G SK126通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控牙周膜干細(xì)胞成骨分化能力

郭靈巧 來國芹 王瀟軼

牙周炎可導(dǎo)致牙周支持組織進(jìn)行性破壞，是引起牙列缺損的主要原因之一[1]。牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）是分布于牙周組織的一種成體干細(xì)胞，具有較強(qiáng)體外增殖能力及向成骨、成軟骨和成脂等多向分化的生物學(xué)特性，是組織工程重要的干細(xì)胞來源，它的發(fā)現(xiàn)為牙周病的治療提供了新的方法和思路[2，3]。在牙周病的臨床治療過程中，恢復(fù)牙周骨質(zhì)缺損是牙周病治療的重要內(nèi)容，而 PDLSCs 在牙周組織再生及骨質(zhì)缺損修復(fù)中發(fā)揮重要作用[3，4]。因此，深入研究PDLSCs成骨向分化的調(diào)控機(jī)制對(duì)PDLSCs 的組織工程應(yīng)用發(fā)揮重要作用。

EZH2 作為 H3K27me3 的特異性甲基化酶，可通過催化H3K27me3，招募DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）、去乙酰化酶（HDAC）等蛋白，使靶基因啟動(dòng)子發(fā)生甲基化，進(jìn)而介導(dǎo)蛋白復(fù)合物轉(zhuǎn)錄抑制，對(duì)維持干細(xì)胞特性，抑制干細(xì)胞衰老具有重要作用[5]。EZH2 可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）體外脂肪生成，抑制體內(nèi)外成骨分化潛能；相反，抑制 EZH2酶活性和抑制 EZH2 基因表達(dá)可抑制 BMSCs 成脂向分化，促進(jìn)成骨分化[6，7]。近年來，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在調(diào)控牙源性干細(xì)胞分化的重要作用得到越來越多的認(rèn)可，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活可促進(jìn)牙源性干細(xì)胞成骨向分化[8，9]。研究顯示，EZH2 可通過直接招募 β-catenin 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的方式激活 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路進(jìn)而增強(qiáng) Wnt 通路靶基因轉(zhuǎn)錄活性[8，10]。然而新型 EZH2 抑制劑 GSK126是否影響 PDLSCs 的成骨分化及其作用機(jī)制尚不明確。本研究將通過探索 GSK126 對(duì) PDLSCs 成骨向分化能力的影響及其機(jī)制，以期為 PDLSCs 在牙周組織再生中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

資料和方法

1.實(shí)驗(yàn)材料青霉素、鏈霉素、胎牛血清（Gibco，美國）；胰蛋白酶、α-MEM 培養(yǎng)基（Hyclone，美國）；顯微鏡（Olympus，日本）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Heraeus，德國）；低溫高速離心機(jī)（Eppendorf，德國），H3K27me3、β-catenin 抗體（Abcam，美國）；RUNX2、ALP、OCN、EZH2 及β-actin引物（上海生工，中國），Ⅰ型膠原酶、地塞米松、維生素 C、β-甘油磷酸鈉（Sigma，美國），SYBR Green 試劑盒（Takara，日本）。

2.細(xì)胞培養(yǎng)及礦化誘導(dǎo)收集 18～25 歲臨床志愿者即刻拔除的前磨牙或第三磨牙，要求健康完整、無齲壞。在超凈臺(tái)內(nèi)用手術(shù)刀片分離出牙周膜組織，PBS 清洗 3 遍，加入 4mg/L I 型膠原酶消化 40min，用含 20%胎牛血清的 α-MEM 培養(yǎng)液終止消化，培養(yǎng)基重懸后將組織塊接種于培養(yǎng)皿中，于二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每兩天更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞從組織塊周圍爬出并長至 80%融合率時(shí)，采用有限稀釋法純化細(xì)胞單克隆株，擴(kuò)大培養(yǎng)后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

取狀態(tài)良好的 P3 代牙周膜干細(xì)胞以 1×105個(gè)/ 孔的接種于培養(yǎng)板中，分為礦化誘導(dǎo)組和空白對(duì)照組組，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到 80%以上的匯合率；更換成骨誘導(dǎo)液 （10%FBS，10nmol/L 地塞米松、50mg/L 維生素 C 和 10mmol/L β- 甘油磷酸鈉）進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，誘導(dǎo) 1-3周后進(jìn)行通過 qRCR 檢測 EZH2 及成骨相關(guān)基因表達(dá)。

3.實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（q-RCR）實(shí)驗(yàn)將處于對(duì)數(shù)生長期的 P3 代 PDLSCs 消化后接種于培養(yǎng)板中，分 為 GSK126組和對(duì)照組（Con），GSK126+XAV939 組，成骨誘導(dǎo)后提取細(xì)胞的總 RNA，按照Prime ScriptTMRT reagent Kit（Takara 生物技術(shù)公司）說明書逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，儲(chǔ)存于 -20℃條件下備用。

q-PCR 反應(yīng)根據(jù)SYBR ? Premix Ex TaqTM（Takara 生物技術(shù)公司）說明書操作，RUNX2 上游引物 為 ：5’-GGGTAAGACTGGTCATAGGACC-3’，下游引物為：5’-CCCAGTATGAGAGTAGGTGTCC-3’；OCN 上游引物為：5’-GCCGAGGTGATAGTGTGGTT-3’，下游引物為：5’-ACTCCTCGCTTTCCATGTGT-3’；，ALP 上游 引 物為 ：5’-CCCACCTCAGGCTA -TGCTA-3’，下 游引物為：5’-CACTGGGCAGACAGTCAGAA-3’；內(nèi)參β-actin上游引物為：5’-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3’，下游引物為：5’-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3’。

4.Western blot 實(shí)驗(yàn)用 RIPA 裂解液提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的總蛋白，制備 10%SDS-PAGE 凝膠，經(jīng)電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉后，加入兔抗人H3K27me3、β-catenin（1：1000 稀釋）、β-actin（1∶10000 稀釋）抗體，于 4℃冰箱孵育過夜。TBST 洗滌3 次，每次十分鐘，加入抗兔二抗室溫孵育 1h；使用ECL 化學(xué)發(fā)光。采用 Image J 軟件分析條帶灰度值。

5.茜素紅實(shí)驗(yàn)取生長狀態(tài)良好 P3 代 PDLSCs以 1×105個(gè) / 孔的接種于 6 孔培養(yǎng)板中，分為空白對(duì)照組（Con）、GSK126 組和 GSK126+XAV939 組，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到 80%以上的匯合率，更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（10%FBS，50mg/L維生素C和10mmol/Lβ-甘 油磷酸鈉、10nmol/L 地塞米松），誘導(dǎo) 2周后進(jìn)行茜素紅染色：PBS 輕輕漂洗細(xì)胞 3 次，4%的多聚甲醛固定細(xì)胞 30min；PBS 漂洗細(xì)胞 3 次，茜素紅染液染色20min；PBS 輕輕洗去殘留的染液，倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄礦化結(jié)節(jié)的形成情況。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用 SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用 t 檢驗(yàn)或單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.牙周膜干細(xì)胞成骨分化前后EZH2 和H3K27me3 的表達(dá)：qPCR 檢測牙周膜干細(xì)胞成骨分化前后 EZH2 和成骨相關(guān)基因 mRNA 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，牙周膜干細(xì)胞誘導(dǎo)分化1～3周后 OCN、ALP、Runx2 的表達(dá)水平明顯升高（圖1A），而 EZH2 的表達(dá)水平顯著下調(diào)（圖 1B），Western blot 顯示牙周膜干細(xì)胞誘導(dǎo)分化 1～3周后H3K27me3 蛋白的表達(dá)水平明顯降低（圖1C，D），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.GSK126 調(diào)控牙周膜干細(xì)胞的成骨分化能力q-PCR 檢測 GSK126 對(duì)牙周膜干細(xì)胞成骨分化的影響，結(jié)果顯示 GSK126 組中的成骨基因表達(dá)顯著上調(diào)，而 EZH2 的表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖 2A，B）。茜素紅染色結(jié)果顯示 GSK126組中礦化結(jié)節(jié)比對(duì)照組明顯較多；而 Western blot結(jié)果顯示 GSK126 組中 H3K27me3 蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖 2C，D）。

圖1 牙周膜干細(xì)胞分化前后 EZH2、H3K27me3 及成骨基因的表達(dá)

圖2 GSK126 通過抑制 H3K27me3 促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞成骨分化（ ×10）

2.3 XAV939 逆轉(zhuǎn) GSK126 對(duì)牙周膜干細(xì)胞成骨向分化的促進(jìn)作用為進(jìn)一步探索GSK126 調(diào) 控PDLSCs 成骨向分化的分子機(jī)制，在 GSK126 組加入Wnt/β-catenin 信號(hào)通路阻斷劑（XAV939），分析其對(duì)牙周膜干細(xì)胞的成骨分化能力的影響。結(jié)果顯示，GSK126 組 PDLSCs 中的 β-catenin 水平顯著提高，而 XAV939 能逆轉(zhuǎn) β-catenin 的上調(diào)（圖3C，D）。茜素紅染色及 q-PCR 檢測結(jié)果顯示，XAV939 可逆轉(zhuǎn)GSK126 對(duì) PDLSCs 成骨分化能力的促進(jìn)作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）（圖 3A，B）。結(jié)果說明GSK126 通過 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路調(diào)控 PDLSCs成骨向分化。

討 論

表觀遺傳是指在基因的核苷酸序列（DNA）不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)在親代和子代間發(fā)生可遺傳的變化。表觀遺傳調(diào)控在生命過程中的重要作用已被越來越多的國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。H3K27me3 組蛋白甲基化修飾是組蛋白 H3 亞基最穩(wěn)定的表觀修飾標(biāo)記之一，修飾位點(diǎn)主要位于靶基因啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近，廣泛參與胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化等過程[11]。H3K27me3 作為抑制性組蛋白修飾，通過改變核小體結(jié)構(gòu)、緊縮染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，使基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)無法與轉(zhuǎn)錄酶 RNA Pol Ⅱ結(jié)合，從而抑制基因的表達(dá)[7，12]。EZH2 是 H3K27me3 特異性組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶，可將甲基基團(tuán)（-CH3）轉(zhuǎn)移到組蛋白 H3 的27 位賴氨酸殘基上，抑制靶基因轉(zhuǎn)錄活性[13]。研究顯示，EZH2 靶向調(diào)控 MX1、FHL1 及 Runx2 抑制間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[14]。然而，EZH2 及H3K27me3 在牙周膜干細(xì)胞成骨分化中的作用仍不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)牙周膜干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)后 1～3周 EZH2 及 H3K27me3 的表達(dá)顯著下調(diào)，與成骨基因 Runx2、ALP 和 OCN 的表達(dá)相反。為了進(jìn)一步探索 EZH2 及 H3K27me3 對(duì)牙周膜干細(xì)胞成骨分化能力的影響及其分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)在牙周膜干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化過程中加入 EZH2 新型小分子抑制劑GSK126，結(jié)果顯示 GSK126 可顯著抑制EZH2 及H3K27me3 的表達(dá)，而明顯促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞成骨基因的表達(dá)和鈣化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生，說明 GSK126 可促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的成骨向分化能力。

Wnt/β-catenin 信號(hào)通路是廣泛存在于生物體內(nèi)高度保守的信號(hào)通路，在胚胎發(fā)育和維持組織細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)等生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。研究顯示，正畸牙移動(dòng)過程中可激活牙周膜干細(xì)胞中的Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控牙槽骨改建[15]。在牙周膜干細(xì)胞中抑制 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的表達(dá)可顯著抑制牙周膜干細(xì)胞成骨向分化[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)檢測 GSK126 作用下 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的表達(dá)，結(jié)果顯示加入 GSK126 后β-catenin 的表達(dá)顯著上調(diào)，說明 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路可能參與了 GSK126 調(diào)控牙周膜干細(xì)胞的成骨向分化。為進(jìn)一步探索 GSK126 調(diào)控牙周膜干細(xì)胞的分子機(jī)制，我們?cè)?PDLSCs 成骨誘導(dǎo)液中同時(shí)加入 GSK126和 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路抑制劑 XAV939，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 XAV939 可明顯逆轉(zhuǎn) GSK126 對(duì)牙周膜干細(xì)胞成骨分化能力的促進(jìn)作用。

綜上，我們通過在牙周膜干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)液加入 EZH2 特異性抑制劑 GSK126，確定了 GSK126 對(duì)PDLSCs 成骨分化能力的促進(jìn)作用，進(jìn)一步探索了Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在GSK126調(diào)控PDLSCs成骨分化中的作用。研究結(jié)果顯示，GSK126 可通過Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的成骨分化能力，提示新型小分子化合物 GSK126 在牙周組織損傷修復(fù)過程中可發(fā)揮重要作用。