(shù)見表2。

表2 5種吡嗪化合物的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 進樣方式

本研究的樣品皆為市購成品白酒，在相關(guān)學(xué)者的大量研究中，對于白酒中吡嗪類化合物的檢測，較多使用了前處理，比如頂空固相微萃取[14]、液液萃取[15]、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮[16]等。各種前處理方法，雖然對白酒中風(fēng)味化合物有一定的濃縮作用，但是在前處理過程中，也會損失一部分目標(biāo)化合物，且耗費時間相對較長，部分前處理方式所使用的儀器價格也比較昂貴。在本研究中使用的SRM 模式，質(zhì)譜圖中只會出現(xiàn)目標(biāo)化合物，本研究中采用直接進樣的方式，相對于進行前處理，此方式操作簡單，經(jīng)濟實惠，也不需要使用有機試劑，既大大的縮短了時間，又使目標(biāo)化合物保留更充分，降低了目標(biāo)化合物的損失。

2.2 氣相串聯(lián)質(zhì)譜不同模式對比

使用同一個樣品分別進行SCAN 模式，SIM 模式和SRM 模式3 種不同質(zhì)譜模式檢測，其中從SCAN 模式的質(zhì)譜圖（圖1）可以看出，樣品的全掃描質(zhì)譜圖中，由于存在很多含量相對比較低的風(fēng)味物質(zhì)，圖形中含量比較低的物質(zhì)分離效果并不好,很多物質(zhì)的圖形是連在一起的,而且雜峰比較多，該種模式不太適合用于檢測含量比較低的風(fēng)味物質(zhì),通常全掃描模式用于定性分析。SIM 模式是選擇離子掃描模式，用該模式檢測樣品時，圖形中只會出現(xiàn)擁有事先輸入碎片離子的化合物峰，如圖2所示，圖形中雜峰相對于全掃描模式要少很多，雖然這種模式相對于全掃描模式有一定的選擇性，但是在這種模式下，仍然會出現(xiàn)一些含有特征離子的非目標(biāo)化合物峰，SIM 模式用于定量檢測微量化合物，必須要找出獨特的離子碎片，否則會出現(xiàn)一些干擾性雜峰，因此SIM 模式在專一性上存在一定的缺陷。SRM 模式是選擇反應(yīng)監(jiān)測模式（圖3），從圖3 可看出，圖形中只有目標(biāo)化合物峰，沒有其他雜峰，在這種模式下，無論目標(biāo)化合物的含量是相對比較低還是較高，圖形中只會出現(xiàn)目標(biāo)化合物，選擇性非常高，而且在目標(biāo)峰能夠分離的情況下，該種模式可以盡可能的縮短檢測時間，有利于建立一種快速檢測方法，適合于微量化合物的定量檢測分析。綜上所述，SRM 模式相對于另外兩種模式,具有更強的抗噪音干擾能力,更強的靈敏度,更高的準(zhǔn)確性,因此本研究采用選擇反應(yīng)檢測掃描模式（SRM模式）對樣品進行定量分析檢測。

2.3 質(zhì)譜SRM的優(yōu)化

使用直接進樣分析目標(biāo)化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，對5 種吡嗪類化合物進行質(zhì)譜全掃描分析。首先根據(jù)總離子圖確定5 種吡嗪化合物的出峰時間，在SRM 優(yōu)化過程中，5 種吡嗪化合物進入一級質(zhì)譜后，通過每種化合物的出峰時間找出對應(yīng)化合物，確定其對應(yīng)母離子，母離子進入二級質(zhì)譜，對過濾后的母離子進行碎裂，確定母離子對應(yīng)的最優(yōu)子離子；母離子與子離子對確定后，對化合物母離子逐一施加一定步長的碰撞能量（CE），確定母離子與子離子對的最佳碰撞能（EC）。每個目標(biāo)化合物選取2 對最具特征且響應(yīng)最高的SRM 離子及相應(yīng)的儀器參數(shù)作為最終的質(zhì)譜采集參數(shù)（見表2）。

表3 5種吡嗪類化合物的保留時間、線性回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度及檢測限

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別按照上述條件進行檢測分析，得到5 種吡嗪類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程，其線性回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表3。在酒精濃度為60%vol 的乙醇水溶液中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使5 種吡嗪類標(biāo)樣濃度均為50 μg/L，在相同的條件下連續(xù)檢測6 次，以信噪比S/N=3 確定方法檢出限（limit of detection，LOD）[14]；根據(jù)5種吡嗪在白酒中含量不同,酒樣中加入不同濃度的吡嗪標(biāo)液進行加標(biāo)回收率試驗,其中2-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪分別添加0.125 mg/L、0.5 mg/L、1.25 mg/L；2,5-二甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪分別添加0.25 mg/L，每個添加水平分別做6 個平行樣品，利用6 個平行樣品的實驗數(shù)據(jù)計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），即為該方法的精密度，結(jié)果見表3。

由表3 可知，5 種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)都在0.99以上。由表4可知，回收率在98.52%～103.46%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.28%～3.14%，方法檢出限（LOD，S/N＝3）在10～14 μg/L，樣品的加標(biāo)回收率較高，說明本方法在檢測過程中，目標(biāo)物質(zhì)損失較少；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值較低，精確度高；具有較低的方法檢出限，滿足白酒中吡嗪類痕量物質(zhì)檢測的實驗要求。

表4 回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差及檢出限

2.5 樣品分析

按照試驗方法定量分析16 種市購成品白酒,其5 種吡嗪類化合物的含量如表5。由表5 可知，在這16 種酒樣中，都檢測出了這5 種吡嗪類化合物，每種酒樣的四甲基吡嗪含量都要明顯高于其他4 種吡嗪類化合物，說明在這5 種吡嗪類化合物中，四甲基吡嗪可能占據(jù)著主導(dǎo)地位；醬香型白酒中，僅次于四甲基吡嗪含量的是2,3,5-三甲基吡嗪；然而在濃香型、兼香型和芝麻香型白酒中，僅次于四甲基吡嗪的含量為2,3-二乙基吡嗪，居于第二位；除醬香型外，另外3種香型白酒中，2-甲基吡嗪在5種吡嗪中含量最低。從檢測的所有樣品來看，對于這5 種吡嗪類化合物的總含量，醬香型白酒中含量最高，其次分別是芝麻香型、兼香型、濃香型；這也符合范文來等[17]在文獻中提到的醬香型白酒中吡嗪類化合物含量最高的說法。

表5 白酒中5種吡嗪類化合物的含量 (mg/L)

3 結(jié)論

通過優(yōu)化實驗條件,采取選擇反應(yīng)監(jiān)測模式(SRM 模式)，建立了一種氣相色譜四級桿串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)快速定量方法，可在12 min 內(nèi)完成白酒中5 種吡嗪類化合物的定量分析,該方法采用直接進樣的方式，既節(jié)約了前處理所需時間,也減少了目標(biāo)物在前處理過程中的損失，更加適用于企業(yè)的定量分析。在該方法條件下，5 種吡嗪類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)都具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.9904～0.9994，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.28%～3.14%，方法檢出限在10～14 μg/L，加標(biāo)回收率在98.52%～103.46%,線性關(guān)系、精密度、檢出限和加標(biāo)回收率均滿足白酒中吡嗪類痕量物質(zhì)檢測的實驗要求。

本實驗結(jié)果顯示，在醬香型白酒中，5種吡嗪的總含量最高，可達20.15 mg/L，濃香型白酒最高可達3.66 mg/L；在所有白酒樣品中，5 種吡嗪類化合物中四甲基吡嗪含量最高，其中醬香型白酒中最高可達11.67 mg/L。由于中國白酒的香型工藝種類繁多，白酒的風(fēng)格特點也各不相同，還需要進一步加大研究的范圍，并進行定量檢測。